Name: 设计生物反应器以改善工程心脏组织的数据采集和模型通量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 了解多组织生物反应器设计方法，利用稳定定位追踪器优化工程心脏组织功能表征的准确性。该技术为心血管疾病建模和药物筛选提供了高保真体外研究平台。

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作者感谢 Timothy Cashman 博士在此方法早期研究中的贡献。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号 R01-HL132226 和 K01 HL133424）以及勒杜克基金会国际卓越网络计划（CURE-PLaN）的资助。

K.D.C. 是 Novoheart 的联合创始人兼首席科学官，并持有其控股公司 Medera Biopharmaceutical 的股权。Novoheart 未参与本研究的资助、设计或实施；然而，本研究的结果可能对 Novoheart 和 Medera 产生财务影响。其他作者声明不存在竞争利益。

文献中已发表多种线性工程化心肌组织模型，其中一些模型如表1所述。部分模型涉及对组织收缩力的直接测量，但通常需要将构建物转移至独立的肌肉浴槽中进行38。大多数模型设计为将组织永久固定在两端，最常见的是固定在PDMS柱上1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,<sup c...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64368">Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues</a>. The title was corrected&#160;from:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64368">Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues</a>. The title was corrected.

Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

工程化心肌组织模型具有多种几何形状和构型，可用于模拟传统二维细胞培养难以实现的天然心肌微环境的各个方面。其中最常见的构型之一是线性组织条带，其两端带有柔性锚点，可诱导组织自组装，并为组织提供明确定义的预负荷以及相应收缩力的读出信号,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 
,22,23,24,25,26,27。所产生的力可通过光学追踪组织缩短过程，并结合弹性梁理论，利用测得的挠度和锚点的弹簧常数来计算得出1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 
21,22,25,26,28。
然而，心脏组织工程仍是一个不断发展的领域，尚存一些挑战。每种模型系统都需要专用设备，例如定制的生物反应器和功能评估装置10,29,30,31。由于实验流程繁琐、所需细胞数量多以及组织脆弱，这些构建物的微环境在尺寸和复杂性上常常受限于通量较低的问题。为应对这一挑战，一些研究团队转向制备仅包含数百至数千个细胞的微组织，以促进适用于药物发现的高通量检测。然而，这种缩小的尺度使得功能的准确评估更加复杂12，并消除了天然心脏微环境的关键特征（如营养物质/氧气扩散梯度和复杂的结构36），同时也限制了可用于后续分子和结构分析的材料量（通常需要将多个组织合并）。表1总结了文献中线性组织条模型的一些构型1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">组别</td>
			<td>每组织细胞数</td>
			<td>每板组织数</td>
			<td colspan="2">板型格式</td>
			<td colspan="2">锚定特征</td>
			<td colspan="2">功能数据采集方法</td>
			<td>共用培养基浴？</td>
			<td>原位功能测量？ 
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Yoshida (ECT)38</td>
			<td>400万</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">改良6孔板*</td>
			<td colspan="2">力传感器</td>
			<td colspan="2">直接测力</td>
			<td>否</td>
			<td>否</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Chan (hESC-CM-ECTs)26</td>
			<td>31万</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">定制6孔培养皿&#160;</td>
			<td colspan="2">PDMS柱</td>
			<td colspan="2">直接测力</td>
			<td>是</td>
			<td>否</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Feinberg (dyn-EHT)16</td>
			<td>150万</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">定制6孔培养皿&#160;</td>
			<td colspan="2">PDMS丝</td>
			<td colspan="2">组织形态</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">RADISIC (BioWire)39, 40</td>
			<td>11万</td>
			<td>8</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">聚合物丝</td>
			<td colspan="2">丝线形态</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Costa (单个hECT)1, 2</td>
			<td>100万–200万</td>
			<td>4**</td>
			<td colspan="2">10 cm培养皿**</td>
			<td colspan="2">PDMS柱</td>
			<td colspan="2">光学偏转（边缘/物体追踪）</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Costa (多hECT)3–9</td>
			<td>50万–100万</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6 cm培养皿</td>
			<td colspan="2">PDMS柱</td>
			<td colspan="2">光学偏转（边缘/物体追踪）</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Costa (带SPoT的多hECT)</td>
			<td>100万</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">6 cm培养皿</td>
			<td colspan="2">带黑色帽的PDMS柱</td>
			<td colspan="2">光学偏转（物体追踪）</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Passier (EHT)17</td>
			<td>24.5万</td>
			<td>36</td>
			<td colspan="2">12孔板</td>
			<td colspan="2">带黑色帽的PDMS柱</td>
			<td colspan="2">光学偏转（物体追踪）</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Vunjak-Novakovic13, 18</td>
			<td>100万</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">6 cm培养皿</td>
			<td colspan="2">带帽的PDMS柱</td>
			<td colspan="2">光学偏转（边缘检测）</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14</td>
			<td>55万</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">定制6孔培养皿&#160;</td>
			<td colspan="2">带帽的PDMS柱</td>
			<td colspan="2">光学偏转（物体追踪）；钙成像</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Eschenhagen (EHT)10, 19–21</td>
			<td>100万</td>
			<td>12</td>
			<td colspan="2">12孔板</td>
			<td colspan="2">带帽的PDMS柱</td>
			<td colspan="2">光学偏转（柱偏转的边缘检测）；钙成像</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Zandstra (CaMiRi)22</td>
			<td>2.5万–15万</td>
			<td>96</td>
			<td colspan="2">96孔板</td>
			<td colspan="2">带钩的PDMS柱</td>
			<td colspan="2">光学偏转（边缘检测）</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Murry23, 24</td>
			<td>90万</td>
			<td>24</td>
			<td colspan="2">24孔板</td>
			<td colspan="2">带帽的PDMS柱，集成磁体</td>
			<td colspan="2">磁传感器</td>
			<td>否</td>
			<td>是</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Reich (µTUG)11, 12, 25</td>
			<td>未定义</td>
			<td>156</td>
			<td colspan="2">156孔培养皿</td>
			<td colspan="2">带帽的PDMS柱，集成磁体</td>
			<td colspan="2">光学追踪（荧光微珠）</td>
			<td>是</td>
			<td>是</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：文献中部分线性工程化心肌组织模型的特征。线性工程化心肌组织模型在尺寸、通量、锚定结构设计、共用培养基浴的便利性，以及功能表征是否需要独立的肌肉浴系统方面存在差异。* 研究人员使用了一种基于标准6孔板尺寸的市售工程化组织系统。&#160;** 一种模块化系统，其中单个组织生物反应器可根据需要固定在任意塑料培养皿中的指定数量和位置。
本文介绍了我们已建立的线性人源工程化心肌组织（hECT）模型的最新制备方案1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27，以及评估hECT收缩功能的方法。每个可容纳多组织的生物反应器可在共用的培养基环境中同时培养最多六个hECT，其结构由两个固定在刚性聚砜框架上的硅基弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的&#34;支架&#34;部件组成。每个PDMS支架包含六个&#160;柔性的&#160;集成式测力柱，测力柱直径为0.5 mm，长度为3.25 mm；两个支架共同构成六对测力柱，每对用于固定一个hECT。将生物反应器倒置有助于克服因培养基水分冷凝或气液界面弯月面畸变而对从下方观察hECT造成的视觉干扰。hECT每次收缩均会引起末端集成测力柱的偏转，通过光学手段测量该偏转信号，并将其处理为力-时间曲线，以表征hECT的收缩功能1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27。与通常用于此类尺寸组织的单组织生物反应器相比，多组织设计提高了实验通量，并支持对具有潜在不同细胞组成的相邻组织之间的旁分泌信号进行研究。该系统已在已发表的研究中得到验证，相关应用包括疾病建模4,8、旁分泌信号研究6,7、异质细胞共培养5,9以及药物筛选7,9。
在此系统中，人工程化心肌组织（hECT）被设计为长约6 mm、直径约0.5 mm，以实现低噪声条件下对力测量的稳定光学追踪。此外，组织复杂性（如扩散梯度和细胞排列）与每块组织仅需100万个细胞的可操作性需求之间达到了平衡。利用标准的CCD相机技术，低至1 µN的力（对应小于5 µm的支柱偏转）即可产生清晰信号，从而确保即使是一些hECT疾病模型中观察到的极微弱收缩功能，也能被精确测量。该系统还支持对单次收缩力曲线进行详细分析，进而实现对多达16项收缩性指标的高通量分析41，包括主动收缩力、收缩速率（+dF/dt）、舒张速率（−dF/dt）以及搏动节律变异性。
本方案首先介绍生物反应器组件的制备方法。特别关注如何提高人工程化心脏组织（hECT）的产量、降低组织功能的技术变异性，以及优化组织评估的质量和深度。尽管组织制备和长期测试过程中的组织丢失是该领域公认的技术难题，并会降低研究的通量和效率，但大多数心脏组织工程研究并未报告组织丢失率27。本文所述的组织工程方法经过多年优化，可确保在大多数生物反应器中保留全部hECT（无论PDMS支架的制备方式如何）。然而，即使出现5%–20%的组织丢失，也可能显著影响统计效能，尤其是在细胞数量受限的小规模实验中（例如，某些疾病细胞系在分化过程中存在困难4，或商业化心肌细胞价格昂贵），或因处理条件受限（例如，各种处理化合物供应有限或成本较高）的情况下。
本方案描述了稳定型后部追踪器（SPoTs）的制备方法，这是PDMS支架的一种新特性，作为力传感微柱末端的帽状结构，用于固定人心外膜组织（hECTs）27。研究表明，这种帽状结构的几何形状显著减少了hECT从微柱上脱落或被拉脱的损失，从而为在不同刚度和张力条件下培养hECT提供了新的可能，而这些条件在无帽微柱上培养时具有挑战性。此外，SPoTs提供了一个高对比度的物体，其形状一致且定义明确，有助于提高对hECT收缩进行光学追踪的准确性27。随后，本文介绍了基于先前已发表方案的人诱导多能干细胞（iPSCs）的培养与心肌细胞分化方法3,42,43，以及hECT的制备、培养和功能检测的详细说明。
本文还强调了在生理温度下测量组织功能的重要性。人类心肌组织（包括胎儿期以及成年健康和病变组织）以及多种动物物种（包括大鼠、猫、小鼠、雪貂和兔）的心脏组织44,45在28 °C–32 °C时表现出与频率匹配的收缩力显著增强，相较于生理温度，这一现象被称为低温正性肌力效应45,46。然而，温度对工程化心肌组织功能的影响仍研究不足。目前文献中许多近期开发的工程化心脏组织模型被设计为在37 °C下进行功能评估，以模拟生理条件13,14,37。但据我们所知，工程化心脏组织收缩力的温度依赖性效应尚未得到系统研究。本方案描述了一种起搏电极设计，可在测试过程中最大限度减少热量散失，同时允许在实验装置中集成绝缘加热元件，从而在不破坏无菌条件的情况下将人源工程化心肌组织（hECTs）维持在生理温度27。随后，我们报告了温度对hECT功能的一些观察效应，包括收缩力、自发搏动频率、+dF/dt和−dF/dt的变化。总体而言，本文提供了制造该多组织力传感生物反应器系统的全部细节，可用于构建人源工程化心脏组织并评估其收缩功能，并提供了一组数据，为室温与37 °C下的测量结果比较奠定了基础27。

<table><tbody><tr><td>0.25 mm直径304不锈钢丝</td><td>McMaster Carr</td><td>6517K61&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿（20 mm 高）</td><td>康宁</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>德拉蒙德</td><td>6-000-010</td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS225-1</td><td>用无菌蒸馏水按1:10比例稀释</td></tr><tr><td>10X 改良伊格尔培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>20 - 200 &amp;mu;L 微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 微量移液器吸头</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>德拉蒙德</td><td>6-000-005</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>康宁</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6 瓦 LED 双蛇形管照明器</td><td>AmScope</td><td>&amp;nbsp;LED-6W&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>康宁</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>90度角反射镜</td><td>Edmund Optics</td><td>45-594</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸粘合胶</td><td>SCIGRIP</td><td>#4</td><td></td></tr><tr><td>可调节的10 cm x 10 cm千斤顶</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-673-50</td><td></td></tr><tr><td>铝合金6061</td><td>McMaster Carr</td><td>9008K82</td><td></td></tr><tr><td>A-Plan 10倍物镜</td><td>ZEISS</td><td>1020-863</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌袋</td><td>Propper</td><td>21002</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（不含胰岛素）</td><td>ThermoFisher</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>黑色ABS</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>2.85 mm 宽</td></tr><tr><td>牛I型胶原蛋白</td><td>Gibco</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>II 级生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>3430009</td><td></td></tr><tr><td>透明亚克力板</td><td>estreetplastics</td><td>1002502436</td><td>6.25 mm 厚</td></tr><tr><td>数控立式铣床</td><td>Haas</td><td>VF-1</td><td></td></tr><tr><td>导电石墨棒</td><td>McMaster Carr</td><td>1763T33</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12营养混合物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>用水稀释至70%</td></tr><tr><td>EVE全自动细胞计数仪</td><td>NanoEntek</td><td>E1000</td><td></td></tr><tr><td>EVE细胞计数板</td><td>NanoEntek</td><td>EVS-050</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>精细弯头镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II 水套式 CO2 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>3110</td><td>也称为 &quot;培养箱&quot;配备HEPA 100级过滤器</td></tr><tr><td>Fusion360 软件</td><td>Autodesk</td><td></td><td>也称为 &quot;CAD 软件&quot;</td></tr><tr><td>血细胞计数板（玻璃）</td><td>Reichert</td><td>1475</td><td>0.1 mm 深</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>hESC 验证合格的基质胶</td><td>康宁</td><td>354277</td><td>也称为 &quot;基底膜基质&quot;. 储存于冷冻分装样品中</td></tr><tr><td>高速CCD相机</td><td>PixelLINK</td><td>P7410</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>卡尔·蔡司工厂</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td>10倍相差物镜</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Selleck Chem</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>LabView 软件</td><td>国家仪器公司</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>层流洁净工作台</td><td>NuAire</td><td>NU-201-330</td><td>hECT功能分析所必需</td></tr><tr><td>笔记本电脑</td><td>华硕科技</td><td>雕属</td><td>英特尔酷睿 i&amp;amp; 处理器，CPU 2.8GHz，16GB RAM</td></tr><tr><td>激光切割机</td><td>尾声</td><td>Helix 24</td><td></td></tr><tr><td>放大头戴镜</td><td>ExcelBlades</td><td>70020</td><td>适用于需要精细操作的步骤</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>版本 2019b 或更高版本</td><td>也称为 &quot;数据分析软件&quot;</td></tr><tr><td>微型Vannas剪刀，3 mm刀片</td><td>WPI Instruments</td><td>501839</td><td></td></tr><tr><td>显微镜支架立柱</td><td>奥林巴斯</td><td>SZ2-STU1</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素储备液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>10,000 IU/ml 青霉素；10,000 &amp;mu;g/ml 链霉素</td></tr><tr><td>不含二价阳离子的磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td>用蒸馏水稀释至1X和10X浓度</td></tr><tr><td>移液控制器</td><td>德拉蒙德</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>PixelLINK Capture OEM</td><td>PixelLINK</td><td>10.2.1.6</td><td>也称为 &quot;相机软件&quot;</td></tr><tr><td>聚砜</td><td>McMaster Carr</td><td>86735K73</td><td>半透明琥珀色</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）</td><td>McMaster Carr</td><td>8545K176&amp;nbsp;</td><td>黑色，模制</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>干细胞技术</td><td>5872</td><td>也称为 &quot;iPSC 解离培养基&quot;</td></tr><tr><td>罗斯韦尔公园纪念研究所1640培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>硅胶片</td><td>SMI 制造</td><td></td><td>有光泽，厚度为 0.02 英寸，硬度计读数 40</td></tr><tr><td>10/0 尺寸蓝色、绿色、红色和黄色玻璃小珠</td><td>Michael's</td><td></td><td>颜色应能耐受高压灭菌</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373</td><td>用于混合PDMS</td></tr><tr><td>方波脉冲刺激器&amp;nbsp;</td><td>Astro-Med / Grass Technologies</td><td>S88X</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢剃刀片</td><td>GEM</td><td>62-0179-CTN</td><td>由于硬度较低，优先选择非不锈钢材料</td></tr><tr><td>Stemflex</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A3349401</td><td>也称为 &quot;iPSC 培养基&quot;</td></tr><tr><td>无菌蒸馏水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5230</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 170&amp;nbsp; 硅胶弹性体封装胶 黑色 0.9 kg 套件</td><td>道</td><td>DOWSIL 170 2LB 套件</td><td>又称黑色聚二甲基硅氧烷（黑色 PDMS）</td></tr><tr><td>Sylgard 184 - 硅酮弹性体透明 1 磅装套件</td><td>道</td><td>DC 184 SYLGARD 0.5公斤 1.1磅 套件</td><td>又称聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td></tr><tr><td>温控加热载物台</td><td>Okolab</td><td>H401-HG-SMU</td><td>设置高度为10 cm</td></tr><tr><td>热塑性3D打印机</td><td>Ultimaker</td><td>Ultimaker 3</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Selleck Chem</td><td>S1459</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>NanoEntek</td><td>EBT-001</td><td></td></tr><tr><td>真空室</td><td>Bel-Art 零件</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr><tr><td>可变速度迷你带锯</td><td>Micro-Mark</td><td>82203</td><td></td></tr><tr><td>可变速度微型钻床</td><td>Micro-Mark</td><td>82959</td><td></td></tr><tr><td>减振台</td><td>Labconco</td><td>3618000</td><td></td></tr><tr><td>称量舟</td><td>VWR</td><td>10803-140</td><td></td></tr><tr><td>Talon圆柱形台钳夹具</td><td>VWR</td><td>97035-528</td><td>AKA 螺丝夹</td></tr></tbody></table>

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

心力衰竭仍然是全球死亡的首要原因，迫切需要更优的人类心脏临床前模型。组织工程对基础科学领域的心脏研究至关重要； 体外 人类细胞培养消除了动物模型中存在的物种间差异，而更接近组织的三维环境（例如包含细胞外基质和异细胞耦联）可模拟 体内 与传统的塑料培养皿中的二维培养相比，这些条件在更大程度上模拟了体内环境。然而，每种模型系统都需要专用设备，例如定制设计的生物反应器和功能评估装置。此外，这些实验方案通常较为复杂、劳动密集，且常因组织体积小而脆弱导致实验失败。
本文介绍了一种利用诱导多能干细胞来源的心肌细胞构建稳定的人源工程心脏组织（hECT）模型系统的方法，用于长期监测组织功能。平行培养六个具有线性条带结构的hECT，每个hECT&#160;悬挂在一对连接于PDMS支架上的力传感聚二甲基硅氧烷（PDMS）支柱上。每个支柱顶端均装有一个黑色PDMS稳定支柱追踪器（SPoT），这一新特性显著提升了使用的便捷性、通量、组织保留能力及数据质量。该形状设计可实现对支柱偏转的可靠光学追踪，从而获得更精确的收缩力记录，并提供绝对的主动张力与被动张力数据。帽状结构设计消除了因hECTs从支柱滑脱而导致的组织失效问题；此外，由于SPoT是在PDMS支架制备完成后额外添加的步骤，因此可在不显著改变生物反应器制备流程的前提下，将其整合至现有的基于PDMS支柱的设计中。
该系统用于演示在生理温度下测量人工程化心肌组织（hECT）功能的重要性，并显示在数据采集过程中组织功能的稳定性。总之，我们描述了一种先进的模型系统，可重现关键的生理条件，从而提高用于体外（in vitro）应用的工程化心肌组织的生物保真度、效率和实验严谨性。

按照上述方案，我们课题组利用先前使用的一株健康人iPSC细胞系生成了心肌细胞9,15 在培养 8-61 天后制备成人心外膜组织。 图9A 显示从底部观察的hECTs代表性图像，分别在无SPoTs（上）和有SPoTs（下）条件下制备。功能测量在室温下进行（23 &#176;C）以及生理温度下（36 &#176;C在hECT构建后的37至52天之间。在PDMS支架的制备过程中，我们记录到经验丰富的操作者可获得80%的产率，即所有六个支柱均完整的PDMS支架；总体而言，至少五个支柱完整的PDMS支架产率可达95%（基于本实验室三位操作者的数据），其中 &#60;柱高存在 3% 的变异。
与难以牢固附着在PDMS微柱尖端的标记墨水所产生的碎片化形状相比，SPoT在数据采集过程中提供了一个单一且定义明确的跟踪形状（图9B 和补充视频S1</s...

利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外 在重现天然心脏微环境关键特征的同时，本文描述了一种利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞构建和分析高内涵工程化心脏组织的实验方案。

心力衰竭仍然是全球死亡的首要原因，迫切需要建立更优的人类心脏临床前模型。组织工程……

我们开发的三维干细胞来源人源心肌的体外模型，相较于传统二维细胞培养，显著提升了生物学保真度，同时避免了实验室动物实验中存在的种间差异。本研究采用的多组织生物反应器设计结合稳定的收缩后追踪系统，可最大化组织培养成功率，并提高对工程化心肌组织功能进行深入表征的准确性。鉴于心力衰竭仍是全球首要致死原因，我们构建的工程化心肌组织为研究人员提供了模拟人类心脏疾病以及筛选潜在治疗方法的有效平台。首先，将四个铝制阴性母模放置在模具架中，使柱孔与三角形搁板相对一侧的空隙对齐。将装置置于两个平行支架之间，并使用一块厚度为0.5毫米的矩形硅胶片作为垫圈夹紧两侧，以防止液态PDMS泄漏。在浅容器中，按1比10的比例混合0.5毫升PDMS固化剂与5毫升PDMS弹性体基质，充分搅拌五分钟。将PDMS混合物置于真空腔内，在强真空条件下脱气，直至气泡完全消失。接着，将PDMS混合物倒入浇铸装置中，过量填充以确保每个槽位均被完全覆盖。在PDMS支架主体上、与带柱一侧相对的位置加入少量彩色玻璃珠，用于每个支架的唯一标识。将浇铸装置水平放置于真空腔内，确保其处于水平状态，在强真空条件下至少放置12小时。将PDMS在无尘环境中于室温下静置固化48小时，以确保完全固化并达到微柱结构的最大强度。从浇铸装置上拆除夹具、支架和硅胶片。使用不锈钢剃须刀片，切除浇铸装置顶部及框架支撑上的PDMS薄膜。用手指将PDMS支架从模具支架的侧边分离。将钝化的不锈钢剃须刀片插入模具与模具支架之间的空隙中，撬开两者，确保填充在空隙中的PDMS保留在模具支架上。然后，使用锋利的不锈钢刀片，从柱体尖端切除剩余的 PDMS 薄膜以及无用区域的 PDMS。用手指缓慢地从柱体对侧将 PDMS 支架与模具分离。持续交替两侧进行分离，直至柱体完全脱离主模具。按照之前演示的方法，释放所有PDMS支架和柱体，并使用锋利的剃刀刀片修剪掉支架上残留的多余PDMS。使用热塑性熔融沉积成型3D打印机打印稳定柱体追踪器（SPoT）铸模装置的各个部件。确保3D打印部件之间，以及PDMS支架与三叉夹具之间具有牢固的压合配合。同时确认PDMS支架与柱体紧密贴合，柱体恰好到达孔底且未发生弯曲。取0.5毫升黑色PDMS组分A与0.5毫升组分B置于小型称量皿或浅容器中，混合至溶液颜色均匀。将混合后的黑色PDMS置于真空腔内，在强真空条件下脱气20分钟。将脱气后的黑色PDMS倒入3D打印的基座中，填满孔洞，并轻敲以确保无气泡残留。尽可能刮去基座上多余的PDMS。将三叉部件卡接到基座上，然后将PDMS支架放入三叉夹具的凹槽中，确保支柱的末端浸入圆形孔穴中的黑色PDMS内。将黑色PDMS在无尘环境中室温固化48小时。轻轻滑出三叉形部件，尽量减少对支柱的张力。使用小型镊子，刮去每个SPoT周围的一层薄黑色PDMS膜，然后将细尖弯曲镊子插入SPoT孔中，使其从3D打印基座上分离。使用精细的万能剪刀检查SPoTs并修剪掉铸造过程中残留的黑色PDMS薄膜。通过将PDMS支架安装到polys手机框架上，然后将其滑入黑色底板，确保成品支柱长度正确。在对生物反应器进行高压灭菌并准备好细胞混合物后，开始制备hECTs。佩戴无菌手套，从装有生物反应器部件的已灭菌袋中取出黑色底板，放入60毫升培养皿中，确保孔朝上。用移液器缓慢向每个孔中加入44 µL细胞混合液，避免产生气泡。更换一副新的无菌手套，从灭菌袋中取出带有PDMS支架的聚砜框架。将框架放置在底板上，使框架的两端嵌入底板末端的凹槽中。确保支柱均保持垂直且框架无倾斜，将生物反应器放入60毫米培养皿中。在hECTs固化过程中，向60毫米培养皿中加入1毫升含10%FBS的心肌细胞维持培养基，以提高湿度。将无盖的培养皿放入一个高型100毫米培养皿中，并用100毫米培养皿盖覆盖，然后将生物反应器放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，使胶原蛋白与悬浮细胞形成凝胶。两小时后，从培养箱中取出培养皿。加入13毫升含10%胎牛血清的心肌细胞维持培养基，倾斜培养皿，使培养基在聚四氟乙烯（PTFE）底板与聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架之间流动。从侧面检查生物反应器，确保无气泡，然后将培养皿放回培养箱。若存在困住的空气，可将生物反应器从培养基中倾斜抬起，使气泡破裂，再缓慢将其重新浸入；或使用带有加样枪头的微量移液器虹吸去除空气，同时避免扰动支柱。通过支架上的观察窗检查心肌组织工程心脏组织（hECT）的收缩情况。在24至96小时内，人工程化心脏组织（hECTs）会逐渐收缩并变得不透明。当hECTs的直径较原始直径收缩至少30%时，移除基板。用心肌细胞维持培养基填充含有生物反应器的60毫米培养皿，直至液体与培养皿边缘齐平，并向一个新的60毫米培养皿中加入14毫升培养基。佩戴无菌手套，将生物反应器在其培养皿中翻转，使底板朝上。检查是否有滞留的气泡后，缓慢抬起底板，保持其水平。确保柱尖处于焦点位置。打开阈值开关，并调节滑块，直至SPoTs清晰分界，且在hECT收缩过程中形状保持稳定。使用矩形工具在其中一个SPoTs周围绘制矩形，然后点击“post boundaries”框内的“set one”按钮，以确定矩形相对于该SPoT的位置，确保SPoT始终位于矩形边界内。对另一个支柱重复此操作，并在“set two”下进行记录。调整物体大小设置，以防止程序追踪较小的物体，并确保每个矩形内追踪的物体数量保持恒定。界面会实时显示被追踪物体之间的测量距离。利用该图表监控噪声。在“起搏频率赫兹”标题下，设置所需的频率范围以及从最小值到最大值的步进间隔。在右侧的输入框中，选择适当的设定时间，以允许人诱导性心外膜组织（hECT）适应新的起搏频率，然后指定记录时间及起搏电压。点击“开始程序”按钮以启动程序。在记录完一个频率的数据后，将刺激器频率按所需间隔递增，进行下一次记录，直至达到最大频率。以下是从底部观察到的人工工程化心肌组织（hECTs）的代表性图像，分别显示了未使用SPoTs和使用SPoTs时的情况。SPoTs在数据采集过程中提供了一个单一且明确的形状，便于追踪。在某些极端情况下，追踪目标甚至被部分遮挡。一种更可靠的形状设计实现了更稳定的光学追踪并降低了噪声，从而能够测量产生低至一微牛顿（1 µN）牵引力的微弱组织。SPoTs 提供的帽状几何结构可防止 hECT 脱落。在当前带有加热载物台的起搏设置下，测得的人工工程化心肌组织（hECT）功能在长期培养过程中保持稳定。与生理温度下的测量结果相比，室温下hECT表现出不同的收缩动力学特征，收缩和舒张速率均较慢。在较高频率刺激下，室温中的hECT收缩力趋于减弱。在较低频率下，室温时hECTs的收缩力往往更强。当在36摄氏度下进行起搏时，hECTs具有更高的自发搏动频率以及更宽的起搏频率捕获范围。温度可控的环境可确保所测得的hECTs功能具有生理相关性。此外，多组织生物反应器共用的培养基环境有助于研究不同细胞组成的hECTs之间的旁分泌信号传导。在多组织生物反应器中加入SPoTs，可使研究人员高效研究张力异常升高或降低的病变心肌组织，而此类组织在未加帽的支柱末端容易滑脱。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

设计生物反应器以改善工程心脏组织的数据采集和模型通量

我们课题组开发了一种生物反应器培养系统，可模拟心血管系统的生理脉动应力，用于再生可植入的小直径血管移植物。...

使用脉动生物反应器构建基于生物材料的血管移植物

已设计出一种循环压力生物反应器，可对心脏瓣膜组织施加生理和病理条件下的压力。LabVIEW...

设计一种用于循环压力生物反应器的装置 离体 主动脉心脏瓣膜的研究

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

在这些研究中，我们提供了一种用于再生研究的新型新生小鼠心脏支架的方法学。...

新生心脏支架：再生研究中的新型基质

在此，我们展示了由诱导性多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞生成人源工程化心肌组织的方法。我们介绍了一种分析收缩力的方法，并以hERG通道抑制剂E-4031引起收缩模式改变的示例进行说明。该方法具有高度的稳健性，适用于心脏药物筛选。...

用于心脏药物安全性筛选的人工心脏组织自动收缩分析

本文介绍了一种利用模拟心脏生理环境的电刺激和机械刺激来训练细胞群体的实验方案。这种电机械刺激可增强经处理细胞的心肌生成潜能，是在细胞治疗、疾病建模及药物筛选领域具有前景的策略。...

同步电刺激与机械刺激以增强细胞的心肌生成潜能

本实验方案的目标是在管状电纺支架中建立人巨噬细胞与肌成纤维细胞的动态共培养体系，利用可分离剪切应力与周期性拉伸的生物反应器，研究材料驱动的组织再生过程。...

一种多信号生物反应器，用于在流动和拉伸条件下评估生物材料的炎症反应与再生能力

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

本方案介绍了新开发的3D打印生物反应器的组装与操作方法 离体 灌注条件下血管的培养。该系统设计易于被其他用户采用，具有实用性、经济性，并可适应不同的实验应用，如基础生物学和药理学研究。...

体外 3D打印生物反应器中大血管的灌注培养

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

了解多组织生物反应器设计方法，利用稳定定位追踪器优化工程心脏组织功能表征的准确性。该技术为心血管疾病建模和药物筛选提供了高保真体外研究平台。

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

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