CRISPR/Cas9介导的胚胎干细胞中的高效基因靶向，用于开发基因操纵的小鼠模型

生产转基因小鼠并分析其表型使我们能够在体内详细了解特定的基因功能。使用基因修饰动物模型已经发现了许多重要发现。我们在这里描述的方法使长DNA能够以可接受的效率植入干细胞，而无需选择药物。

该技术不仅有益于基础生命科学，而且研究结果也将应用于医学和动物科学等应用科学。演示该程序的将是助理教授Chihiro Emori博士和我实验室的副教授Manabu Ozawa博士。制备小鼠胚胎成纤维细胞后，按照手稿中所述制备明胶包被的细胞培养皿，并在潮湿的培养箱中孵育两个小时。

取出明胶溶液，用PBS清洗餐具两次，并在室温下储存直至使用。使用在 37 摄氏度下回火的水浴解冻有丝分裂灭活的冷冻 MEF 原液一分钟。在ESC播种前一天，将MEF放在涂有明胶的60毫米培养皿上。

如前所示解冻冷冻的ESC储备管，并将10倍至第五个ESC放入含有预接种MEF的60毫米培养皿上。然后，加入四毫升ESC培养基并孵育培养皿，直到ESC达到50%至70%汇合度。用四毫升PBS洗涤培养的ESC后，用800微升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液在37摄氏度下消化5分钟。

一旦胰蛋白酶用一毫升ESCM灭活，向细胞中加入一毫升新鲜ESCM，将培养基转移到试管中，并通过以280G离心五分钟来沉淀细胞。将细胞重悬于一毫升新鲜ESCM中后，使用台盼蓝染色的细胞计数器计数细胞浓度。将1次10转移到第五个ESC到新的1.5毫升管中并通过离心用PBS洗涤三次后，将ESC沉淀重悬于12微升Cas9 RNP DNA混合物中，并通过轻轻移液充分混合以避免起泡。

然后，将悬浮的ESC用于电穿孔。接下来，在含有4毫升ECSM的60毫米培养皿中培养电穿孔的ESC，并每天更换培养基。电穿孔后三至五天，用4毫升PBS洗涤ESC，然后用800微升0.25%胰蛋白酶EDTA消化并在潮湿的培养箱中培养。

之后，加入两毫升ESCM以停止胰蛋白酶消化。细胞混合物沉淀后，将沉淀重悬于一毫升新鲜ESCM中，并使用台盼蓝染色的细胞计数器计数细胞浓度。每60毫米培养皿将ESC传代10至第三个细胞，含有ESCM和饲养线MEF。

确保更换培养基，直到菌落拾起。第一次传代后五到七天，一旦从ESC培养皿中吸出ESCM，加入四毫升PBS。使用20微升移液器，在体视显微镜下用5微升PBS拾取单个ESC菌落。

将单个菌落置于含有15微升0.25%胰蛋白酶EDTA溶液的圆底96孔板的孔中。孵育 96 孔板后，通过加入 80 μL ESCM 并通过移液将 ESC 集落解离成单细胞来停止胰蛋白酶消化。对于 PCR 基因分型，将 40 μL ESC 悬浮液转移到明胶包被、无饲养层的 96 孔板中，每孔含有 50 微升 ESCM。

要制作冷冻的ESC原液，请将剩余的60微升ESC悬浮液转移到含有500微升ESCM和喂料器MEF的明胶包衣24孔板的孔中。如前所述，储存在24孔板中培养的单个ESC克隆，直到它们达到60%至80%汇合度，并通过胰蛋白酶消化回收单个ESC克隆。通过离心获得细胞沉淀后，将重悬于500微升细胞冷冻培养基中，以在零下80摄氏度下冷冻细胞。

对于PCR基因分型，如前所述培养ESC克隆，并通过抽吸从每个孔中去除ESCM，然后用100微升PBS洗涤两次。吸出PBS后，加入100微升含有蛋白酶K的裂解缓冲液并充分混合。现在将ESC裂解物转移到新的1.5毫升管中，并将其保持在65摄氏度的加热室中至少一小时。

将基因组DNA溶解在20微升无DNA酶的水中后，使用分光光度计测定DNA的纯度和浓度。使用基因座特异性引物集进行基因组PCR以扩增靶区后，检查序列并选择具有所需敲入序列的ESC克隆。将激素处理过的雌性与ICR雄配并收集输卵管后，将收集的输卵管放入FHM滴剂中，并使用插入漏斗的冲洗针用FHM冲洗输卵管来恢复两细胞或四细胞阶段胚胎。

使用口移液管将收集的胚胎移动到几滴新鲜的FHM滴中来洗涤收集的胚胎。如前所述，在覆盖有矿物油的35毫米细胞培养皿上将胚胎在50微升KSOM滴剂中培养一天，直到达到八细胞或桑葚阶段。准备玻璃移液器，用于使用拉拔器和微锻进行胚胎和ESC注射。

将含有FHM的保持移液器集成到连接到显微注射器的毛细管支架中后，将其安装在显微操纵器的左侧。将注射移液器连接到另一个微量注射器并将其安装在右侧。将两个移液器在显微镜视野中笔直对齐。

将 5 微升滴 12% 聚乙烯吡咯烷酮和 5 微升滴 FHM 并排放在 60 毫米培养皿的同一个盖子上。用矿物油覆盖滴剂。将胚胎转移到五微升FHM滴剂中，并将一至五微升ESC悬浮液添加到含有胚胎的FHM滴剂中。

用聚乙烯吡咯烷酮洗涤注射移液器后，将注射移液器移至包含胚胎和ESC的液滴上。在进样移液器中挑选三个刚刚完成细胞分裂的单独ESC双联体。使用保持移液管，握住通过抽吸完成压实的八细胞或桑葚期胚胎，并用压电脉冲在透明带上打一个孔。

排出透明带内的六细胞ESC，并将移液器从胚胎中拉出。如前所述，用几滴KSOM轻轻地用几滴KSOM滴剂清洗ESC注射的胚胎，并将它们在覆盖有矿物油的新50微升KSOM滴剂中孵育，直到胚胎发育到囊胚阶段。获得特定于敲入靶标大小的PCR扩增子，22个克隆中有9个显示出敲入特异性条带。

这些结果对于基因敲入是有效且可重复的，无需任何药物选择。选择ESC菌落的最佳大小对于此过程非常重要。避免选择太大或太小的菌落。

使用受精卵的CRISPR Cas9介导的直接基因组编辑将适用于制造简单的基因敲除小鼠。这种CRISPR Cas9介导的ESC基因靶向方案有助于生产各种转基因小鼠，用于生命科学的未来分析。