Name: 通过工程、条形码和筛选腺相关病毒 （AAV） 衣壳变体分离下一代基因治疗载体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 了解腺相关病毒衣壳变体的工程化、条形码标记与高通量筛选方法，用于开发下一代基因治疗载体。该技术可提升AAV递送治疗性转基因的效能与特异性，降低所需病毒剂量，从而改善基因治疗的安全性与适用性。

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D.G. 深度感谢德国研究基金会（DFG）通过 DFG 协同研究中心 SFB1129（项目编号 240245660）和 TRR179（项目编号 272983813）提供的支持，以及德国感染研究中心（DZIF, BMBF；TTU-HIV 04.819）的支持。

<ol><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durability+of+transgene+expression+after+rAAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Durability of transgene expression after rAAV gene therapy.</a> Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).</li>
<li>Li, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+community+grapples+with+toxicity+issues%2C+as+pipeline+matures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).</li>
<li>Nature Biotechnology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+at+the+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene therapy at the crossroads.</a> Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).</li>
<li>Becker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fantastic+AAV+Gene+Therapy+Vectors+and+How+to+Find+Them-Random+Diversification%2C+Rational+Design+and+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning.</a> Pathogens. 11 (7), 756(2022).</li>
<li>Perabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).</li>
<li>Muller, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Sahel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+recovery+of+visual+function+in+a+blind+patient+after+optogenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy.</a> Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).</li>
<li>Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+a+high-resolution+functional+map+of+adeno-associated+virus+capsid+by+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing.</a> Nature Communications. 5, 3075(2014).</li>
<li>Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+biodistribution+analysis+of+adeno-associated+virus+variants+by+double+barcode+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+targeting+of+adeno-associated+viral+vectors+by+next-generation+sequencing-guided+screening+of+random+capsid+displayed+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries.</a> Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Ravindra Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Cre-dependent+selection+yields+systemic+AAVs+for+targeting+distinct+brain+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types.</a> Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+efficient+AAV+vector+for+robust+CNS+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).</li>
<li>Nonnenmacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+blood-brain-barrier-penetrating+AAV+capsids+by+RNA-driven+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+family+of+AAV+capsid+variants+enabling+potent+muscle-directed+gene+delivery+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species.</a> Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).</li>
<li>Davidsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+capsid+evolution+approach+performed+in+vivo+for+the+design+of+AAV+vectors+with+tailored+properties+and+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).</li>
<li>Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+AAV+capsid+fitness+landscape+reveals+a+viral+gene+and+enables+machine-guided+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design.</a> Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).</li>
<li>Kondratov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+a+29-capsid+AAV+library+in+a+non-human+primate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system.</a> Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).</li>
<li>Weinmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+myotropic+AAV+by+massively+parallel+in+vivo+evaluation+of+barcoded+capsid+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants.</a> Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).</li>
<li>Kremer, L. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+of+novel+AAV+capsids+identifies+variants+for+transduction+of+adult+NSCs+within+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).</li>
<li>Borner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-arrayed+pan-AAV+peptide+display+libraries+for+rapid+single-round+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening.</a> Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).</li>
<li>Kienle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+evolution+of+synthetic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+gene+therapy+vectors+via+DNA+family+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).</li>
<li>Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+droplet+digital+PCR+as+a+tool+for+titration+and+integrity+evaluation+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).</li>
<li>Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+DNA+barcode+library+generation+for+biomolecule+identification+in+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).</li>
<li>Korbelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+design+and+production+strategies+for+novel+adeno-associated+viral+display+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries.</a> Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).</li>
<li>Korbelin, J., Trepel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+screen+random+adeno-associated+virus+display+peptide+libraries+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo.</a> Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).</li>
<li>Herrmann, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+all-inclusive+pipeline+for+shuffling+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22American+Chemical+Society+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses.</a> American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).</li>
<li>Choudhury, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+yields+AAV-B1+Capsid+for+central+nervous+system+and+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy.</a> Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).</li>
<li>Buschmann, T., Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levenshtein+error-correcting+barcodes+for+multiplexed+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing.</a> BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).</li>
<li>Buschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNABarcodes%3A+an+R+package+for+the+systematic+construction+of+DNA+sample+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags.</a> Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+mouse+transcriptomic+BodyMap+across+17+tissues+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).</li>
<li>Clarner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+one-step+RT-ddPCR+method+to+determine+the+expression+and+potency+of+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors.</a> Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).</li>
<li>Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+design%3A+A+Goldilocks+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">AAV capsid design: A Goldilocks challenge.</a> Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).</li>
<li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deep+parallel+characterization+of+AAV+tropism+and+AAV-mediated+transcriptional+changes+via+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing.</a> Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).</li>
</ol>

D.G. 是 AaviGen GmbH 的联合创始人。D.G. 和 K.R. 是一项关于生成免疫逃逸型 AAV 衣壳变体的待审专利申请的发明人。其余作者无任何利益冲突需要披露。

本方案概述了用于肽段展示型AAV衣壳工程、条形码标记的AAV文库筛选，以及文库组成和衣壳性能生物信息学分析所需的各个步骤。本方案重点介绍有助于此类文库生物信息学分析的步骤，因为大多数病毒学实验室在编程技能方面落后于其分子生物学技术的熟练程度。这两类文库在文献中已有广泛描述，如引言部分所述，均可相对容易地重现。
首先，概述在 AAV2 可变区 VIII 的第 588 位设计肽段展示文库的方案。该设计（在先前发表的研究中称为 AAV2_Peptide(ii)26）以及所述的克隆方法，可根据近期发表文献中提供的信息26，轻松适配于其他血清型。克隆流程中的一个关键步骤是连接/转化效率（以约 1 × 108 个菌落为阈值）。建议增加一个仅含载体的连接反应作为对照，以帮助确定含有插入片段的细菌菌落比例，该比例应高于 80%。若效率低于预期，即含有插入片段的细菌菌落数量（按插入片段百分比计算）低于寡核苷酸插入片段的理论多样性，则会对低丰度变异体产生不利影响。多种优化措施包括延长消...

基因转导治疗是指将遗传物质导入细胞，以修复、替换或改变细胞内的遗传物质，从而预防、治疗、治愈或改善疾病。基因转导包括体内（in vivo）和体外（ex vivo）两种方式，依赖于不同的递送系统，包括非病毒性和病毒性系统。病毒在自然界中已进化出高效转导靶细胞的能力，因此可被用作递送载体。在基因治疗所采用的多种病毒载体中，腺相关病毒（adeno-associated viruses）因其无致病性、安全性高、免疫原性低，以及最重要的是能够实现长期、非整合性的基因表达，近年来应用日益广泛1,2,3。过去十年中，AAV基因治疗已取得显著进展；已有三种疗法获得欧洲药品管理局和美国食品药品监督管理局批准用于人类3,4。目前还有多项临床试验正在进行中，旨在治疗血友病、肌肉疾病、心脏疾病和神经系统疾病等多种疾病，相关综述已有报道3。尽管该领域已发展数十年，但近年来基因治疗仍遭遇一系列挫折4，其中最严重的是临床试验中出现的死亡病例5，由于剂量限制性毒性问题，部分试验已被暂停，尤其针对肌肉等大体积组织或脑等难以到达的组织时更为突出6。
目前临床试验中使用的AAV载体大多属于天然血清型，仅有少数例外1。AAV工程化为开发具有更优器官或细胞特异性和更高效率的载体提供了可能。在过去二十年中，已有多种方法被成功应用，例如肽段展示、环区替换、衣壳DNA重排、易错PCR以及靶向设计，以生成具有不同特性的单个AAV变体或其文库&#160;7。随后，这些文库会经历多轮定向进化，以筛选出具备理想特性的变体，相关过程已在其他综述中介绍1,3。在所有衣壳进化策略中，肽段展示AAV文库应用最为广泛，因其具有一些独特优势：易于构建，能够实现高多样性及高通量测序，从而便于追踪其进化过程。
首个成功的肽段插入型AAV文库的构建于近20年前被报道。在早期研究中，Perabo等人8 构建了一个修饰的 AAV2 衣壳文库，将一组随机生成的寡核苷酸插入质粒中，插入位置对应于衣壳蛋白 VP1 第 587 位氨基酸，位于衣壳表面三重轴突出区域。通过腺病毒共感染，对该 AAV 文库进行多轮筛选进化，最终获得的重定向变异体被证实能够转导对亲本 AAV2 不敏感的细胞系8随后，Müller 等人9 引入了用于文库构建的两步法系统，这是对原有方案的重要改进。首先，将质粒文库与腺病毒辅助质粒共同转染，以产生包含嵌合衣壳的腺相关病毒（AAV）文库。该AAV穿梭文库以较低的感染复数（MOI）感染细胞，旨在实现每个细胞仅导入一个病毒基因组。通过同时感染腺病毒，确保所产生的AAV具有匹配的基因组与衣壳。9大约十年后，Dalkara10 使用 体内 通过定向进化技术创建7m8变体。该变体含有10个氨基酸的插入序列（LALGETTRPA），其中三个氨基酸作为连接子，在玻璃体内注射后可高效靶向视网膜外层10这种经过工程改造的衣壳是一个极为成功的案例，因为迄今为止，它已成为少数几种成功进入临床应用的工程化衣壳之一11.
随着新一代测序（NGS）技术的引入，该领域迎来了第二次发展推动。Adachi 等人12&#160;于 2014 年和 Marsic 等人13&#160;于&#160;2015 年发表的两篇论文展示了 NGS 在高精度追踪条形码标记的 AAV 衣壳文库分布方面的强大能力。几年后，条形码区域的 NGS 技术被应用于肽插入区域，以追踪衣壳的进化过程。Körbelin 等人14采用 NGS 指导的筛选方法，鉴定出一种靶向肺部的基于 AAV2 的衣壳。NGS 分析有助于计算三个评分指标：筛选轮次之间的富集评分、用于确定组织特异性的总体特异性评分，以及最终的综合评分14。同年，Gradinaru 实验室15发表了基于 Cre 重组酶的 AAV 靶向进化（CREATE）系统，该系统可实现细胞类型特异性筛选。在该系统中，衣壳文库携带一个 Cre 可逆开关，因为 polyA 信号序列两侧被两个 loxP 位点所包围。随后将 AAV 文库注射到表达 Cre 的小鼠体内，仅在 Cre+ 细胞中发生 polyA 信号的反转，从而提供反向 PCR 引物与衣壳基因内正向引物结合的模板。这种高度特异性的 PCR 回收技术使得 AAV-PHP.B 变体得以被鉴定，该变体能够穿越血脑屏障15。该系统进一步发展为 M-CREATE（多重化 CREATE）系统，其中将 NGS 与合成文库构建整合到同一工作流程中16。
Maguire 实验室开发的一种改进的基于 RNA 的&#160;系统版本 iTransduce17，可在 DNA 水平上筛选出能够有效转导细胞并表达其基因组的衣壳。该肽展示文库的病毒基因组包含一个由组成型启动子驱动的 Cre 基因，以及一个由 p41 启动子驱动的衣壳基因。将该文库注射到携带 loxP-STOP-loxP-tdTomato 报告基因小鼠体内后，被 AAV 变体转导并表达病毒基因组（从而表达 Cre）的细胞会表达 tdTomato，结合细胞表面标志物即可进行分选和筛选17。类似地，Nonnenmacher 等人18 和 Tabebordbar 等人19 将衣壳基因文库置于组织特异性启动子的调控之下。在注射至不同动物模型后，利用病毒 RNA 分离出功能性衣壳变体。
另一种方法是使用条形码对衣壳文库进行标记。Björklund 实验室20 采用该方法对肽插入衣壳文库进行条形码标记，并开发了条形码理性腺相关病毒载体进化技术（barcoded rational AAV vector evolution, BRAVE）。在一个质粒中，将Rep2Cap表达盒克隆至反向末端重复序列（inverted terminal repeats, ITR）两侧、表达黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）且带有条形码标签的转基因元件的邻近位置。利用位于末端之间的loxP位点 帽 条形码的起始位置 体外 Cre 重组产生足够小的片段用于二代测序（NGS），从而实现肽段插入与唯一条形码（查找表，LUT）的关联。使用质粒文库进行 AAV 生产，并在 mRNA 中表达的条形码随后被筛选 体内 应用，再次使用NGS20当衣壳文库包含完整衣壳基因的变异体（即重排文库）时，需使用长读长测序技术。多个研究团队已采用条形码对这些多样性文库进行标记，从而实现更高测序深度的下一代测序（NGS）。Kay 实验室21 在衣壳随机重组文库的下游用条形码标记 帽 polyA 信号。首先，构建一个带有条形码的质粒文库，并将随机化衣壳基因文库克隆其中。随后，结合使用 MiSeq（短读长，测序深度较高）和 PacBio（长读长，测序深度较低）的下一代测序技术以及 Sanger 测序，以生成其 LUT212019年，Church实验室的Ogden及其同事22 利用在每个位点包含单点突变、插入和缺失的文库，阐明了AAV2衣壳在多种功能中的适应性，最终实现了机器引导的设计。文库构建过程中，合成了衣壳基因的较短片段，加上条形码标签后进行下一代测序，随后克隆至完整的衣壳基因中。利用NGS数据生成查找表（LUT）。随后仅通过条形码和短读长测序对文库进行筛选，从而实现更高的测序深度22.
条形码文库已占主导地位&#160;用于在经过多轮衣壳文库筛选或独立于衣壳进化研究的情况下，对已知的天然及人工改造变体库进行筛选。此类文库的优势在于可同时筛选多种衣壳，同时减少实验动物使用数量，并最大限度降低个体间变异。首次将该技术引入腺相关病毒（AAV）领域的研究发表于近十年前。Nakai 实验室12 标记了191个AAV9 VP1蛋白第356至736位氨基酸的双丙氨酸突变体，并为每个突变体添加了一对12核苷酸的条形码。利用高通量测序（NGS）对文库进行筛选 体内 用于半乳糖结合及其他特性12Marsic 及其同事使用双条形码分析方法，进一步描绘了 AAV 变体在 1 年后的生物分布情况13一项近期在非人灵长类动物中开展的研究，通过不同递送途径比较了29种衣壳在中枢神经系统中的生物分布23我们实验室近期发表了一项针对183种变异体（包括天然型和工程化AAV）的条形码AAV文库筛选研究。该研究在DNA和RNA水平上的筛选鉴定出一种具有高度嗜肌性的AAV变异体24&#160;在小鼠中以及其他在小鼠脑内表现出高细胞类型特异性的研究中25.
本文描述了本研究中使用的方法，并进一步扩展以涵盖腺相关病毒（AAV）肽展示文库的筛选。该方法包括构建AAV2肽展示文库、采用数字滴定PCR（dd-PCR）进行定量分析，以及最终基于Weinmann及其同事部分研究成果24建立的下一代测序（NGS）分析流程，用于分析AAV变异体。最后，还介绍了在同一研究中条形码标记的AAV文库的构建方法及所使用的NGS分析流程。

<table><tbody><tr><td>扩增引物</td><td>ELLA Biotech (德国慕尼黑)</td><td>-</td><td>寡核苷酸插入片段的第二链合成</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 试剂</td><td>Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉)</td><td>5067-1504</td><td>DNA片段验证</td></tr><tr><td>Agilent 2100 生物分析系统</td><td>Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉)</td><td>G2938C</td><td>DNA片段验证</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>80204</td><td>DNA/RNA提取</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 试剂</td><td>Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉)</td><td>5067-1504</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>Agilent 2100 生物分析系统</td><td>Agilent Technologies (美国加利福尼亚州圣克拉拉)</td><td>G2938C</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>BC-seq fw:&amp;nbsp;</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>ATCACTCTCGGCATGGACGAGC&amp;nbsp;</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>BC-seq rv:&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>GGCTGGCAACTAGAAGGCACA&amp;nbsp;</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Millipore Sigma (美国马萨诸塞州伯灵顿)</td><td>44-420-3250ML</td><td>DNA/RNA提取</td></tr><tr><td>BglI</td><td>New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇)</td><td>R0143</td><td>双链插入片段的消化</td></tr><tr><td>C1000 Touch 热循环仪</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1851196</td><td>dd-PCR热循环仪</td></tr><tr><td>dNTPS&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇)</td><td>N0447S</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>探针用ddPCR预混液（不含dUTP）</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1863024</td><td>dd-PCR预混液</td></tr><tr><td>探针用液滴生成油</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1863005</td><td>dd-PCR液滴生成油</td></tr><tr><td>QX100 / QX200 液滴生成仪用DG8卡盒</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1864008</td><td>dd-PCR液滴生成卡盒</td></tr><tr><td>DG8卡盒支架</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1863051</td><td>dd-PCR卡盒支架</td></tr><tr><td>液滴生成仪DG8密封垫</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1863009</td><td>dd-PCR卡盒盖</td></tr><tr><td>ddPCR 96孔半裙边板</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>12001925</td><td>dd-PCR 96孔板</td></tr><tr><td>E.cloni 10G SUPREME 电转感受态细胞</td><td>Lucigen (美国威斯康星州米德尔顿)</td><td>60081-1</td><td>电转感受态细胞</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿，1mm</td><td>Biozym Scientific (德国奥尔登多夫)</td><td>748050</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>GAPDH引物/探针混合物</td><td>Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)</td><td>Mm00186825_cn</td><td>Taqman qPCR引物</td></tr><tr><td>Genepulser Xcell</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1652660</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)</td><td>4368814</td><td>cDNA反转录</td></tr><tr><td>ITR_fw</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR引物</td></tr><tr><td>ITR_rv</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR引物</td></tr><tr><td>ITR_probe</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)</td><td>dd-PCR探针</td></tr><tr><td>Illumina NextSeq 500 系统</td><td>Illumina Inc (美国加利福尼亚州圣地亚哥)</td><td>SY-415-1001</td><td>NGS文库测序</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*</td><td>Roche AG (瑞士巴塞尔)</td><td>KK2600 07958919001</td><td>NGS样本制备</td></tr><tr><td>MagnaBot 96 磁性分离装置</td><td>Promega GmbH (美国威斯康星州麦迪逊)</td><td>V8151</td><td>NGS文库样本制备</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)</td><td>ND-2000</td><td>双链插入片段的消化</td></tr><tr><td>NGS_frw</td><td>Sigma-Aldrich (美国马萨诸塞州伯灵顿)</td><td>GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC</td><td>NGS引物</td></tr><tr><td>NGS_rev</td><td>Sigma-Aldrich (美国马萨诸塞州伯灵顿)</td><td>CGC CTT GTG TGT TGA CAT C</td><td>NGS引物</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 高输出试剂盒（75个循环）</td><td>Illumina Inc (美国加利福尼亚州圣地亚哥)</td><td>FC-404-2005</td><td>NGS文库测序</td></tr><tr><td>Ovation 低复杂度样本文库系统试剂盒&amp;nbsp;</td><td>NuGEN Technologies, Inc. (美国加利福尼亚州圣卡洛斯)</td><td>9092-256</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>PX1 板封仪&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1814000</td><td>dd-PCR板封仪</td></tr><tr><td>可穿刺铝箔热封膜</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1814040</td><td>dd-PCR封口箔</td></tr><tr><td>Phusion 高保真DNA聚合酶</td><td>Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)</td><td>F530S</td><td>寡核苷酸插入片段的第二链合成</td></tr><tr><td>PEI MAX - 转染级线性聚乙烯亚胺盐酸盐（分子量40,000）</td><td>Polysciences, Inc. (美国宾夕法尼亚州沃灵顿)</td><td>24765-1G</td><td>AAV文库制备</td></tr><tr><td>ProNex 尺寸选择性纯化系统</td><td>Promega GmbH (美国威斯康星州麦迪逊)</td><td>NG2002</td><td>NGS文库样本制备</td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)</td><td>F549L</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Roche AG (瑞士巴塞尔)</td><td>5963117103</td><td>DNA/RNA提取</td></tr><tr><td>pRep2Cap2_PIS</td><td></td><td></td><td>ITR-Rep2Cap2-ITR载体。Cap2开放阅读框内的肽插入位点，由实验室制备/生产&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QX200 液滴生成仪</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1864002</td><td>dd-PCR液滴生成仪</td></tr><tr><td>QX200 液滴读取仪</td><td>Bio-Rad (美国加利福尼亚州赫克力士)</td><td>1864003</td><td>dd-PCR液滴分析</td></tr><tr><td>QIAquick 核苷酸去除试剂盒</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>28306</td><td>寡核苷酸插入片段第二链合成后的纯化</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶提取试剂盒</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>28704</td><td>质粒载体纯化</td></tr><tr><td>QIAGEN 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>12162</td><td>质粒文库DNA制备</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>28104</td><td>NGS文库样本制备</td></tr><tr><td>Qubit 荧光计</td><td>Invitrogen (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)</td><td>Q32857</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fischer Scientific (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)</td><td>Q32851</td><td>NGS文库制备</td></tr><tr><td>QuantiFast PCR 主混合液</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>1044234</td><td>Taqman qPCR</td></tr><tr><td>rep_fw</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC</td><td>dd-PCR引物</td></tr><tr><td>rep_rv</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>CAATCACGGCGCACATGT</td><td>dd-PCR引物</td></tr><tr><td>rep_probe</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1</td><td>dd-PCR探针</td></tr><tr><td>无RNase的DNase</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>79254</td><td>DNA/RNA提取</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇)</td><td>R0123</td><td>载体消化</td></tr><tr><td>5 mm钢珠</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>69989</td><td>DNA/RNA提取</td></tr><tr><td>TRIMER-寡核苷酸</td><td>ELLA Biotech (德国慕尼黑)</td><td>-</td><td>简并寡核苷酸</td></tr><tr><td>T4连接酶</td><td>New England Biolabs (美国马萨诸塞州伊普斯威奇)</td><td>M0202L</td><td>质粒文库连接</td></tr><tr><td>TissueLyserLT</td><td>Qiagen (荷兰芬洛)</td><td>85600</td><td>DNA/RNA提取</td></tr><tr><td>YFP_fw</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>GAGCGCACCATCTTCTTCAAG</td><td>dd-PCR引物</td></tr><tr><td>YFP_rv</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>TGTCGCCCTCGAACTTCAC</td><td>dd-PCR引物</td></tr><tr><td>YFP_probe</td><td>IDT (美国加利福尼亚州圣何塞)</td><td>FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1</td><td>dd-PCR探针</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean &amp; Concentrator-5 (Capped)</td><td>Zymo research (美国加利福尼亚州尔湾)</td><td>D4013</td><td>载体和连接产物纯化</td></tr></tbody></table>

通过腺相关病毒（aav）衣壳变异体的改造、条形码标记与筛选分离下一代基因治疗载体

Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors through Engineering, Barcoding, and Screening of Adeno-Associated Virus (AAV) Capsid Variants

源自腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）的基因递送载体是治疗遗传性疾病最有前景的工具之一，已有多个AAV基因疗法获得批准，并展现出令人鼓舞的临床数据。AAV载体取得成功的主要原因有两个：（i）先前已分离出多种具有不同特性的天然病毒血清型；（ii）随后建立了高效的分子工程技术，可用于高通量地对这些载体进行改造和再利用。近年来，通过在DNA和RNA水平对选定的AAV衣壳进行条形码标记的新策略进一步提升了这些技术的潜力，使得在单个动物体内即可对所有主要器官和细胞类型中的衣壳进行全面且并行的体内分层分析。本文介绍了一套涵盖这些互补途径的基本流程，以AAV肽展示技术为代表，体现当前可用的多种衣壳工程化技术。首先，我们描述了构建AAV肽展示文库的关键步骤，用于体内筛选具有理想特性的候选衣壳；随后演示如何对最具潜力的衣壳变体进行条形码标记，以便开展二次体内筛选。接下来，我们举例说明构建用于下一代测序（NGS）文库的方法，包括条形码扩增和接头连接；最后概述NGS数据分析过程中最关键的步骤。由于本文所报告的实验方案具有良好的通用性和可适配性，研究人员可便捷地利用这些方法，在其偏好的疾病模型中富集最优的AAV衣壳变体，用于基因治疗应用。

AAV2 肽展示文库的构建。作为筛选工程化 AAV 的第一步，本文描述了质粒文库的构建过程。肽插入片段通过使用简并引物进行扩增获得。将密码子组合从 64 种减少至 20 种，其优势在于可消除终止密码子，并通过降低 DNA 水平的文库多样性（而非蛋白质水平）来简化下一代测序（NGS）分析。寡核苷酸插入片段以单链 DNA 形式购买（图 1），随后通过 PCR 反应转化为双链 DNA。该反应的质量通过生物分析仪进行检测。如 图 2 所示，与 10 或 30 个循环相比，3 个循环产生的条带更强。随后使用 BglI 酶切插入片段，产生三核苷酸突出末端。双链插入片段突出序列旁的核苷酸可以是 A 或 T（W 为 A 或 T 的简并碱基代码），该核苷酸位于编码精氨酸（R）或丝氨酸（S）的密码子第三位。载体（pRep2Cap2_PIS）在肽插入位点含有移码突变，导致插入片段缺失时在插入位点下游不远处形成终止密码子，从而阻止衣壳蛋白的表达。对该质粒进行 SfiI 酶切，可产生与肽编码寡核苷酸插入片段相匹...

腺相关病毒肽展示文库的构建，以及通过条形码标记具有新特性的候选病毒，用于下一代腺相关病毒的创制与后续验证。

通过腺相关病毒（AAV）衣壳变异体的改造、条形码标记与筛选分离下一代基因治疗载体

源自腺相关病毒（AAV）的基因递送载体是治疗遗传性疾病最有前景的工具之一，这一点已由……证实

本方案通过实现病毒的工程化改造、多样化和分层，填补了病毒自然进化与其作为人类基因治疗中重组载体应用之间的显著空白。该技术能够对新型、分离获得或工程化改造的腺相关病毒（简称AAV）变体进行高通量并行筛选，从而减少动物使用数量、工作量、成本和时间。所鉴定出的AAV衣壳变体可提高基于AAV的治疗性转基因递送的效率和特异性，进而降低所需的病毒剂量。这可能会提高基因治疗的安全性和适用性。相同的方法也可用于其他基因递送载体的衣壳或启动子工程，从而增进我们对其生物学特性的理解，并提升其在基因治疗中的应用。演示该实验操作的人员包括我实验室的博士生Jonas Becker和Jixin Liu、博士后Joanna Szumska和Margarita Zayas，以及研究助理Emma Gerstmann和Ellen Widtke。首先使用 Python 3 和 Biopython 分析 NGS 测序数据。NGS 分析包含两个步骤。第一步，使用脚本一和提供所需信息的配置文件，在序列文件中搜索满足特定条件（如侧翼序列、长度和位置）的序列。第二步，使用脚本二以及提供所需信息的配置文件和 zuordnung.txt 文件，从 AGWGGC 序列开始翻译提取出的序列。准备两个文件夹：script 和 data。将测序产生的 Gzip 压缩文件复制到数据文件夹中。然后按照文稿中的描述，将 Python 文件和配置文件复制到脚本文件夹中。在运行脚本之前，打开 zuordnung。txt 文件中添加两列以制表符分隔的列。在第一列中输入 Gzip 文件的名称，在第二列中输入期望的最终名称。根据文稿中的描述修改配置文件中的变量。使用特定命令，启动变异序列的检测与提取。输出结果为包含提取出的DNA序列及其读段数量的TXT文件。该文件的头部包含统计信息，这些数据将被传递至后续文件中。这些 TXT 数据将作为第二个脚本的输入文件，用于进行 DNA 序列的翻译、排序和分析。使用特定命令，按照文本手稿中的描述，启动对第一个脚本文本输出文件的 PV 翻译与分析。第二个脚本的输出文件将根据 zuordnung 中查找表的第二列来命名。txt 文件的扩展名取决于分析类型。确保三个输出文件的前几行包含统计信息，并且第一列包含输入文本文件中每条 DNA 序列的索引。其余列应包括 DNA 序列、读段数量、正向或反向读段以及翻译后的肽序列。无效序列在最后两列中应显示为 NA 且标记为无效。根据用户需求，使用可用软件对输出文件进行可视化。为了使用 Python 3 中的自定义代码分析 NGS 测序数据，该工作流程包括根据侧翼序列、长度和位置来检测条形码序列，以及分析条形码在各组织样本中的富集情况和分布情况。准备两个文件夹：script 和 data。将测序产生的 Gzip 压缩文件复制到 data 文件夹中。然后按照文稿中的描述，将 Python 文件和配置文件复制到 script 文件夹中。在执行脚本之前，创建两个以制表符分隔的文本文件：一个为 capsidvariance.txt 文件，其中包含分配给 AAV 衣壳变异体名称的条形码序列；另一个为 contamination.txt 文件，其中包含可能来自污染的条形码序列。最后，编辑配置文件，包含测序数据文件夹路径、条形码侧翼区域序列、其位置以及条形码检测的窗口大小等信息。使用相应命令，结合提供的路径和配置文件执行条形码检测脚本。该命令执行后的输出结果为 TXT 文件，其中包含每个衣壳变异体的计数以及从原始数据中回收的总读段数。为了评估条形码标记的 AAV 衣壳在组织或器官中的分布情况，请在 zuordnung.txt 文件中，将条形码检测运行所获得的每个文本文件的名称分配给相应的组织或器官名称。将文本文件的名称填入第一列，并在以制表符分隔的分配表中填入对应的组织或器官名称。创建一个 organs.txt 文件，其中包含靶器官和非靶器官的名称列表，这些名称需与 assignment zuordnung.txt 文件中给出的名称相对应。然后创建以制表符分隔的文本文件 normalization_organ.txt 和 normalization_variant.txt，其中包含所有衣壳变异体以及所有器官和组织的标准化数值。在第一列的 normalization_organ.txt 文件中，填写每个器官对应的名称，在第二列填写相应组织的标准化数值。填写 normalization_variant 的第一列。包含衣壳名称列表的txt文件，以及第二列中每个衣壳在混合文库中标准化后的读段计数值。通过指定所有附加文件的完整路径来编辑配置文件，并使用特定命令执行条形码分析脚本。条形码分析脚本会输出多个文件，例如基于前述多种标准化步骤生成的不同组织中衣壳分布相对浓度（RC值）的文本文件，以及将文本文件数据整合为合并矩阵数据的电子表格文件。按照文稿中所述方法对矩阵数据进行可视化并执行聚类分析。该脚本将读取 relativeconcentration.xls 文件，并生成两幅图：层次聚类热图和主成分分析图。如需修改图表或PNG参数，请打开R脚本并按照注释部分的说明进行操作。AAV2 rep基因的定量区域显示，99.2%的样本ITR呈阳性，表明AAV衣壳中含有完整的病毒基因组。在所有三组样本中，基于文库特异性特征序列提取的读段约占总读段的94%，表明文库质量良好。其中，超过 99% 为有效的 PV 读段，且超过 99% 的有效 PV 读段是唯一的，表明文库具有高度的内部多样性且分布均衡。热图层级的两个主要分支反映了不同衣壳变体在转导效率上的差异。左侧分支包含了大多数衣壳变体，其中包括在大多数组织中表现出较高相对浓度值的所有衣壳。除了显著的高肝脏特异性外，另外三种衣壳在膈肌、骨骼肌、肱二头肌和脑组织中也表现出特异性。层次聚类的右分支包含整体转导效率较低的衣壳变体，这在十二指肠和胰腺中尤为明显。对原始子集进行的主成分分析形成了具有高肝脏特异性的衣壳变体簇，并凸显了VAR60衣壳在肌肉组织中突出的趋向性。在尝试本方案时，需注意避免输入错误。若使用 Windows 命令提示符与 Linux 系统，其语法亦有所不同。在鉴定出新的 AAV 变体后，需在死亡个体或更大的动物模型中验证其治疗潜力和转化应用价值。该技术能够在相同条件下直接对AAV变异体进行并行比较，具有极高的通用性，为其在大型动物甚至人类中的应用奠定了基础。

isolation-next-generation-gene-therapy-vectors-through-engineering

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

通过工程、条形码和筛选腺相关病毒 （AAV） 衣壳变体分离下一代基因治疗载体

我们展示了通过DNA家族洗牌技术对合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体进行分子设计与定向进化的基本方法。此外，我们还提供了在培养细胞或小鼠中筛选和分析具有增强特性的单个嵌合衣壳的一般性指导原则及代表性实例。...

通过DNA家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内...

基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

本文提供了一种利用细胞工厂中培养的贴壁型HEK 293细胞及亲和层析纯化方法大规模制备研究级腺相关病毒（AAV）载体的详细操作流程。该方案可稳定获得 &gt;1 × 1013 拷贝/mL...

用于大型动物模型临床前研究的腺相关病毒载体在细胞叠层中的生产

本文介绍了一种用于建立和验证良好实验室规范的方案，通过数字液滴式聚合酶链式反应法对人体泪液中的腺相关病毒载体进行合规性检测，以支持基因治疗载体的临床开发。...

一种可验证的微滴数字聚合酶链式反应检测方法用于腺相关病毒载体在泪液生物脱落研究中的检测

重组腺相关病毒（rAAV）被广泛用于临床和临床前基因递送。rAAV 一个尚未受到足够重视的用途是，无需纯化即可高效转导培养细胞。针对初次接触 rAAV...

使用未纯化重组腺相关病毒载体在培养细胞中进行转基因表达

腺相关病毒在悬浮细胞培养中生产，并通过两次碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本方法包含多个步骤，可提高病毒总产量，降低病毒沉淀风险，并进一步浓缩最终病毒产物。预期最终滴度可达 1012 病毒颗粒/mL，适用于临床前的 体内...

用于体内应用的腺相关病毒悬浮培养生产及碘克沙醇密度梯度离心纯化

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

腺相关病毒（AAV）载体基因组拷贝数的精确定量至关重要，但目前尚未建立标准化的实验方案。本方案描述了一种经过验证的方法，用于制备纯化的AAV样品，并通过数字滴定聚合酶链式反应（dd_PCR）可靠地定量病毒基因组滴度。...

通过数字滴定聚合酶链式反应定量纯化载体样品中的腺相关病毒基因组

本方案旨在介绍一种用于制备和纯化间充质干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡仿生体以用于基因治疗的方法。该纳米囊泡由MSC来源的脂双层构成，其腔内包裹有携带目的基因的重组腺相关病毒（AAV）。该纳米囊泡提供了一种增强型的基因递送载体 体内...

用于增强基因递送的间充质干细胞膜包被纳米囊泡的开发

了解腺相关病毒衣壳变体的工程化、条形码标记与高通量筛选方法，用于开发下一代基因治疗载体。该技术可提升AAV递送治疗性转基因的效能与特异性，降低所需病毒剂量，从而改善基因治疗的安全性与适用性。

通过腺相关病毒（AAV）衣壳变异体的改造、条形码标记与筛选分离下一代基因治疗载体

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