一种用于研究小鼠骨细胞中负荷诱导的钙信号动态变化的荧光活体成像方法

本方案提供了一种在活体中观察嵌入性骨细胞的方法，代表了骨力学生物学研究领域的重要进展。该技术的主要优势在于能够在活体条件下观察骨细胞在细胞和分子水平上的事件，同时保持其天然的三维空间排列、血流以及内分泌环境，克服了体外细胞实验通常存在的局限性。该技术旨在用于小鼠模型的基础科学研究。目前尚未延伸至治疗或诊断应用，但为定义下一代骨科治疗策略提供了重要的研究契机。

[旁白] 首先，在第二和第三跖骨之间的真皮层做一手术刀切口，从远端开始，沿骨的长度向近端推进。使用镊子将皮肤拉向内侧或外侧边缘，以打开手术区域。使用直头Vannas剪刀切除伸肌腱，暴露第三跖骨。将跖骨加载装置的中心支点针插入第三跖骨与近节趾骨相接处的远端小间隙中。然后将针向近端移动，直至其位于第三跖骨骨干中段。需特别注意确保骨与针之间直接接触，排除任何肌肉和筋膜的干扰。用镊子固定踝关节，将足部放入盛有DPBS的水浴中。使用加载支架固定足部，并将支架连接至作动器载荷传感器装置。小心拿起带有小鼠的加载装置，将其放置在显微镜平台上。首先使用落射荧光模式下的低倍物镜定位并居中骨的骨干中段。找到感兴趣区域后，切换至更高倍率的水浸物镜，并将光学系统切换至双光子模式。通过Galvo/Resonance区域控制设置调整像素密度。为避免光漂白，使用功率控制选项降低激光功率，并在Galvo/Resonance扫描控制设置中提高PMT放大倍数。在双光子模式下，通过绿色通道（使用中心波长为525纳米的带通滤光片）观察纤维性骨膜的自发荧光，以确定骨表面。若在加载过程中观察到骨的明显移动，应沿Y或Z方向选择另一个感兴趣区域，确保其正对中心支点针。若移动仍持续存在，需手动调整位于第三跖骨下方的支点针位置。根据实验设计进行加载条件下的Z轴层扫成像，以记录形态计量相关的信号事件，随后进行加载条件下的时间序列（T系列）成像，以记录动态载荷诱导的信号事件。此处展示的是体内表达GCaMp6f的跖骨骨细胞的单平面双光子图像。钙离子报告基因构建体的内源性表达提供了无需孵育步骤的荧光标记。本图展示了利用双光子显微镜在体内捕获的骨细胞三维Z轴投影图像。XY平面的横截面和矢状切面显示了Z轴层扫的深度。代表性图像展示了一个嵌入式骨细胞中GCaMp6f荧光信号的时间过程示例。在静息状态下，表现为低水平且带有噪声的波动；在加载时，钙波动的幅度和规律性增加，通常与施加的加载同步发生。

该方法为研究人员回答有关活体中骨细胞力学生物学的功能性问题铺平了道路，而这些问题此前仅能在体外或离体条件下进行研究。