Name: 一种荧光活体成像方法研究小鼠骨细胞中负荷诱导的钙信号动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 了解双光子显微镜活体成像技术用于研究小鼠骨细胞机械负荷诱导的钙信号动力学。该方法保留骨细胞天然三维空间排列和生理环境，为骨力学生物学研究提供实时观测手段。

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无。

所有方法均已获得康奈尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 材料与仪器的准备
<ol>
	<li>设计并构建用于倒置多光子显微镜的跖骨加载装置。 
	注：组件规格和设备操作的详细信息见之前研究的补充文档25主要组件包括一个与力传感器和加载支架串联的驱动器、一个水浴装置以及一个支点销。驱动器和力传感器可从商业途径获得，应能够承受最高300 g的载荷。水浴装置、支点销和加载支架应由钛或不锈钢制成，可自行加工或通过商业途径获取。 通过 3D金属打印</li>
	<li>针对每组小鼠（即性别、处理方式、基因型）预先将应变大小数值校准至驱动器位移。此步骤通过表面应变映射完成，具体操作流程见先前研究。25.</li>
	<li>使用16至18周龄、骨细胞中表达荧光钙指示剂构建体的C57BL/6背景小鼠。通过将flox激活型GCaMP6f小鼠与Dmp1-Cre小鼠杂交，实现骨细胞靶向表达。创始小鼠的繁育策略及供应商信息详见先前发表的研究。25.</li>
	<li>使用高压灭菌器（57.2 °C，15 psi，3–4 分钟）对所有手术器械、支架、水浴装置和支点针进行灭菌。用100%乙醇对显微镜物镜进行消毒。</li>
	<li>打开电子组件，包括激光源、显微镜、载荷传感器和驱动器。每个组件在活体成像前需预热15至20分钟。
	<ol>
		<li>确保执行器和载荷传感器组件已连接并激活控制装置。根据用户偏好，使用多种平台（包括 Matlab、LabView 和 Python）生成控制软件。本研究中使用的主要 Matlab 代码称为 带载荷传感器的执行器控制软件.m （在内部的 MT3 加载装置控制软件.zip 文件夹 补充文件 1). 
		&#8203;注意：大多数市售的双光子显微镜系统均配备有功能完善的成像软件。本方法所需的关键功能包括：能够将激光器调节至适合GCaMP6f的激发波长（920 nm），具备调节激光功率强度的能力，以及能够以至少6 Hz的频率采集时间序列图像。在实验开始前，应确认激光器已正确连接至成像软件，并且双光子成像所需的光路配置已妥善设置。具体确认方式因成像系统的配置而异，通常可通过光路指示灯进行确认。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 手术
<ol>
	<li>准备手术台，并用70%乙醇对表面进行消毒。确保在整个手术过程中采用无菌技术。由于本方案为终末性操作，需维持相应的清洁水平。&#160;</li>
	<li>使用与医用级空气或氧气混合的气化异氟烷（流速为1 L/min）对小鼠进行麻醉。初始麻醉在啮齿类动物诱导舱中进行，异氟烷浓度为3%-5%。在手术及活体成像过程中，通过鼻罩维持1%-2.5%的异氟烷浓度以保持麻醉状态。</li>
	<li>将加热装置置于小鼠下方或侧边，以帮助维持稳态的核心体温。在整个手术过程中监测小鼠的体温、心率和血氧饱和度。保持呼吸频率在每分钟60-80次，并通过调节异氟烷剂量维持该范围。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位。在切口前通过脚趾夹捏法确认麻醉深度。确定第二和第三跖骨之间的位置。从远端开始，沿骨骼长度方向（约5 mm）在第二与第三跖骨之间的真皮层做手术刀切口。 
	注意：跖骨位于足部踝骨的远端，紧邻远节指骨的近端。由内侧至外侧依次为跖骨I、II、III、IV和V。第三跖骨位于后足掌侧中部。</li>
	<li>使用镊子将皮肤向内侧/外侧边缘牵拉，打开手术区域。使用直头Vannas剪刀切除伸肌腱，以暴露第三跖骨。</li>
	<li>将跖骨加载装置的中心支点针插入第三跖骨下方。
	<ol>
		<li>首先将针插入第三跖骨与近节趾骨连接处的远端狭小间隙，然后将针向近端推进，直至其位于第三跖骨骨干中段。</li>
		<li>需特别注意确保骨与针之间直接接触，避免任何肌肉和筋膜介入。这对于加载过程中实现稳定成像至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子固定踝关节，将足部放入盛有8-10 mL Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）的水浴中。使用加载支架固定足部，并将支架连接至作动器/载荷传感器装置。完整的手术准备及装置内的布置如图1所示。</li>
</ol>
3. 成像
注意：本方案中使用的完整双光子显微镜系统包含两个软件：用于激光器的 Chameleon Discovery GUI V2.0.6（图2）和用于显微镜的 ThorImageLS4.0（图3）。要进行双光子成像，请点击 实时成像（图3，蓝色播放按钮）。在进行实验并需要成像和保存数据时，请点击 采集（图3，顶部选项卡，位于 Capture Setup 旁边）。这些软件与本实验所用设备及供应商特定相关，但任何具备本方案中所述必要参数（激发波长、可视窗口尺寸、图像采集速率等）的替代系统同样适用。
<ol>
	<li>非常小心地用鼠标拾取加载装置，并将其放置在显微镜平台上。</li>
	<li>在落射荧光模式下，首先使用低倍物镜（图3，顶部下拉菜单中的选项为多光子或荧光设置），定位并居中骨骼的骨干中段。</li>
	<li>找到感兴趣区域后，切换至更高倍数的水浸物镜（20x–40x），并将光学系统切换至双光子模式（图3，顶部下拉菜单中的选项为多光子或荧光设置）。 
	注意：建议的视野尺寸至少为 250 μm × 250 μm，以观察细胞活动，可通过光学或数字变焦实现，具体取决于成像系统。
	<ol>
		<li>合适的最小像素密度为 512 像素 × 512 像素。使用Galvo/Resonance Area Control设置（图3）来设定像素密度。</li>
		<li>在寻找感兴趣区域时，通过使用Power Control选项（图3）降低激光功率，并在Galvo/Resonance Scanner Control设置（图3）中提高光电倍增管（PMT）放大倍数，以避免光漂白。</li>
		<li>在双光子模式下，通过绿色通道（使用中心波长为 525 nm 的带通滤光片）观察纤维状骨外膜的自发荧光，以识别骨表面。 
		注意：激发波长为 1,000 nm 时，自发荧光最明显，但在 920 nm 激发下也可观察到（图3，多光子激光控制）。该标志对于在观察骨细胞时确定感兴趣区域相对于跖骨皮质的相对深度至关重要。需注意，在时间序列实验中，成像平面的确切深度并未被记录，尽管其通常在 15–30 µm 范围内。若需精确的深度测量，则必须进行 z 轴层扫成像（z-stack）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行一次测试性加载，以确保手术准备和在加载装置内的定位能够实现稳定的感兴趣区域成像（即无 z 轴平面位移）。简要地运行一个加载周期，以评估手术准备的稳定性。通过运行 Matlab 代码中的Switch on Servo and Move部分执行加载。
	<ol>
		<li>施加一个较小的预载荷。确保提前准备好适当的正弦波加载协议。输入在 1.2 节校准过程中获得的适当加载参数。通过运行 Matlab 代码中的Switch on Servo and Move部分执行加载。</li>
		<li>如果屏幕上观察到细胞发生可见移动，这可能是由于骨骼在加载或呼吸过程中产生微动所致，应沿 y 或 z 方向选择另一个感兴趣区域，以确保其正对中心支点销。如果移动持续存在，手动调整第三跖骨下方支点销的手术位置。 
		注意：一个良好的感兴趣区域（ROI）应是细胞不会进出成像平面/焦点的区域。x 和 y 方向的移动可在后期使用 ImageJ 中的模板匹配插件进行校正。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据实验设计，进行加载条件下的 z 轴层扫或时间序列成像，分别用于记录形态学参数或动态负载诱导的信号事件。
	<ol>
		<li>为荧光指示剂设置激发波长（例如，GCaMP6f 使用 920 nm）。对于 z 轴层扫，使用足够低的分辨率以捕捉骨细胞的特征，例如 0.25–1 μm 的步长。对于时间序列成像，设置采样频率至少为加载频率的 6 倍。对于 1 Hz 的加载频率，以每秒 6 帧（FPS）进行成像是最低合适的采集速率（图3，Galvo/Resonance Scanner Control）。</li>
		<li>在加载和活体成像过程中，每次加载周期均应采集未加载的基线数据。在本研究中，优先采用 60 秒未加载成像，随后进行 60 秒加载并同步成像。据此设计加载和成像方案。开始采集数据时，点击Capture（图3，顶部标签，位于Capture Setup旁边）。
		<ol>
			<li>骨细胞中完整钙信号反应的不应期估计约为 15 分钟28。在连续加载周期之间，采集动态信号数据时应至少等待该时长。</li>
			<li>在整个实验过程中，不得让动物无人看管，以确保其不会意外从麻醉中苏醒或在无干预机会的情况下出现痛苦。 
			注意：实验结束后应根据 IACUC 批准的方法，通过颈椎脱位或其他适当措施实施安乐死。&#160;本方案为非存活性实验，所有动物在成像后均被实施安乐死。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+response+in+osteocytic+networks+under+steady+and+oscillatory+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid.</a> Bone. 51 (3), 466-473 (2012).</li>
<li>Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+adhesion+mediates+network+responses+to+physiological+stimulation+of+the+osteocyte+cell+process%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).</li>
<li>Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+in+the+osteocyte+mechanical+environment%3A+A+fluid-structure+interaction+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+in+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach.</a> Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).</li>
<li>Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+fluid+flow+activation+of+gap+junction+hemichannels+induces+atp+release+from+MLO-Y4+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes.</a> Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).</li>
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<li>Kennedy, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+resorption+in+fatigue-loaded+bone+involves+both+apoptosis+and+active+pro-osteoclastogenic+signaling+by+distinct+osteocyte+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations.</a> Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).</li>
<li>Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+for+loading+induced+prostacyclin+and+prostaglandin+E2+release+from+osteoblasts+and+osteocytes+is+derived+from+the+activities+of+different+forms+of+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2.</a> Bone. 27 (2), 241-247 (2000).</li>
<li>David, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+formation+in+bovine+trabecular+bone+cultured+in+a+dynamic+3D+bioreactor+is+enhanced+by+compressive+mechanical+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).</li>
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<li>Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+mechanobiology+and+pericellular+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+properties+of+intracellular+calcium+signaling+in+osteocytic+and+osteoblastic+cell+networks+under+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid.</a> Bone. 53 (2), 531-540 (2013).</li>
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<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
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<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

由于骨细胞深陷于坚硬的组织基质中，一旦脱离这一微环境，便会迅速退化或去分化，因此其实验研究十分困难。在过去三十年中，骨细胞的研究依赖于大量创新性方法，例如构建类骨细胞系29,30,31建立分离原代骨细胞的实验方案32,33，甚至在安乐死后立即加载已解剖的骨骼以观察可能逐渐减弱的骨细胞的荧光反应16已有大量研究证实了骨细胞具有力学敏感性 通过 钙信号传导13,14,15,16.
<p class="jove_co...

骨基质根据力学需求进行排列1,2，并能够动态改变以适应变化的力学需求3,4,5。关于骨组织中力学感受机制的开创性研究约30年前以建模论文形式发表6,7,8，该研究提出，嵌于骨组织内的骨细胞通过其局部环境中液体的流动来感知组织层面的力学形变。via。该模型随后通过体外（in vitro）和离体（ex vivo）实验得到验证，明确表明骨细胞具有显著的力学敏感性1,2,3,4,5,6，并可表达细胞因子，调控成骨细胞的成骨行为7以及破骨细胞的活动8,9,10,11,12。
钙信号是一种普遍存在的第二信使，在骨细胞力学生物学中已被确立为核心角色和可靠的实验靶点13,14,15,16。钙信号的优势在于其在细胞生物学中已被广泛研究17，这意味着其下游效应以及可用于实验观察的相应荧光工具均已较为明确。体外分析已将钙信号作为识别骨细胞力学激活和表征动态信号行为的手段5,18,19。值得注意的是，对骨细胞系中钙信号的观察提供了确凿证据，表明细胞突起上整联蛋白附着点处的流体激活很可能是流体流动激活的主要形式20。该研究是众多展示钙信号实用性的研究之一。钙信号可在骨细胞力学激活下可靠地被诱导，因此是探究骨细胞力学生物学的一个有力靶点。
骨细胞力传导 体内 高度依赖于其直接的微环境。基质结合蛋白（如蛋白聚糖、整联蛋白）在骨细胞细胞膜之间形成功能性连接，这种结构对于细胞的流体激活至关重要21,22二维（2D） 体外 分析虽然具有帮助性，但其局限性在于未能整合这些关键的三维（3D）特征。 离体 利用共聚焦显微镜制备骨细胞钙信号的方法，揭示了骨细胞在保持周围基质完整的情况下如何作出响应13,16然而，去除骨骼的血液供应被认为会改变陷窝-管小系统中的营养物质和液体动力学。研究骨细胞的力学生物学需要 体内 负载诱导的骨细胞信号传导研究
由于传统成像技术（如明场显微镜和共聚焦显微镜）的局限性，对骨组织中嵌入细胞的体内研究在很大程度上受到阻碍。骨细胞位于由羟基磷灰石、I型胶原和其他非胶原蛋白组成的矿化基质23中，这种基质限制了光学通透性24，使得体内研究在技术上具有挑战性。然而，近年来非线性荧光成像技术和基因编码钙指示剂的发展为克服这些挑战提供了可能。
在此，我们报告一种能够对骨细胞进行成像的新型方法 体内 以细胞水平分辨率测量钙信号25通过在小鼠骨细胞中首次使用基因编码的钙指示剂作为动态荧光标记物实现。在DMP1-Cre驱动下，小鼠骨细胞特异性表达GCaMP6f，可在其跖骨骨干皮质中的骨细胞内观察到明显的荧光。17,26我们采用三点弯曲系统，以施加250–2,000 με范围内的生理应变水平。27该技术能够实现 体内 在整体骨机械负荷过程中可视化骨细胞钙信号动态变化，对任何希望深入了解骨细胞力学生物学的研究人员都具有重要价值。该方法适用于希望将其研究从原有领域拓展至骨细胞 mechanobiology 领域的研究人员。 体外 分析以 体内 应用，尤其是在保留基于功能的分子分析（即研究细胞活性）时 通过 钙信号传导），而非广泛的表型研究。

<table><tbody><tr><td>#3 手持手术刀</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72040-03</td><td>手术用品</td></tr><tr><td>20x 水浸物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>XLUMPLFLN20XW</td><td>这是一个20倍物镜，但本实验方案也可使用40倍物镜。我们推荐使用水浸物镜，因为在成像过程中需要将其浸入浴液中，而空气中物镜可能会引起像差。</td></tr><tr><td>A.M. Bickford Omnicon F/AIR</td><td>AM Bickford</td><td>80120</td><td>一种解决手术室麻醉气体问题的合理方案，F/AIR 麻醉气体过滤器专为清除手术室环境中的废气麻醉气体（如异氟烷、氟烷、安氟烷等）而设计。</td></tr><tr><td>A.M. Bickford Omnicon F/AIR 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>AM Bickford</td><td>80000</td><td>一套完整的套件，包含用于将 F/AIR 连接到装置的管路和接头</td></tr><tr><td>B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJ</td><td>杰克逊实验室</td><td>28865</td><td>用于与 Dmp1-Cre 小鼠杂交的 GCaMP6f 小鼠</td></tr><tr><td>B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJ</td><td>杰克逊实验室</td><td>23047</td><td>Dmp1-Cre 小鼠用于与 GCaMP6f 杂交繁殖&amp;nbsp; 小鼠</td></tr><tr><td>压力负荷传感器</td><td>FUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.</td><td>905898</td><td>LCM100，1000 克，微型拉力传感器 &amp;amp; 压缩负荷传感器（微型/直列螺纹式），符合 RoHS 无铅标准，材质 - 17-4 PH 不锈钢，M3×0.5 螺纹，34 AWG 4 芯编织聚酯电缆，5 英尺长</td></tr><tr><td>Corning 500 mL DPBS（Dulbecco 磷酸盐缓冲液），1x，含钙、镁</td><td>VWR International</td><td>21-030-CV</td><td>含有钙离子的等渗浴液在成像过程中浸没跖骨标本</td></tr><tr><td>牙科探针工具</td><td>电子显微镜科学公司</td><td></td><td>手术用品</td></tr><tr><td>乙醇，纯度200 proof，ACS级试剂 &gt;99.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SIAL-459844-500ML</td><td>灭菌目的</td></tr><tr><td>支点销</td><td>法瑟姆</td><td>N/A</td><td>采用直接3D激光烧结技术，由3D SolidWorks STL文件加工不锈钢（PH1合金）制成。原始制造商为GPI Prototype &amp;amp; 制造服务公司，现已被FATHOM收购，其规格详见先前发布的文件</td></tr><tr><td>高分辨率与高速 USB220 输出套件</td><td>FUTEK 先进传感器技术公司</td><td>717435</td><td>用于连接负荷传感器与笔记本电脑</td></tr><tr><td>ImageJ 1.53t，搭载 Java 1.8.0_172（适用于 Windows 64 位系统）</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>N/A</td><td>在此处安装 https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Critical Care</td><td>66794-013-25</td><td>100% 吸入用蒸汽液体</td></tr><tr><td>加载支架</td><td>法瑟姆</td><td>N/A</td><td>采用直接3D激光烧结技术，由3D SolidWorks STL文件加工不锈钢（PH1合金）制成。原始供应商为GPI Prototype &amp;amp; 制造服务公司（现已被FATHOM收购），规格详见先前发布的文件</td></tr><tr><td>MATLAB R2019a</td><td>MathWorks</td><td></td><td>用于运行加载装置</td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000 麻醉蒸发器加注异氟烷</td><td>Butler Schein 动物健康</td><td>14309</td><td>麻醉用蒸发器</td></tr><tr><td>Nonin 脉搏血氧仪型号 2500A Vet</td><td></td><td>2500A 兽用版</td><td></td></tr><tr><td>压电伺服控制器</td><td>PI-USA</td><td>E-625</td><td>公司建议与执行器配合使用的电子元件</td></tr><tr><td>PiezoMove 高刚性线性压电致动器</td><td>PI-USA</td><td>P-602.5SL</td><td>加载装置的执行器</td></tr><tr><td>10号刀片（适用于3号刀柄），每包100片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72044-10</td><td>手术用品</td></tr><tr><td>尖端细长的不锈钢镊子，长度：120 mm</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>78326-42</td><td>手术用品</td></tr><tr><td>Thorlabs Bergamo 多光子显微镜</td><td>ThorLabs</td><td>N/A</td><td>这仅是成像系统，不包含激光器，但ThorLabs提供可选的激光器配置</td></tr><tr><td>钛-蓝宝石Chameleon Discovery NX激光器，配备总功率控制（TPC）系统</td><td>相干的</td><td>N/A</td><td>该系统在技术上包含两台激光器，即一台可调激光器和一台固定激光器。然而，在本实验方案中仅需使用可调激光器。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vannas弹簧剪 - 4 mm 刃口</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>手术用品</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>法瑟姆</td><td>N/A</td><td>采用直接3D激光烧结技术，基于SolidWorks生成的3D STL文件，使用不锈钢（PH1合金）制造。原始制造商为GPI Prototype &amp;amp; 制造服务公司，现已被FATHOM收购，其规格详见先前发布的文件</td></tr></tbody></table>

一种用于研究小鼠骨细胞中负荷诱导的钙信号动态变化的荧光活体成像方法

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

骨组织对机械负荷强度的差异极为敏感。骨细胞是遍布骨组织内形成合胞体的树突状细胞，负责骨组织的机械感知功能。采用组织学、数学建模、细胞培养以及 离体 骨器官培养已极大地推动了对骨细胞力学生物学的理解。然而，骨细胞在分子水平上如何响应并编码力学信息这一基本问题 体内 尚不明确。骨细胞内钙离子浓度的波动为深入了解急性骨力学信号转导机制提供了一个有价值的切入点。本文报道了一种研究骨细胞力学生物学的方法 体内，结合一种在骨细胞中表达荧光遗传编码钙指示剂的小鼠品系与一种 体内 加载与成像系统，用于在加载过程中直接检测骨细胞内的钙离子水平。该系统采用三点弯曲装置，可对活体小鼠的第三跖骨施加明确定义的力学载荷，同时利用双光子显微镜实时监测由荧光标记指示的骨细胞钙离子响应。该技术实现了对 体内 观察骨细胞在整体骨加载下的钙信号事件，有助于揭示骨细胞力学生物学中的相关机制。

本文报道了一种用于研究嵌入性骨细胞中钙信号传导的方法学 体内 采用急性手术准备结合多光子荧光成像技术。可在骨细胞中观察到遗传编码钙指示剂产生的绿色荧光信号 通过 DMP1-Cre 表达 图4 是嵌入性骨细胞的单平面图像。注意所有细胞均被标记并表达基础水平的绿色荧光，便于筛选适合实验观察的候选细胞。细胞胞体清晰可见，有时还可分辨出细胞突起。根据我们的经验，骨衬细胞不表达由DMP1-Cre驱动的GCaMP6f构建体。骨细胞是骨基质中唯一嵌入的细胞类型，因此易于识别，并可与其他可能表达DMP1的细胞（如肌肉细胞）相区分。
该系统还可用于包埋细胞形态的三维分析。多光子系统可轻松实现Z轴层扫成像，利用双光子显微镜可在完全钙化的骨组织中获得深度达100 μm的图像堆栈。图5展示了一个典型的40 μm成像体积，该深度可常规实现。
可使用自行设计的加载装置施加循环载荷，从而实现实时观察动态...

本文介绍了一种活体成像方法，用于观察嵌入性骨细胞在机械刺激下诱导的钙信号传导 体内 实时响应小鼠第三跖骨的组织级机械负荷。

骨组织对机械负荷强度的差异极为敏感。骨细胞是遍布骨组织内部并形成合胞体的树突状细胞，……

本方案提供了一种在活体中观察嵌入性骨细胞的方法，代表了骨力学生物学研究领域的重要进展。该技术的主要优势在于能够在活体条件下观察骨细胞在细胞和分子水平上的事件，同时保持其天然的三维空间排列、血流以及内分泌环境，克服了体外细胞实验通常存在的局限性。该技术旨在用于小鼠模型的基础科学研究。目前尚未延伸至治疗或诊断应用，但为定义下一代骨科治疗策略提供了重要的研究契机。[旁白] 首先，在第二和第三跖骨之间的真皮层做一手术刀切口，从远端开始，沿骨的长度向近端推进。使用镊子将皮肤拉向内侧或外侧边缘，以打开手术区域。使用直头Vannas剪刀切除伸肌腱，暴露第三跖骨。将跖骨加载装置的中心支点针插入第三跖骨与近节趾骨相接处的远端小间隙中。然后将针向近端移动，直至其位于第三跖骨骨干中段。需特别注意确保骨与针之间直接接触，排除任何肌肉和筋膜的干扰。用镊子固定踝关节，将足部放入盛有DPBS的水浴中。使用加载支架固定足部，并将支架连接至作动器载荷传感器装置。小心拿起带有小鼠的加载装置，将其放置在显微镜平台上。首先使用落射荧光模式下的低倍物镜定位并居中骨的骨干中段。找到感兴趣区域后，切换至更高倍率的水浸物镜，并将光学系统切换至双光子模式。通过Galvo/Resonance区域控制设置调整像素密度。为避免光漂白，使用功率控制选项降低激光功率，并在Galvo/Resonance扫描控制设置中提高PMT放大倍数。在双光子模式下，通过绿色通道（使用中心波长为525纳米的带通滤光片）观察纤维性骨膜的自发荧光，以确定骨表面。若在加载过程中观察到骨的明显移动，应沿Y或Z方向选择另一个感兴趣区域，确保其正对中心支点针。若移动仍持续存在，需手动调整位于第三跖骨下方的支点针位置。根据实验设计进行加载条件下的Z轴层扫成像，以记录形态计量相关的信号事件，随后进行加载条件下的时间序列（T系列）成像，以记录动态载荷诱导的信号事件。此处展示的是体内表达GCaMp6f的跖骨骨细胞的单平面双光子图像。钙离子报告基因构建体的内源性表达提供了无需孵育步骤的荧光标记。本图展示了利用双光子显微镜在体内捕获的骨细胞三维Z轴投影图像。XY平面的横截面和矢状切面显示了Z轴层扫的深度。代表性图像展示了一个嵌入式骨细胞中GCaMp6f荧光信号的时间过程示例。在静息状态下，表现为低水平且带有噪声的波动；在加载时，钙波动的幅度和规律性增加，通常与施加的加载同步发生。该方法为研究人员回答有关活体中骨细胞力学生物学的功能性问题铺平了道路，而这些问题此前仅能在体外或离体条件下进行研究。

a-fluorescent-intravital-imaging-approach-to-study-load-induced

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

一种荧光活体成像方法研究小鼠骨细胞中负荷诱导的钙信号动力学

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体双光子钙成像技术是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。...

活体小鼠第2/3层双光子钙成像

可通过荧光Ca2+指示剂来监测库容性Ca2+内流（SOCE）的程度。利用Mn2+淬灭此类指示剂的方法，可检测培养细胞和骨骼肌纤维中的SOCE。本文还描述了一种通过共聚焦成像技术对机械去膜肌纤维进行成像，以实现SOCE时空分辨率分析的技术。...

基于荧光的活细胞内库控钙离子内流检测：从培养的癌细胞到骨骼肌纤维

来源： Heredia, D. J., et. al. 小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号的离体成像。J. Vis. Exp. (2018)...

转基因小鼠膈肌神经肌肉接头处钙动力学的荧光成像

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术通过荧光成像支持对细胞内钙库动态的分析。该方法基于将重组的羧酸酯酶靶向至内质网（ER），在内质网腔内增强合成的低亲和力Ca2+指示染料的局部去屏蔽效果。...

靶向酯酶诱导染料加载（TED）技术对内质网钙的直接成像

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca2+指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP3介导的局部Ca2+事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。...

培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

我们介绍了分离小鼠心肌细胞的方法，以及如何利用荧光光度法结合同时进行的数字细胞形态测量，同步获得动作电位或钙瞬变信号与肌节缩短信号。...

分离小鼠心室肌细胞的光学成像

我们介绍一种从腹侧暴露成年小鼠脑干的实验方案。通过使用梯度折射率透镜与微型显微镜，可利用钙成像技术在活体中检测下橄榄核神经元胞体的活动。...

in vivo 小鼠下橄榄核钙成像

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本方案描述了通过切断的神经将荧光钙染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。此外，还介绍了一种利用共聚焦显微镜记录外周神经末梢快速钙瞬变的独特方法。...

使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变

本研究概述了在骨细胞陷窝-管状网络（LCN）中可视化并构建骨细胞三维（3D）模型以进行计算流体动力学（CFD）分析的方法。通过该方法生成的模型有助于理解健康或病变骨骼中骨细胞的力学感知机制。...

骨细胞的分析与成像

了解双光子显微镜活体成像技术用于研究小鼠骨细胞机械负荷诱导的钙信号动力学。该方法保留骨细胞天然三维空间排列和生理环境，为骨力学生物学研究提供实时观测手段。

一种用于研究小鼠骨细胞中负荷诱导的钙信号动态变化的荧光活体成像方法

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