利用荧光素酶转导的人源T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞迁移

该方法可让用户轻松在活体内追踪T细胞，以评估其归巢动力学并监测T细胞的持续存在情况。该技术的主要优势在于，可在同一动物个体上于多个时间点重复进行，而无需通过流式细胞术或免疫组织化学方法处死动物。该技术也可经修改后用于追踪其他类型的免疫细胞。

培养293T细胞时，通过加入110毫升热灭活的胎牛血清和11毫升青霉素-链霉素，配制一升DMEM培养基。解冻5 × 10⁶个293T细胞，并将其转移至含有DMEM的T175培养瓶中。每三天以1:10的比例传代一次，连续六天，直至细胞融合度超过90%。

转染时，使用移液器将1.5毫升培养基转移至两个50毫升离心管中。向其中一管加入10微克VSVG质粒、20微克gag pol质粒以及20微克萤光甲虫红色TDtomato或CBRTDR荧光素酶质粒，并混匀。向另一管加入100微升DNA体外转染试剂，并混匀。

将两个试管在室温下孵育5分钟。将含有DNA的体外转染试剂逐滴加入含有DNA质粒的试管中，用移液器轻轻混匀。室温孵育20分钟。

孵育期间，加入5至10毫升0.05%胰蛋白酶使293T细胞脱落。待细胞脱落后，加入10毫升培养基，于800 ×g离心5分钟。用1.5毫升培养基重悬细胞。

将含有DNA体外转染试剂和DNA质粒的培养基加入293T细胞中，于37摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，将细胞悬液转移至T175培养瓶中，加入18毫升培养基，于37摄氏度过夜孵育。

第二天，用玻璃移液管小心吸除培养基，注意不要使细胞脱落，并更换为18毫升新鲜培养基。再次于37摄氏度下孵育过夜。第三天，用移液管吸取病毒上清液并置于冰上，于800 G离心5分钟，以沉淀细胞和碎片。

使用0.22微米滤器过滤病毒上清液，并立即置于冰上。体外激活人T细胞时，向无菌的15毫升离心管中加入10毫升含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和2毫摩尔EDTA的PBS。然后，为洗涤磁珠，将磁珠加入离心管中，并将离心管置于磁力架上。

两分钟后，从管中移除 PBS。配制 DMEM 后，加入洗涤过的磁珠以及白细胞介素-2（IL-2），使其终浓度为每毫升 30 国际单位。使用血细胞计数板和台盼蓝染色对 T 细胞进行计数。

计数后，将所需数量的T细胞加入培养基中，轻轻颠倒试管以混匀。在24孔组织培养板的每个孔中接种含有两百万个T细胞、磁珠和IL-2的2.5毫升培养基。在37°C、含5%二氧化碳的湿润环境中培养。

每天使用 20 倍物镜观察 T 细胞，连续观察三天，以确定何时用荧光素酶进行转导。接下来，为制备 RetroNectin 包被板，向未经处理的六孔板的一个孔中加入 2 毫升含 20 微克/毫升 RetroNectin 的 PBS 溶液，在室温下孵育 2 小时。吸除 RetroNectin 溶液时注意不要刮伤板底，然后向六孔板每孔加入 3 毫升含 2% BSA 的 PBS 溶液。

室温孵育30分钟。接着进行离心接种：吸除BSA，用3毫升PBS洗涤各孔一次。继续实验或更换新鲜PBS，将培养板加盖后于4摄氏度过夜放置。

第二天，每孔加入两毫升 CBRTDR 荧光素酶病毒上清液，在 32 摄氏度下以 1,240 ×g 离心 90 分钟。进行转导时，计数 T 细胞后，吸除病毒上清液，将两百万个 T 细胞接种至每孔六毫升含有人类 IL-2（30 国际单位/毫升）的 DMEM 培养基中。培养 T 细胞并观察两天。

当细胞接近完全融合时，用移液管轻轻将细胞从培养板底部吹下，并将每孔细胞转移至单独的 T75 培养瓶中。每瓶加入 9 毫升培养基，使总体积达到 15 毫升。次日，每瓶再加入 15 毫升培养基，并通过流式细胞术检测以确认转导成功。

将小鼠麻醉后，使用26号针头在100微升培养基中通过眶后途径注射2000万T细胞。皮下给予1,000单位重组IL-2，以支持T细胞在体内的存活。随后通过眶后或腹腔途径给予双特异性抗体。

进行活体成像时，使用26号针头通过眶后注射向麻醉小鼠体内注入100微升含3毫克D-荧光素酶底物（D-luciferin）的溶液。为获取图像，将小鼠置于成像仪的避光暗室中，使携带异种移植瘤的侧腹朝上正对相机。在图像采集控制面板中，选择生物发光、拍照及叠加模式。

将曝光时间设为自动，二分之一合并（binning）设为中等，光圈值设为1，并采集图像。在获取第一幅图像后，将曝光时间调整为第一幅图像自动计算出的值，以便后续图像可直接进行比较。另采集一组小鼠仰卧位的图像，以评估肺部T细胞的存在情况。

武装T细胞比未武装T细胞更快地迁移至肿瘤，离开肺部的时间早了两天。通过生物发光法对随时间推移T细胞浸润肿瘤的情况进行定量，以整合肿瘤轮廓内的每像素总簇数或辐射量表示。在转导荧光素酶的T细胞注射后，可对T细胞迁移情况进行长达28天的监测，从而实现对T细胞归巢及治疗期间持续存在的追踪。

展示了T细胞向DKO小鼠体内HER2阳性人源乳腺癌患者来源异种移植瘤的迁移情况。与对照组双特异性抗体相比，使用未沉默FC段的HER2双特异性抗体治疗对肿瘤生长无影响。相反，使用携带N297A突变或联合K322A突变的HER2双特异性抗体治疗则能够完全抑制肿瘤生长。

对于携带沉默突变的组别，T细胞的发光信号在注射后第三天达到更高的峰值，并且维持在较对照双特异性抗体和未沉默的HER2双特异性抗体更高的水平。携带神经母细胞瘤患者来源异种移植瘤的小鼠中，Ly6C阳性巨噬细胞的耗竭显著增强了T细胞向肿瘤的归巢，从而抑制肿瘤生长并延长生存期。该效应在骨肉瘤患者来源异种移植瘤中更为显著。

在靶向肿瘤抗原STEAP1的双特异性抗体中，IGGL SCFV形式在首次给予T细胞后第六天显著增加了T细胞的浸润，且这种浸润在整个治疗期间持续存在。此类现象无法通过体外细胞毒性实验预测。在体内追踪T细胞后，使用者仍可进行免疫组织化学分析，以更精确地确定T细胞在肿瘤内或其他正常组织中的具体位置。