Name: CRISPR/Cas9介导的胚胎干细胞中的高效基因靶向，用于开发基因操纵的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学习利用CRISPR/Cas9技术在胚胎干细胞中进行高效基因靶向的方法，用于开发基因操纵小鼠模型。该方案可显著提高大片段DNA敲入效率，无需药物筛选即可成功获得基因修饰小鼠，为基础生命科学和医学研究提供重要工具。

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我们感谢大阪大学生物技术研究与开发（非营利组织）的Saki Nishioka，以及东京大学医学科学研究所的Mio Kikuchi和Reiko Sakamoto提供的出色技术协助。本工作获得以下资助：日本文部科学省/日本学术振兴会（MEXT/JSPS）科学研究费补助金（KAKENHI）对MI（JP19H05750、JP21H05033）和MO（20H03162）的资助；日本科学技术振兴机构（JST）先端低碳技术创新中心（CREST）对MI的资助（JPMJCR21N1）；美国尤妮斯·肯尼迪·施莱佛国立儿童健康与人类发育研究所对MI的资助（R01HD088412）；比尔 &amp;#38; 比尔及梅琳达·盖茨基金会（资助号：INV-001902）；大阪大学微生物病研究治疗中心联合研究项目资助，授予 MI 和 MO。

所有小鼠实验均经东京大学机构动物护理和使用委员会（批准号 PA17-63）和大阪大学（批准号 Biken-AP-H30-01）批准，并依照其指南以及 ARRIVE 指南（https://arriveguidelines.org）进行。
1. 靶向载体构建
<ol>
	<li>通过PCR扩增一个敲入（KI）盒（此处为CreERT，PCR模板DNA最初来自商业基因合成公司）以及约1 kb的5'或3'同源臂片段。在进行DNA克隆（步骤1.3）时，在每个PCR引物的5'端添加15个核苷酸的重叠序列。通过琼脂糖凝胶电泳纯化PCR获得的DNA片段，随后使用DNA纯化试剂盒提取目标DNA片段。</li>
	<li>使用适当的限制性内切酶对骨架质粒（例如pUC19或pBS）进行线性化处理，该酶应在多克隆位点内具有唯一酶切位点以便于克隆。然后使用DNA纯化试剂盒纯化酶切后的质粒。</li>
	<li>根据DNA克隆试剂盒的说明书，将各PCR产物片段（例如5'同源臂、3'同源臂）和KI序列同时克隆至已酶切的质粒中。</li>
	<li>将构建好的质粒（步骤1.3）转化至感受态细胞中，于水浴中42 °C加热1分钟，随后涂布于含有适当浓度抗生素（如氨苄青霉素或卡那霉素）的LB平板上。于37 °C过夜培养以筛选抗性克隆。</li>
	<li>使用200 µL枪头挑取数个（四至八个）单菌落，并将枪头转移至含有适当抗生素（100 µg/mL氨苄青霉素或20 µg/mL卡那霉素）的3 mL液体LB培养基中，于37 °C振荡培养过夜。</li>
	<li>次日根据生产商说明书，使用无内毒素级别的商业化质粒提取试剂盒提取质粒DNA，并通过Sanger测序验证质粒中克隆序列的正确性。使用无核酸酶水将质粒浓度调整至1 µg DNA/µL。将该质粒用作基因打靶载体。</li>
</ol>
2. 胚胎干细胞饲养层细胞——小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的制备
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死8至10周龄妊娠ICR雌性小鼠（交配后14.5天）。使用70%（v/v）乙醇充分擦拭腹部进行消毒，用眼科剪和镊子剪开腹部，取出含胚胎的子宫。</li>
	<li>将子宫放入含有10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的100 mm培养皿中，PBS中含100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。用眼科剪和镊子去除胚胎的胎盘和胚外组织。用眼科剪将胚胎剪碎，并将含有剪碎胚胎细胞的PBS溶液转移至50 mL锥形管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以280 × g离心5分钟，吸弃上清液。加入10 mL 0.25%（w/v）胰蛋白酶-EDTA溶液，用移液器轻轻吹打混匀，然后在37 °C水浴中孵育10分钟以进行胰蛋白酶消化。</li>
	<li>加入20 mL MEF培养基（含10%（v/v）胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM），通过轻柔颠倒混匀以终止酶反应，然后在4 °C条件下以280 × g离心5分钟。吸弃上清液，加入10 mL MEF培养基，并用移液器吹打混匀。</li>
	<li>将细胞悬液接种至多个新的100 mm培养皿中（培养皿数量与胚胎数量相同，每100 mm培养皿加入10 mL MEF培养基）。接种后4至5小时更换培养基，以去除未贴壁细胞，并让贴壁的MEF细胞继续生长。当细胞融合度达到约80%时，使用胰蛋白酶进行传代。</li>
	<li>在接种后约12至15天，将含有增殖中MEF细胞的培养皿置于X射线照射装置中。根据制造商说明，对MEF细胞进行总剂量为50 Gy的X射线照射，以阻断细胞周期。</li>
	<li>对经照射的MEF细胞，每100 mm培养皿加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟进行消化，然后加入4 mL MEF培养基终止消化反应，并将细胞悬液收集至新的50 mL离心管中。</li>
	<li>用新鲜MEF培养基在4 °C条件下以280 × g离心5分钟洗涤MEF细胞，使用台盼蓝染色法通过细胞计数仪计数细胞，并以每管1.6 × 106个细胞的密度将细胞悬浮于细胞冻存液中进行冷冻。冻存后可长期保存备用；细胞可在液氮中稳定保存数年。</li>
</ol>
3. Cas9-RNP-DNA 混合物的制备
<ol>
	<li>用移液器将tracrRNA和crisprRNA溶解于稀释缓冲液中（每种RNA浓度为200 µM）。轻轻敲击混匀tracrRNA溶液、crisprRNA溶液和稀释缓冲液（体积比为2:2:5），并在热循环仪中于95 °C退火10分钟，随后以每分钟降低1 °C的梯度降温程序逐步降温至4 °C。 
	注意：gRNA序列使用CRISPOR设计，&#160;http://crispor.tefor.net。</li>
	<li>将退火后的RNA、10 µg/µL Cas9核酸酶与电穿孔缓冲液按体积比5:3:2混合，在37 °C孵育20分钟，以形成Cas9-RNP复合物。在常规操作中，为完成一个基因组位点的编辑，混合1.25 µL退火RNA、0.75 µL Cas9核酸酶和0.5 µL电穿孔缓冲液，并进行孵育。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中混合以下组分：10 µL电穿孔缓冲液、1 µL Cas9-RNP复合物（步骤3.2）和1 µL环状靶向载体（1 µg/µL，步骤1.6）。Cas9-RNP-DNA混合物总体积为12 µL。电穿孔前将该混合物置于冰上保存。 
	&#8203;注意：为防止在敲入（KI）后gRNA再次切割，应将gRNA设计在敲入供体质粒整合后会破坏gRNA识别序列的位置。若无法在该类位置设计gRNA，则可在敲入供体质粒中引入数个同义突变（即不改变氨基酸序列的核苷酸突变）。</li>
</ol>
4. ESCs 的基因靶向
<ol>
	<li>制备明胶包被的细胞培养皿时，向60 mm培养皿中加入2 mL、24孔板中加入500 µL、96孔板中加入100 µL的0.1% (w/v) 明胶溶液，在湿润培养箱中孵育2小时。移除明胶溶液，用等量PBS洗涤两次，并在室温下保存备用。</li>
	<li>将有丝分裂失活的冷冻MEF储备液（步骤2.2）置于37 °C水浴中解冻1分钟，然后将MEF接种至明胶包被的60 mm培养皿中（每两块60 mm培养皿使用一管冷冻MEF储备液，含1.6 × 106个细胞，见步骤2.2），在胚胎干细胞（ESC）接种前1天进行。</li>
	<li>将一管冷冻保存的ESC储备液（储存浓度为2 × 105个ESC/管；细胞计数使用细胞计数仪完成）置于37 °C水浴中解冻1分钟，然后将1 × 105个ESC接种至已预先接种MEF的60 mm培养皿中（见步骤4.1）。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，使用4 mL ESC培养基（ESCM，基于DMEM的改良培养基，含15% (v/v) 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺底物、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.1 mM 2-巯基乙醇、白血病抑制因子以及t2i（0.2 µM PD0325901和3 µM CHIR99021）以维持ESC的多能性11）培养，直至ESC达到50%至70%汇合度。 
	注：本研究使用三种不同的ESC系：来自B6N的JM8.A3、来自B6-129 F1的V6.5，以及本实验室自主开发的BALB/c ESC。本文所述的相同基因敲入（KI）方案适用于所有ESC系。</li>
	<li>用4 mL PBS洗涤培养中的ESC，随后加入800 µL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C下消化5分钟。加入1 mL ESCM以终止胰蛋白酶活性，并通过吹打使ESC完全解离为单细胞悬液。</li>
	<li>将含ESC的溶液在280 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用新鲜的1 mL ESCM重悬细胞，并使用台盼蓝染色结合细胞计数仪进行细胞计数。取1 × 105个ESC转移至新的1.5 mL离心管中，用PBS在500 × g、4 °C条件下离心洗涤三次。</li>
	<li>将ESC沉淀重悬于12 µL Cas9-RNP-DNA混合物（见步骤3.3）中，轻轻吹打混匀以避免产生气泡。将重悬后的ESC用于电穿孔转染。电穿孔系统采用单次脉冲，参数为1,400 V、30 ms，用于Cas9-RNP-DNA的转导（图1）。</li>
	<li>将电穿孔后的ESC接种于含有4 mL ESCM和有丝分裂失活MEF的60 mm培养皿中进行培养。每天更换培养基。</li>
	<li>电穿孔后3至5天，用4 mL PBS洗涤ESC，随后加入800 µL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在湿润培养箱中37 °C孵育5分钟进行消化。加入2 mL ESCM终止消化反应，将细胞悬液在280 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL新鲜ESCM重悬ESC，并使用台盼蓝染色结合细胞计数仪测定细胞浓度。以每块60 mm培养皿接种1 × 103个ESC的比例进行传代，培养基中含ESCM及饲养层MEF。每天更换培养基，直至进行克隆挑取。 
	&#8203;注：在挑取克隆前对ESC进行一次传代的原因在于，基因编辑可能在ESC分裂后仍持续发生，因此首次形成的克隆在多数情况下并非真正的单克隆。因此，在克隆挑取前进行首次传代是获得单克隆的关键步骤。</li>
</ol>
5. 靶向 ESC 的 PCR 基因分型
<ol>
	<li>在首次传代（步骤 4.9）后的第 5 至 7 天，吸除 ESC 培养皿中的 ESCM，加入 4 mL PBS。在体视显微镜（30x 至 40x 放大倍数）下，使用 20 µL 移液器以 5 µL PBS 拾取单个 ESC 克隆。将单个克隆转移至含有 15 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液的圆底 96 孔板的孔中。</li>
	<li>将 96 孔板置于冰上，直至收集到 48 个单个克隆。将 96 孔板在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 5 分钟，然后加入 80 µL ESCM 以终止胰蛋白酶消化，并通过吹打将 ESC 克隆解离为单细胞。 
	注意：由于该方法的 KI 效率通常为 10%–50%，我们常规收集 48 个克隆，并首先对其中 24 个进行基因型鉴定。若此时未能获得多个 KI 克隆，则进一步利用剩余的 24 个克隆进行 KI 筛选。</li>
	<li>将 40 µL ESC 悬液（步骤 5）转移至每孔含有 50 µL ESCM 的明胶包被、无饲养层的 96 孔板中，用于 PCR 基因型鉴定。将剩余的 60 µL ESC 悬液转移至含有 500 µL ESCM 和饲养层 MEF 的明胶包被 24 孔板的孔中，以制备冻存的 ESC 储备细胞。</li>
	<li>继续培养 24 孔板中的单个 ESC 克隆（步骤 5.3），直至细胞融合度达到 60% 至 80%。按上述方法通过胰蛋白酶消化回收单个 ESC 克隆，将细胞收集至新的 1.5 mL 离心管中，并在 280 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 500 µL 细胞冻存液中，并使用 -80 °C 超低温冰箱进行冻存。</li>
	<li>进行 PCR 基因型鉴定时，将 ESC 克隆在无饲养层的 96 孔板（步骤 5.3）中培养，直至 ESC 细胞融合度超过 90%。通过抽吸去除各孔中的 ESCM，并用 100 µL PBS 洗涤两次。</li>
	<li>吸除 PBS，加入含有蛋白酶 K 的裂解缓冲液 100 µL，充分混匀，然后将 ESC 裂解液转移至新的 1.5 mL 离心管中。使用加热模块在 65 °C 下加热裂解液至少 1 小时。采用常规的酚-氯仿 DNA 纯化方法提取并纯化基因组 DNA，随后进行乙醇沉淀。</li>
	<li>将沉淀的 DNA 溶解于 20 µL 无 DNase 的水中，使用分光光度计测定 DNA 的纯度和浓度。使用位点特异性引物组合进行基因组 PCR，扩增目标区域。随后检测序列，并筛选出具有预期 KI 序列的 ESC 克隆。</li>
</ol>
6. 八细胞期胚胎的制备及胚胎干细胞的显微注射
<ol>
	<li>将5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）经腹腔注射至成年ICR雌鼠体内。48小时后，向同一批雌鼠注射5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG），随后将经激素处理的雌鼠与ICR雄鼠合笼交配。次日检查阴道栓（胚胎发育第0.5天，ED0.5）。 
	注意：为通过毛色比例评估嵌合体程度，可使用ICR品系的囊胚作为受体，接受具有黑色或野鼠色毛色背景的胚胎干细胞（ESC）；或使用C57BL/6品系的囊胚作为受体，接受具有白化背景的ESC。</li>
	<li>在ED1.5时取出输卵管，并将其置于HEPES缓冲液（FHM）液滴中。使用冲洗针插入漏斗部，以FHM冲洗输卵管，回收处于二细胞或四细胞阶段的胚胎。</li>
	<li>使用口控移液管将收集的胚胎转移至数个新鲜的FHM液滴中进行清洗。将胚胎培养于35 mm细胞培养皿中，置于覆盖矿物油的50 µL KSOM液滴内，在37 °C、5% CO2培养箱中培养1天，直至发育至八细胞或桑葚胚阶段（ED2.5）。</li>
	<li>若胚胎不在下一次收集日使用，应按照CARD方案（http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html）进行玻璃化冷冻，并保存于液氮中待用。</li>
	<li>使用拉针仪和显微操作器制备用于固定胚胎（外径80–100 µm）和注射胚胎干细胞（直径约13 µm）的玻璃毛细管。</li>
	<li>将装有FHM的固定毛细管连接至微注射仪的毛细管夹持器，并安装在显微操作器左侧；将注射毛细管连接至另一微注射仪，并安装在右侧。调整两根毛细管，使其在显微镜视野中呈直线对齐。</li>
	<li>在60 mm培养皿盖内并排滴加5 µL含12%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的FHM溶液和5 µL FHM液滴，并用矿物油覆盖。将胚胎转移至5 µL FHM液滴中，并向含有胚胎的FHM液滴中加入1–5 µL ESC悬液。 
	注意：在制备液滴前，将ESC和MEF悬液置于60 mm培养皿中的4 mL ESM中静置30分钟。由于MEF比ESC更快贴壁，此30分钟孵育可使未贴壁的ES细胞富集于上清液中。</li>
	<li>用PVP清洗注射毛细管内部，然后移入含有胚胎和ESC的液滴中。</li>
	<li>在注射毛细管中吸取三个刚刚完成细胞分裂的ESC双细胞团（共六个细胞）。用固定毛细管通过负压吸附固定已完成致密化的八细胞或桑葚胚阶段胚胎。使用压电脉冲（强度：3；速度：3）在透明带打孔。将六细胞的ESC排出至透明带内，然后将毛细管从胚胎中抽出。</li>
	<li>使用口控移液管将注射了ESC的胚胎轻柔地在数个KSOM液滴中清洗，随后将其转移至新的、覆盖矿物油的50 µL KSOM液滴中，在37 °C、5% CO2条件下培养，直至胚胎发育至囊胚阶段。</li>
	<li>将10个注射了ESC的囊胚分别移植至假孕雌鼠（交配后2.5天）的每个子宫角中（每只受体共移植20个囊胚）。</li>
	<li>待代孕母鼠分娩后，选择至少两只嵌合程度最高（经毛色确认嵌合率≥70%）的雄性嵌合鼠，与相应品系的雌鼠交配，以获得F1代杂合子基因敲入（KI）小鼠。</li>
	<li>将单个KI小鼠与合适的配对个体进行繁育，以获得具有目标基因型或适合研究需求的遗传背景的小鼠。</li>
</ol>

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<li>Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocyst+complementation+using+Prdm14-deficient+rats+enables+efficient+germline+transmission+and+generation+of+functional+mouse+spermatids+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats.</a> Nature Communications. 12 (1), 1328(2021).</li>
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</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

基因靶向编辑胚胎干细胞并随后产生嵌合体小鼠，是传统上用于构建基因改造小鼠的方法。然而，即使靶向载体包含较长的同源臂，基因敲入效率仍然较低&#62; 使用正向或负向药物筛选基因盒的数kb长度的同源臂。本方案介绍了一种优化的ESC定点整合方法，利用不含任何药物筛选盒的环状质粒作为靶向载体，并结合Cas9核糖核蛋白复合物（Cas9-RNP）介导的基因组编辑，以适用于常规实验的可接受效率实现较长外源DNA的插入。因此，与传统ESC靶向技术相比，本方案可显著缩短制备基因修饰嵌合小鼠所需的时间。
在本实验方案中，我们采用CRISPR/Cas9-RNP在基因组中诱导位点特异性的双链断裂，并使用环状质粒作为靶向载体，而非线性化质粒。传统上，由于线性化质粒具有更高的基因组整合效率，通常被用作基因敲入（KI）的靶向载体8,9,10。然而，即使载体含有同源臂，仍会发生大量非特异性整合9。另一方面，由于环状质粒难以整合到胚胎干细胞（ESCs）12或成纤维细胞13的基因组中，因此很少被用作靶向载体。因此，将环状质粒作为靶向载体并结合CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，有可能最大限度地减少非特异性的随机整合，同时提高在ESC基因组中的位点特异性整合效率。值得注意的是，CRISPR/Cas9诱导双链断裂的效率至关重要14，因此必须使用能够高效诱导双链断裂的gRNA。当敲入效率过低时，应考虑重新设计gRNA。如 图2所示，40.9%的ESC克隆显示出敲入特异性条带。事实上，作为研究所的核心实验室，我们常规使用本方案所述方法通过ESCs进行基因靶向操作，对于Cre、CreERT或荧光报告基因等长度为1–2 kb的序列，已实现10%–50%的敲入效率，尽管不同基因位点之间存在一定差异。我们利用该方法成功实现敲入的最长DNA序列约为11.2 kb，靶向Rosa26位点，敲入效率为12.2%（在分析的41个克隆中获得5个阳性敲入克隆）。
值得注意的是，本方案采用八细胞期或桑葚胚期胚胎作为胚胎干细胞（ESC）显微注射的受体，而非囊胚期胚胎。尽管本文未开展相关比较实验，但已有数篇报道表明，将ESC注射到八细胞期或桑葚胚期胚胎中，相较于注射到囊胚中，可显著提高ESC对嵌合体后代的贡献效率15,16,17,18。事实上，将不同ESC系（包括C57BL/6、B6-129 F1和BALB/c）进行注射后，部分但并非全部后代均表现出较高的毛色嵌合体发育率（见图4）。该方法的局限性在于，注射到着床前胚胎中的ESC在嵌合体中并不总能贡献于生殖细胞19,20。ESC的生殖系传递能力取决于各个ESC克隆的质量19。因此，为稳定生产嵌合小鼠，建立多个ESC克隆系作为备用将具有优势。总之，本文所介绍的方案采用仅包含同源臂和目的基因、不含任何药物抗性表达盒的简单靶向载体，因此载体构建更为简便，且与传统的ESC靶向技术相比可缩短细胞培养周期。这将有助于在生命科学研究中快速、便捷地制备多种类型的基因修饰小鼠用于后续分析。

培育基因修饰小鼠并分析其表型，使我们能够在活体（in vivo）条件下深入理解特定基因的功能。生命科学领域已利用基因修饰动物模型取得了众多重要发现。此外，自CRISPR/Cas9基因组编辑技术的报道以来1，使用基因修饰小鼠的研究已迅速扩展至众多实验室2,3。利用CRISPR/Cas9对小鼠受精卵进行基因组编辑，已实现较高的编辑效率，适用于短片段DNA修饰，例如以插入缺失突变（indel）为导向的基因敲除4、单核苷酸替换，或利用单链寡核苷酸（ssODNs）作为敲入（KI）供体实现短肽标签插入5。然而，与短片段DNA修饰相比，通过基因组编辑将大片段DNA敲入受精卵的效率仍然较低6,7。此外，某些小鼠品系（如BALB/c）在基于受精卵的基因组编辑中难以应用，因为这些品系的着床前胚胎对体外操作（in vitro manipulation）高度敏感，而BALB/c品系在免疫学等特定研究领域具有重要意义。
另一种构建转基因小鼠模型的方法是采用胚胎干细胞（ESC）靶向技术，随后将ESC注射到植入前胚胎中以产生嵌合体。8,9,10，该方法目前仍作为常规手段被常规使用。尽管传统ESC靶向方法获得准确KI-ESC克隆的获取率并不高，但与受精卵基因组编辑相比，ESC靶向具有一些优势，尤其是在长片段DNA敲入（KI）方面。例如，长片段DNA（&#62; 将数个 kb 的片段插入合子基因组的效率尚不明确6,7，而要建立一个KI小鼠品系需要大量受精卵，这在当前动物实验的伦理背景下是不可取的。与受精卵基因组编辑相比，将长片段DNA靶向编辑应用于胚胎干细胞（ESC），再通过嵌合体生产的方式，所需胚胎数量显著减少。此外，尽管来自BALB/c品系的植入前胚胎对 体外 操作，其 ESCs 可以被维持和处理 体外11 与其他具有129或F1遗传背景的全能性ESCs一样，适用于嵌合体的制备。然而，尽管靶向载体包含5'和3'同源臂以及用于阳性或阴性筛选的药物抗性基因盒，由于基因组随机整合频率较高，传统ESCs的基因敲入效率通常仍不理想8,10因此，需要一种能够精确提高ESC靶向效率的改进方法。最近，我们报道了一种优化的ESC KI方法，该方法采用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术，其KI效率高于传统靶向方法11. 本文所述方法基于该流程，可实现长片段DNA（&#62; 数个至10 kb的基因敲入（KI）在胚胎干细胞（ESCs）中可实现常规实验所需的可接受效率，且无需药物筛选；因此，载体构建过程将更为简便且耗时更短，或细胞培养周期也将显著缩短。

<table><tbody><tr><td>BALB/c ESC</td><td>-</td><td>-</td><td>由 BALB/c 品系建立的胚胎干细胞</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>CS-02-001</td><td>无细胞冻存培养基。见第 2.6 节及其他部分</td></tr><tr><td>Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>见第 3.2 节及其他部分。</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>038-23101</td><td>见第 4.3 节</td></tr><tr><td>CreERT 基因片段</td><td>GeneWiz</td><td></td><td>见第 1.1 节。</td></tr><tr><td>CRISPR-Cas9 crisprRNA</td><td>IDT</td><td></td><td>crisprRNA。见第 3.1 节及其他部分。</td></tr><tr><td>CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>IDT</td><td>1072534</td><td>tracrRNA。见第 3.1 节及其他部分。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08458-45</td><td>MEF 培养基。见第 2.3 节及其他部分</td></tr><tr><td>Duplex buffer</td><td>IDT</td><td>1072534</td><td>RNA 稀释缓冲液。见第 3.1 节及其他部分。</td></tr><tr><td>FastGene Gel/PCR Extraction Kit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91302</td><td>见第 1.1 和 1.2 节。</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td>L-谷氨酰胺底物</td></tr><tr><td>hCG</td><td>ASKA Animal Health</td><td></td><td>见第 6.1 节。</td></tr><tr><td>In-Fusion HD Cloning Kit</td><td>Clontech</td><td>639648</td><td>DNA 克隆试剂盒。见第 1.3 节及其他部分</td></tr><tr><td>JM8.A3 ESC</td><td>EuMMCR</td><td>-</td><td>由 C57BL/6N 品系建立的胚胎干细胞</td></tr><tr><td>Knock-out DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td>见第 4.3 节及其他部分，基于 DMEM 的改良商用培养基。</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-121-D</td><td>见第 6.3 和 6.9 节。</td></tr><tr><td>白血病抑制因子</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>125-05603</td><td>见第 4.3 节。供应商未提供单位浓度数据。本方案中使用 1,000 倍稀释液。</td></tr><tr><td>Neon 电穿孔系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>MPK5000</td><td>见第 3.2、4.5 节及其他部分。该系统包含电穿孔缓冲液，亦用于第 3.2 节。</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Transfection-grade</td><td>Takara</td><td>U0490B</td><td>见第 1.6 节。</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>162-25291</td><td>见第 4.3 节</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>ASKA Animal Health</td><td></td><td>见第 6.1 节。</td></tr><tr><td>尾组织裂解缓冲液</td><td>Nacalai</td><td>06169-95</td><td>见第 5.5 节。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Nacalai</td><td>32777-15</td><td>见第 2.2 节及其他部分</td></tr><tr><td>V6.5 ESC</td><td>-</td><td>-</td><td>由 B6J-129 F1 品系建立的胚胎干细胞</td></tr><tr><td>X射线照射装置</td><td>Hitachi</td><td>MBR-1618R-BE</td><td>见第 2.6 节。</td></tr></tbody></table>

利用crispr/cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

CRISPR/Cas9 系统使得通过直接对受精合子进行基因组编辑来制备基因修饰小鼠成为可能。然而，尽管通过诱导小片段插入/缺失（indel）突变来制备基因敲除小鼠的效率已足够高，但利用胚胎基因组编辑实现大片段DNA敲入（KI）的效率仍然较低。因此，与直接在胚胎中进行敲入的方法相比，采用胚胎干细胞（ESCs）进行基因靶向并随后通过胚胎注射制备嵌合体小鼠的方法仍具有多项优势（例如高通量靶向） 体外多等位基因操作，以及 Cre 和 flox 基因操作可以在较短时间内完成。此外，对于胚胎难以处理的品系 体外例如 BALB/c 小鼠也可用于 ESC 打靶。本方案描述了通过 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑结合嵌合小鼠制备，实现 ESCs 中大片段 DNA（数 kb）定点插入的优化方法，以建立基因修饰小鼠模型。

我们针对胚胎干细胞（ESC）中的特定基因进行靶向操作，随后通过嵌合体小鼠的制备，按照此前发表的文献方法11建立基因修饰小鼠模型。ESC的基因型鉴定（见第4节）通常采用PCR方法，使用特异性引物进行扩增。引物设计位于同源臂外侧的基因组序列以及KI DNA片段中的特异序列上（图2A）。在此情况下，野生型等位基因不会被扩增，仅当外源靶向DNA片段在目标位点成功插入时，才能扩增出特定大小的PCR产物。典型的基因型鉴定PCR结果如图2B所示。本例中，22个克隆中有9个（40.9%）显示出与KI事件特异对应的条带。包括图图2所示结果在内的三个代表性基因靶向结果列于表1中。这些结果表明，本文所述方法在无需药物筛选的情况下，仍可高效且可重复地实现基因定点插入（KI）。
用注射移液管吸取ES细胞，然后使用压电装置在透明带打孔，并将ES细胞释放到胚胎细胞之间（图3）。从技术上讲，将ES细胞注射到八细胞期或桑葚胚期胚胎的本方案，与许多小鼠实验设施中常用的将ES细胞注射到囊胚中的方案类似。代表性嵌合小鼠见图4。为评估毛色嵌合情况，以ICR品系（白化，白色毛发）胚胎作为B6或B6-129 F1 ES细胞的受体，而以B6胚胎作为BALB/c ES细胞的受体（图4）。
<img alt="在环状质粒中特定位点进行基因编辑的CRISPR/Cas9靶向载体示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）介导的环状质粒整合至胚胎干细胞（ESC）基因组特定位点的示意图。 通过电穿孔将环状质粒作为靶向载体与Cas9-RNP共同导入胚胎干细胞中。缩写：GOI = 目的基因，HA = 同源臂。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因靶向示意图；克隆验证的凝胶电泳，KI 扩增结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：靶向胚胎干细胞克隆的 KI 筛选基因组 PCR 分析。（A）针对 KI 的特异性 PCR 引物设计于同源臂外侧的基因组序列（正向）和 KI DNA 片段中的特有序列（反向）。（B）代表性基因分型 PCR 结果。以野生型基因组作为阴性对照。缩写：GOI = 目的基因，HA = 同源臂。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎显微注射过程，显微镜图像，细胞操作技术，发育生物学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：八细胞期胚胎显微注射的代表性图像。（A）显微注射时，选取三对胚胎干细胞（共六个细胞，箭头所示）。（B）利用压电脉冲在透明带打孔，并将胚胎干细胞注入每个卵裂球之间。标尺长度为 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="遗传学研究示意图；注射用胚胎与受体胚胎毛色差异；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64385/64385fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：嵌合体小鼠的代表性图像。（A,B）将来源于 C57BL/6N（JM8.A3，Agouti 毛色；A）或 B6-129 F1（Agouti 毛色；B）的胚胎干细胞注射至 ICR（白化，白色毛发）胚胎中，随后将胚胎移植至代孕母鼠体内。（C）将来源于 BALB/c（白化，白色毛发）的胚胎干细胞注射至 C57BL/6J（黑色毛发）胚胎中，随后将胚胎移植至代孕母鼠体内。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64385/64385fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>项目编号</td>
			<td>染色体</td>
			<td>5'同源臂长度 (bp)</td>
			<td>3'同源臂长度 (bp)</td>
			<td>插入片段大小 (bp)</td>
			<td>分析的克隆数</td>
			<td>KI克隆数</td>
			<td>效率 (%)</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R26-CC*</td>
			<td>Chr6</td>
			<td>965</td>
			<td>1006</td>
			<td>5321</td>
			<td>23</td>
			<td>2</td>
			<td>8.7%</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R4-03*</td>
			<td>Chr8</td>
			<td>1000</td>
			<td>997</td>
			<td>3070</td>
			<td>22</td>
			<td>6</td>
			<td>27.3%</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P4-01*</td>
			<td>Chr15</td>
			<td>1000</td>
			<td>1000</td>
			<td>2569</td>
			<td>22</td>
			<td>9</td>
			<td>40.9%</td>
			<td>见图2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：在ESC中三个独立基因组位点的KI效率。 *这些项目目前尚未发表。这些基因的名称将在未来的独立论文中公布。

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

CRISPR/Cas9 系统使得通过直接对受精合子进行基因组编辑来制备转基因小鼠成为可能。然而，尽管……

制备转基因小鼠并分析其表型，能够帮助我们在活体条件下深入理解特定基因的功能。利用基因修饰动物模型，已揭示出众多重要的科学发现。本文所述方法能够以可接受的效率将长片段DNA导入干细胞，且无需药物筛选。该技术不仅对基础生命科学具有重要意义，其研究成果还将应用于医学和动物科学等应用科学领域。本次实验操作将由本实验室的助理教授Emori Chihiro博士和副教授Ozawa Manabu博士进行示范。在制备小鼠胚胎成纤维细胞后，按照论文所述方法制备明胶包被的细胞培养皿，并在湿润培养箱中孵育两小时。移除明胶溶液，用 PBS 洗涤培养皿两次，并在室温下保存备用。将有丝分裂失活的冷冻 MEF 储备液置于 37 摄氏度水浴中解冻一分钟。在 ESC 接种前一天，将 MEF 接种于经明胶包被的 60 毫米培养皿中。如前所述，解冻一支冻存的胚胎干细胞（ESC）冻存管，将1×10⁵个ESC接种至一个含有预铺底层小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的60毫米培养皿中。然后加入4毫升ESC培养基，将培养皿置于培养箱中孵育，直至ESC达到50%至70%融合度。用4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养的ESC后，在37°C条件下用800微升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化5分钟。用一毫升 ESCM 灭活胰蛋白酶后，向细胞中加入一毫升新鲜 ESCM，将培养基转移至离心管中，并在 280 ×g 条件下离心五分钟以沉淀细胞。将细胞重悬于一毫升新鲜 ESCM 中，使用台盼蓝染色法通过细胞计数仪测定细胞浓度。将 1×10⁵ 个胚胎干细胞转移至新的 1.5 毫升离心管中，用 PBS 洗涤三次（每次均通过离心），然后将细胞沉淀重悬于 12 微升 Cas9 RNP DNA 混合液中，轻轻吹打混匀，避免产生气泡。然后，将悬浮的胚胎干细胞用于电穿孔。接着，将电穿孔后的胚胎干细胞培养于60毫米培养皿中，内含4毫升胚胎干细胞培养基（ECSM），并加入有丝分裂失活的MEF细胞，每天更换培养基。电穿孔后3至5天，用4毫升PBS洗涤胚胎干细胞，随后加入800微升0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化，并在湿润培养箱中继续培养。随后，加入 2 mL ESCM 以终止胰蛋白酶消化。待细胞混合物离心沉淀后，将沉淀物重悬于 1 mL 新鲜 ESCM 中，并使用台盼蓝染色法通过细胞计数仪测定细胞浓度。将 ESCs 以每 60 mm 培养皿 1 × 10³ 个细胞的密度接种，培养皿中需含有 ESCM 和饲养层 MEF。确保更换培养基直至克隆被挑取。首次传代后5至7天，当从ESC培养皿中吸出ESCM后，加入4毫升PBS。在体视显微镜下，使用20微升移液器，用5微升PBS挑取单个ESC克隆。将单个菌落放入含有15微升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液的圆底96孔板的孔中。孵育96孔板后，加入80微升ESCM以终止胰蛋白酶消化，并通过吹打将ES菌落解离为单细胞。进行PCR基因分型时，将40微升ES细胞悬液转移至每孔含有50微升ESCM的明胶包被、无饲养层的96孔板中。为制备冻存的 ESC 菌株，将剩余的 60 微升 ESC 悬液转移至含有 500 微升 ESCM 和饲养层 MEF 的明胶包被 24 孔板的一个孔中。在 24 孔板中培养单个 ESC 克隆，直至其达到 60% 至 80% 汇合度，然后通过胰酶消化回收单个 ESC 克隆，操作方法如前所述。离心获得细胞沉淀后，将其重悬于 500 微升细胞冻存液中，于 -80 摄氏度冻存细胞。进行PCR基因分型时，按照之前所述方法培养ESC克隆，用移液枪吸去每孔中的ESCM，并用100微升PBS洗涤两次。吸去PBS后，加入100微升含有蛋白酶K的裂解缓冲液，充分混匀。随后将ESC裂解液转移至新的1.5毫升离心管中，置于65摄氏度的加热箱中至少孵育1小时。将基因组DNA溶解于20微升无DNase的水中后，使用分光光度计测定DNA的纯度和浓度。使用位点特异性引物组进行基因组PCR以扩增目标区域后，检测序列并筛选出具有理想敲入序列的ESC克隆。将激素处理的雌鼠与ICR雄鼠交配并收集输卵管后，将所获输卵管置于FHM液滴中，并用冲洗针插入漏斗部，以FHM冲洗输卵管以回收处于二细胞或四细胞阶段的胚胎。使用口吸管将收集的胚胎转移至数滴新鲜的FHM液滴中进行清洗。将胚胎置于覆盖矿物油的35毫米细胞培养皿中的50 µL KSOM液滴内进行培养，培养方法同前文所述，持续培养一天，直至发育至八细胞期或桑葚胚阶段。使用拉针仪和显微操作仪制备用于固定胚胎和ESC注射的玻璃移液管。将含有FHM的持卵管连接至与显微注射仪相连的毛细管架后，将其安装在显微操作仪的左侧。将注射针连接至另一台显微注射仪，并安装在右侧。调整两根针的位置，使其在显微镜视野中呈直线对齐。在60毫米培养皿的同一皿盖上，并排滴加5微升12%聚乙烯吡咯烷酮溶液和5微升FHM溶液。用矿物油覆盖液滴。将胚胎转移至5微升FHM液滴中，并向含有胚胎的FHM液滴中加入1至5微升ESC悬浮液。用聚乙烯吡咯烷酮冲洗注射针后，将注射针移至含有胚胎和ESCs的液滴中。在注射针中挑选三个刚刚完成细胞分裂的ESCs双细胞团。用固定针通过抽吸固定一个已完成压缩的八细胞期或桑葚胚期胚胎，并利用压电脉冲在透明带打孔。将六细胞期的胚胎干细胞（ESC）从透明带内推出，并将移液管从胚胎中抽出。用口控移液器将注射了ESC的胚胎轻轻经过数滴KSOM液滴进行洗涤，然后将其转移至一个新的、覆盖石蜡油的50微升KSOM液滴中培养，直至胚胎发育至囊胚阶段，操作方法如前所述。经PCR扩增后获得了与敲入靶点大小相符的特异性条带，22个克隆中有9个显示出敲入特异性的PCR条带。这些结果在无任何药物筛选的情况下均能高效且可重复地实现基因敲入。选择大小合适的胚胎干细胞集落对本实验步骤至关重要。应避免挑选过大或过小的集落。利用受精卵进行CRISPR Cas9介导的直接基因组编辑适用于制备简单的基因敲除小鼠。该CRISPR Cas9介导的ESC基因靶向技术方案有助于生产多种转基因小鼠，用于生命科学领域的后续分析。

crisprcas9-mediated-highly-efficient-gene-targeting-embryonic-stem

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

CRISPR/Cas9介导的胚胎干细胞中的高效基因靶向，用于开发基因操纵的小鼠模型

锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等设计核酸酶可通过激活非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，对小鼠着床前胚胎的基因组进行修饰。这些技术进步使得能够快速生成具有精确遗传修饰的小鼠。...

利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus...

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

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利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

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通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

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通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

本方案介绍了一种优化的遗传修饰大鼠模型制备方法。利用腺相关病毒（AAV）递送DNA修复模板，并通过电穿孔技术将CRISPR-Cas9试剂递送至2细胞期胚胎，以完成基因组编辑过程。...

利用腺相关病毒（AAV）和2细胞胚胎电穿孔技术对大鼠胚胎进行CRISPR-Cas9基因组编辑

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

基因组编辑改进效率 通过 输卵管核酸递送（I-GONAD）方法与传统显微注射技术相当，后者需要从供体雌性动物中收集受精卵，并将其移植到假孕雌性动物体内。本方案通过引入CRISPR/Cas9诱导的突变，证明了该方法的有效性 ROSA26...

基因组编辑技术的改进 通过 基于输卵管核酸递送的 在体 内 电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

学习利用CRISPR/Cas9技术在胚胎干细胞中进行高效基因靶向的方法，用于开发基因操纵小鼠模型。该方案可显著提高大片段DNA敲入效率，无需药物筛选即可成功获得基因修饰小鼠，为基础生命科学和医学研究提供重要工具。

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

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