Name: 使用荧光素酶转导的人T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞运输 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 了解利用荧光素酶转导人T细胞以实时追踪其在体内向肿瘤迁移的方法。该技术可重复监测T细胞归巢动力学和持久性，无需牺牲动物，适用于评估双特异性抗体的抗肿瘤疗效。

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作者谨此感谢 Vladimir Ponomarev 博士分享了本文代表性结果部分所述实验中所用的荧光素酶载体。

以下程序已由纪念斯隆-凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会评估并批准。
1. 用荧光素酶转染293T细胞并收集病毒上清液
<ol>
	<li>293T 细胞的培养
	<ol>
		<li>向每升 DMEM 培养基中加入 110 mL 热灭活胎牛血清（FBS）和 11 mL 青霉素-链霉素，配制完全培养基。</li>
		<li>将 5 × 106 个 293T 细胞解冻后，转移至含有上述配制培养基的 T175 培养瓶中。</li>
		<li>每 3 天按 1:10 比例传代一次，共传代 6 天。注意细胞融合度不要超过 90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>293T 细胞的转染 
	注意：以下试剂用量是针对一个 T175 培养瓶的 293T 细胞计算的。若需转染更多培养瓶，请相应调整用量。
	<ol>
		<li>用移液器将 1.5 mL 培养基分别加入两个 50 mL 离心管中。在其中一个管中加入 10 µg VSV-G 质粒、20 µg Gag/pol 质粒和 20 µg 红色甲虫荧光素酶（CBR-TDR）质粒，混匀；在另一管中加入 100 µL DNA in vitro 转染试剂，混匀。两管均在室温（RT）孵育 5 分钟。 
		注意：本研究中所用的所有质粒均由 Vladimir Ponomarev 博士提供。</li>
		<li>将含有 DNA in vitro 转染试剂的培养基逐滴加入含 DNA 质粒的管中（约 30 秒内加完），用移液器轻轻混匀。室温孵育 20 分钟。</li>
		<li>在上述 20 分钟孵育期间，加入 5–10 mL 0.05% 胰蛋白酶使 293T 细胞脱落。细胞脱落后，加入 10 mL 培养基，于 800 × g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 1.5 mL 培养基中。</li>
		<li>将含有 DNA in vitro 转染试剂和 DNA 质粒的混合液加入 293T 细胞悬液中，37 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>将细胞转移至 T175 培养瓶，加入 18 mL 培养基。37 °C 过夜孵育。</li>
		<li>次日，用玻璃移液管小心吸除培养基，避免细胞脱落。更换为 18 mL 新鲜培养基，置于 37 °C 培养箱中过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒上清液的收集
	<ol>
		<li>用移液器收集病毒上清液并置于冰上。在 800 × g 条件下离心 5 分钟，以沉淀细胞和碎片。 
		注意：若细胞沉淀量较大，可能是收集上清时细胞从培养瓶脱落所致。这些细胞可重新接种于新的培养瓶中，并加入新鲜培养基继续培养。</li>
		<li>使用 0.22 µm 滤器过滤病毒上清液。</li>
		<li>立即使用病毒上清液。如需短期保存，可置于冰上或 4 °C 不超过 24 小时；如需长期保存，应于 -80 °C 冻存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 活化人T细胞的扩增及其与荧光素酶的转导
<ol>
	<li>人T细胞的活化 体外
	<ol>
		<li>向无菌15 mL离心管中加入10 mL含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS），加入磁珠（每两个T细胞加一粒磁珠），置于磁力架上2分钟，吸除PBS，以洗涤磁珠。</li>
		<li>按照步骤1.1.1所述配制培养基，然后加入IL-2至终浓度为30 IU/mL，并加入洗涤后的磁珠。每激活两百万个T细胞，配制2.5 mL培养基。</li>
		<li>使用血细胞计数板和台盼蓝染色法计数T细胞（新鲜纯化或先前纯化、冻存、解冻并洗涤的T细胞）。将T细胞加入步骤2.1.2中制备的培养基中，轻轻颠倒混匀试管。T细胞将至少扩增20倍，具体扩增倍数取决于细胞来源及其总体健康状况。通过计算处理小鼠所需的T细胞数量并除以20，确定需激活的T细胞数量。本实验中，根据预实验结果，每只小鼠使用20 × 10⁶个T细胞。</li>
		<li>在24孔组织培养板的每个孔中加入含有两百万个T细胞、磁珠和IL-2的2.5 mL培养基。于37 °C、湿润、5% CO₂条件下培养2 培养箱</li>
		<li>接下来3天内每天使用20倍显微镜观察T细胞，以确定转导荧光素酶的最佳时机。当细胞聚集成团并消耗培养基，使其颜色由红色/粉红色变为浅橙色时，表明细胞已准备就绪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备逆转录病毒结合蛋白包被板 
	注意：在转导过程中，使用Retronectin包被培养板，因其可增强基因转导效率15.
	<ol>
		<li>向未经处理的6孔板的每个孔中加入2 mL PBS配制的20 µg/mL逆转录病毒结合蛋白（retronectin）溶液。室温孵育2小时，或37 °C孵育1小时。每两百万个待转导的T细胞需要一个retronectin包被的孔。</li>
		<li>吸除 retronectin 时，避免刮擦培养板底部。</li>
		<li>在6孔板中每孔加入3 mL含2% BSA的PBS（经无菌过滤），室温孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离心接种法
	<ol>
		<li>吸出BSA溶液时，避免刮擦培养板底部。</li>
		<li>用每孔 3 mL PBS 洗涤一次。继续孵育或更换新鲜 PBS，将酶标板盖好后于 4 °C 过夜保存。</li>
		<li>每孔加入 2 mL CBR-TDR 荧光素酶病毒上清液（于步骤 1.3 中收集）。</li>
		<li>以 1,240 x 离心 g 32 °C 下孵育 90 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转导
	<ol>
		<li>计数T细胞。</li>
		<li>吸弃病毒上清，注意不要刮擦培养板底部。</li>
		<li>每孔接种两百万个T细胞至6 mL含30 IU/mL人IL-2的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。</li>
		<li>每天观察T细胞。当T细胞接近汇合时即可进行扩增，通常在培养2天后。</li>
		<li>当细胞接近汇合时，用移液管轻轻将细胞从培养板底部吹下，并将每孔细胞转移至单独的T75培养瓶中。每瓶加入9 mL培养基，使总体积达到15 mL。</li>
		<li>第二天，再加入15 mL培养基。加入培养基后的次日，细胞即可用于注射小鼠。通过流式细胞术检测转导效率（荧光素酶载体包含一种TD番茄荧光蛋白，可在PE通道中观察到）16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 荧光素酶转导T细胞在免疫缺陷小鼠体内的植入
<ol>
	<li>制备并计数用于注射的T细胞。
	<ol>
		<li>从培养瓶中取出T细胞并进行计数。当细胞扩增至20至30倍时即可用于注射，通常在激活后的第7天达到此状态。</li>
		<li>将T细胞在800 x g条件下离心 g 孵育5分钟。加入2 mL培养基重悬，使用磁力架去除磁珠。</li>
		<li>对于需要将T细胞与双特异性抗体分别注射的实验，计数T细胞并重悬，使最终浓度为每100 µL培养基中含有2000万T细胞。跳至步骤3.2。对于使用 离体 武装的T细胞（EATs），跳至步骤3.1.4。</li>
		<li>对于使用以下条件的实验 离体 武装T细胞后，对T细胞进行计数，并按每组每只小鼠2000万个细胞的量分装至各自的1.5 mL离心管中。例如，若共有三组，每组五只小鼠，则准备三个1.5 mL离心管，每管含1亿个T细胞。</li>
		<li>将1.5 mL离心管在800 x g 孵育5分钟。小心移除上清液，避免扰动T细胞沉淀。用不超过50 µL含双特异性抗体的培养基重悬细胞。室温孵育30分钟。 
		注意：本研究实验所用的是实验室制备的特异性IgG-[L]-scFv T细胞结合双特异性抗体。进行T细胞武装时，每20 × 10⁶个细胞使用5 µg抗体。6 T细胞。也可使用市售的双特异性抗体。</li>
		<li>加入 1,450 µL 培养基至每根试管以洗去多余的抗体。在 800 x g 孵育5分钟后，小心吸除培养基，并将细胞重悬于每100 µL培养基中含2000万个武装T细胞的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射与移植至小鼠体内
	<ol>
		<li>在充满3.5%（v/v）异氟烷与1 L/min氧气混合气体的麻醉舱中对小鼠进行麻醉。当小鼠后肢足底回缩反射消失时，表明其已完全麻醉。 
		注意：&#160;在整个操作过程中提供热支持。</li>
		<li>使用26 G针头，每只小鼠经眶后静脉注射2000万T细胞，体积为100 µL培养基。</li>
		<li>皮下注射 1,000 U 重组 IL-2 以支持 T 细胞存活 体内.</li>
		<li>将双特异性抗体经眶后注射（注入未用于T细胞注射的眼部）或腹腔注射。让小鼠从麻醉中恢复并放回笼中。 
		&#8203;注意：此处再次使用了实验室自主研发的专有抗体，但也可使用市售抗体替代。本实验中，每只小鼠每次给药剂量为 0.3–10 µg 抗体，每周给药两次，持续 3–4 周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在体 表达荧光素酶的T细胞移植小鼠的成像
注意：此步骤应在成像当天进行，而成像当天不一定是将T细胞和/或抗体给予小鼠的当天。通常，我们在将荧光素酶转导的T细胞给予小鼠后24小时进行成像。
<ol>
	<li>D-荧光素的制备
	<ol>
		<li>将1 g D-荧光素溶解于33.3 mL无菌PBS中（终浓度：30 mg/mL）。</li>
		<li>将溶解后的D-荧光素分装至33个1.5 mL微量离心管中，每管1 mL，并将离心管保存于-20 °C。</li>
		<li>成像当天，根据待成像动物数量解冻足够量的30 mg/mL D-荧光素。每管可供10只动物使用。 
		注意：使用后应将剩余的D-荧光素重新冻存。D-荧光素在至少五次冻融循环中保持稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向小鼠给药D-荧光素 
	注意：在向小鼠注射D-荧光素前，应打开成像软件并初始化系统。相机冷却可能需要数分钟，因此应在小鼠注射D-荧光素前完成此步骤，以确保在底物给药后5分钟内开始成像。
	<ol>
		<li>将最多五只小鼠置于麻醉室中，使用1 L/min氧气携带3.5%（v/v）异氟烷进行吸入麻醉。当小鼠后肢足底回缩反射消失时，表明已完全麻醉。</li>
		<li>小鼠完全麻醉后，使用26 G针头经眶后静脉注射每只小鼠100 µL 30 mg/mL D-荧光素（每只小鼠3 mg）。在对下一组小鼠给药前，先完成本组小鼠的成像。在对前一组小鼠成像的同时，将下一组小鼠放入异氟烷麻醉室进行麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像荧光素酶转导的T细胞
	<ol>
		<li>将麻醉后的小鼠转移至成像仪的避光暗室中，继续以0.5 L/min流速供给3%异氟烷维持麻醉。将小鼠侧卧放置，使携带异种移植瘤的一侧 flank 朝上对准相机。另取仰卧位拍摄一组图像，用于评估T细胞在肺部的分布情况。</li>
		<li>在采集控制面板中选择生物发光、拍照和叠加模式。将曝光时间设为自动，binning设为中等，光圈值（F/Stop）设为1，开始采集图像。首次成像后，将后续图像的曝光时间设定为与首次自动计算出的时间一致，以便直接比较不同图像。为确定在不引起像素饱和的前提下获得最强信号的最佳曝光时间，可尝试采集多个不同曝光时间的图像。</li>
		<li>成像结束后，将小鼠撤离异氟烷，放回笼中，并观察至其清醒并能自主活动。</li>
		<li>重复步骤4.2.1至4.2.4，直至所有组别均完成成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

NKC 报告从 Y-mAbs Therapeutics 获得商业研究资助。NKC 是由 MSK 授权给 Y-mAbs Therapeutics、Biotec Pharmacon/Lallemand 和 Abpro-labs 的已授权专利的发明人和所有者。MSK 和 NKC 在 Y-mAbs 中拥有经济利益。NKC 报告从 Eureka Therapeutics 获得股票期权。HFG 和 MEC 无相关披露信息。

尽管靶向T细胞的双特异性抗体（T-BsAb）药物博纳吐单抗（blinatumomab）已获批用于CD19阳性血液系统恶性肿瘤，但T-BsAb在实体瘤中的成功应用却困难得多。卡妥索单抗（catumaxomab）是一种靶向上皮细胞黏附分子（EPCAM）的T-BsAb，曾获批用于卵巢癌患者恶性腹水的治疗，但此后因商业原因停止生产。19目前尚无其他T细胞双特异性抗体（T-BsAbs）被批准用于实体瘤，这凸显了此类疗法所面临的挑战。细胞因子释放综合征（CRS）导致的毒性是常见问题，尽管可通过糖皮质激素和细胞因子抑制剂进行管理。除毒性外，T-BsAbs在实体瘤临床试验中普遍存在疗效不足的问题。诱导T细胞向肿瘤部位迁移并长期存留已被证明十分困难，这可能归因于肿瘤微环境（TME）中多种免疫抑制因素的影响。14然而，即使在临床前阶段，一种表现良好的T-BsAb为何有效也常常不明确 体外 无法有效治疗肿瘤 体内.
T细胞追踪方法 体内 实时监测本文所述的...

T细胞结合型双特异性抗体（T-BsAbs）是一类经过工程化设计的抗体，通过一个结合臂与T细胞结合，另一个结合臂与肿瘤抗原结合，从而赋予多克隆T细胞人工特异性。该技术已成功应用于血液系统肿瘤（靶向CD19的贝林妥欧单抗1），目前还有多种T-BsAbs正处于针对多种实体瘤的临床前和临床研发阶段2。T-BsAbs以主要组织相容性复合体（MHC）非依赖的方式激活多克隆T细胞，因此即使下调人类白细胞抗原（HLA）表达的肿瘤也对此类疗法敏感3,4。T-BsAbs已开发出数十种不同结构形式，在T细胞和肿瘤结合臂的价态、空间排列、结构域间距离以及是否包含Fc结构域等方面存在差异，其中Fc结构域的存在会影响抗体半衰期，并可能诱导效应功能5。本实验室先前的研究表明，这些因素显著影响T-BsAbs的抗肿瘤疗效，其效力差异可达1000倍6。通过上述研究，我们确定IgG-[L]-scFv结构为T-BsAbs的理想平台（有关T-BsAb结构的更多细节请参见代表性结果部分），并已将该平台应用于包括GD2（神经母细胞瘤）、HER2（乳腺癌和骨肉瘤）、GPA33（结直肠癌）、STEAP1（尤文肉瘤）、CD19（B细胞恶性肿瘤）和CD33（B细胞恶性肿瘤）在内的多个靶点7,8,9,10,11,12,13。
在实体瘤中成功实施T细胞双特异性抗体（T-BsAb）治疗的主要挑战之一是克服免疫抑制性肿瘤微环境（TME），以促进T细胞向肿瘤部位的迁移14上述影响T-BsAb疗效的因素对T细胞向肿瘤归巢的能力具有显著影响，但这种效应在体外难以评估 体内 系统进行实时监测。本论文详细描述了在临床前研究中使用转导荧光素酶的T细胞评估双特异性T细胞衔接抗体（T-BsAbs）治疗过程中T细胞向免疫缺陷小鼠模型不同组织迁移的方法。该方法的总体目标是提供一种手段，用于评估T细胞在肿瘤及其他组织中的浸润情况，同时实时获取T细胞归巢动力学及其存续时间的信息，而无需在治疗过程中处死动物。对于越来越多专注于细胞免疫治疗的研究人员而言，能够追踪T细胞 体内 在临床前动物模型中至关重要。我们旨在提供所采用的荧光素酶转导T细胞追踪方法的详尽、细致描述，以便其他研究人员能够轻松地复制该技术。

<table><tbody><tr><td>293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 磁珠</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11161D</td><td></td></tr><tr><td>D-萤光素钾盐</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>体外 DNA 转染试剂（polyjet）</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Gag/pol 质粒</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>GFP 质粒</td><td>Addgene</td><td>11150-DNA.cg</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G 质粒</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光素酶转导的人源t细胞追踪双特异性抗体诱导的t细胞迁移

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

T细胞靶向性双特异性抗体（T-BsAbs）目前正处于针对实体瘤的临床前开发和临床试验的不同阶段。其抗肿瘤疗效常受到多种因素影响，例如抗体的价态、空间构型、结构域间距离以及Fc区突变，这些因素主要通过影响T细胞向肿瘤部位的归巢能力发挥作用，而T细胞归巢仍是当前面临的主要挑战之一。本文介绍一种将荧光素酶转导至活化人源T细胞的方法，从而实现 体内 在T-BsAb治疗研究中对T细胞进行追踪。可在治疗过程中的多个时间点定量评估T-BsAb将T细胞重定向至肿瘤的能力，使研究人员能够将T-BsAb及其他干预措施的抗肿瘤疗效与T细胞在肿瘤中的持续存在相关联。该方法避免了在治疗期间为通过组织学评估T细胞浸润而牺牲动物的需要，并可在多个时间点重复检测，以确定治疗期间及治疗后T细胞迁移的动力学特征。

如步骤4.3所述，成像过程中可将小鼠置于不同体位，以评估不同组织中T细胞的存在情况。仰卧位便于评估注射后早期常见于肺部的T细胞。将小鼠侧卧、皮下异种移植瘤朝上，可最佳观察T细胞向肿瘤部位的迁移。雌性C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug本研究中所有实验均使用 JicTac 小鼠。 图1 显示了一项实验的图像，该实验中携带GD2阳性异种移植瘤的小鼠接受了转导荧光素酶的T细胞治疗 ex 体内分别注射GD2 BsAb或荧光素酶转导的T细胞与GD2 BsAb17. 图1A 表明武装T细胞向肿瘤迁移的速度快于未武装T细胞（图1B，使肺部提前2天恢复。 图1C 展示了该现象的定量分析结果。 图1E...

在此，我们介绍一种将荧光素酶转导至人T细胞的方法，以促进 体内 在评估T细胞结合型双特异性抗体抗肿瘤疗效及作用机制的研究中，对双特异性抗体诱导的T细胞向肿瘤迁移的追踪

利用荧光素酶转导的人源T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞迁移

靶向T细胞的双特异性抗体（T-BsAbs）目前正处于针对实体瘤的临床前研发和临床试验的不同阶段。影响其疗效的因素包括……

该方法可让用户轻松在活体内追踪T细胞，以评估其归巢动力学并监测T细胞的持续存在情况。该技术的主要优势在于，可在同一动物个体上于多个时间点重复进行，而无需通过流式细胞术或免疫组织化学方法处死动物。该技术也可经修改后用于追踪其他类型的免疫细胞。培养293T细胞时，通过加入110毫升热灭活的胎牛血清和11毫升青霉素-链霉素，配制一升DMEM培养基。解冻5 × 10⁶个293T细胞，并将其转移至含有DMEM的T175培养瓶中。每三天以1:10的比例传代一次，连续六天，直至细胞融合度超过90%。转染时，使用移液器将1.5毫升培养基转移至两个50毫升离心管中。向其中一管加入10微克VSVG质粒、20微克gag pol质粒以及20微克萤光甲虫红色TDtomato或CBRTDR荧光素酶质粒，并混匀。向另一管加入100微升DNA体外转染试剂，并混匀。将两个试管在室温下孵育5分钟。将含有DNA的体外转染试剂逐滴加入含有DNA质粒的试管中，用移液器轻轻混匀。室温孵育20分钟。孵育期间，加入5至10毫升0.05%胰蛋白酶使293T细胞脱落。待细胞脱落后，加入10毫升培养基，于800 ×g离心5分钟。用1.5毫升培养基重悬细胞。将含有DNA体外转染试剂和DNA质粒的培养基加入293T细胞中，于37摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，将细胞悬液转移至T175培养瓶中，加入18毫升培养基，于37摄氏度过夜孵育。第二天，用玻璃移液管小心吸除培养基，注意不要使细胞脱落，并更换为18毫升新鲜培养基。再次于37摄氏度下孵育过夜。第三天，用移液管吸取病毒上清液并置于冰上，于800 G离心5分钟，以沉淀细胞和碎片。使用0.22微米滤器过滤病毒上清液，并立即置于冰上。体外激活人T细胞时，向无菌的15毫升离心管中加入10毫升含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和2毫摩尔EDTA的PBS。然后，为洗涤磁珠，将磁珠加入离心管中，并将离心管置于磁力架上。两分钟后，从管中移除 PBS。配制 DMEM 后，加入洗涤过的磁珠以及白细胞介素-2（IL-2），使其终浓度为每毫升 30 国际单位。使用血细胞计数板和台盼蓝染色对 T 细胞进行计数。计数后，将所需数量的T细胞加入培养基中，轻轻颠倒试管以混匀。在24孔组织培养板的每个孔中接种含有两百万个T细胞、磁珠和IL-2的2.5毫升培养基。在37°C、含5%二氧化碳的湿润环境中培养。每天使用 20 倍物镜观察 T 细胞，连续观察三天，以确定何时用荧光素酶进行转导。接下来，为制备 RetroNectin 包被板，向未经处理的六孔板的一个孔中加入 2 毫升含 20 微克/毫升 RetroNectin 的 PBS 溶液，在室温下孵育 2 小时。吸除 RetroNectin 溶液时注意不要刮伤板底，然后向六孔板每孔加入 3 毫升含 2% BSA 的 PBS 溶液。室温孵育30分钟。接着进行离心接种：吸除BSA，用3毫升PBS洗涤各孔一次。继续实验或更换新鲜PBS，将培养板加盖后于4摄氏度过夜放置。第二天，每孔加入两毫升 CBRTDR 荧光素酶病毒上清液，在 32 摄氏度下以 1,240 ×g 离心 90 分钟。进行转导时，计数 T 细胞后，吸除病毒上清液，将两百万个 T 细胞接种至每孔六毫升含有人类 IL-2（30 国际单位/毫升）的 DMEM 培养基中。培养 T 细胞并观察两天。当细胞接近完全融合时，用移液管轻轻将细胞从培养板底部吹下，并将每孔细胞转移至单独的 T75 培养瓶中。每瓶加入 9 毫升培养基，使总体积达到 15 毫升。次日，每瓶再加入 15 毫升培养基，并通过流式细胞术检测以确认转导成功。将小鼠麻醉后，使用26号针头在100微升培养基中通过眶后途径注射2000万T细胞。皮下给予1,000单位重组IL-2，以支持T细胞在体内的存活。随后通过眶后或腹腔途径给予双特异性抗体。进行活体成像时，使用26号针头通过眶后注射向麻醉小鼠体内注入100微升含3毫克D-荧光素酶底物（D-luciferin）的溶液。为获取图像，将小鼠置于成像仪的避光暗室中，使携带异种移植瘤的侧腹朝上正对相机。在图像采集控制面板中，选择生物发光、拍照及叠加模式。将曝光时间设为自动，二分之一合并（binning）设为中等，光圈值设为1，并采集图像。在获取第一幅图像后，将曝光时间调整为第一幅图像自动计算出的值，以便后续图像可直接进行比较。另采集一组小鼠仰卧位的图像，以评估肺部T细胞的存在情况。武装T细胞比未武装T细胞更快地迁移至肿瘤，离开肺部的时间早了两天。通过生物发光法对随时间推移T细胞浸润肿瘤的情况进行定量，以整合肿瘤轮廓内的每像素总簇数或辐射量表示。在转导荧光素酶的T细胞注射后，可对T细胞迁移情况进行长达28天的监测，从而实现对T细胞归巢及治疗期间持续存在的追踪。展示了T细胞向DKO小鼠体内HER2阳性人源乳腺癌患者来源异种移植瘤的迁移情况。与对照组双特异性抗体相比，使用未沉默FC段的HER2双特异性抗体治疗对肿瘤生长无影响。相反，使用携带N297A突变或联合K322A突变的HER2双特异性抗体治疗则能够完全抑制肿瘤生长。对于携带沉默突变的组别，T细胞的发光信号在注射后第三天达到更高的峰值，并且维持在较对照双特异性抗体和未沉默的HER2双特异性抗体更高的水平。携带神经母细胞瘤患者来源异种移植瘤的小鼠中，Ly6C阳性巨噬细胞的耗竭显著增强了T细胞向肿瘤的归巢，从而抑制肿瘤生长并延长生存期。该效应在骨肉瘤患者来源异种移植瘤中更为显著。在靶向肿瘤抗原STEAP1的双特异性抗体中，IGGL SCFV形式在首次给予T细胞后第六天显著增加了T细胞的浸润，且这种浸润在整个治疗期间持续存在。此类现象无法通过体外细胞毒性实验预测。在体内追踪T细胞后，使用者仍可进行免疫组织化学分析，以更精确地确定T细胞在肿瘤内或其他正常组织中的具体位置。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

使用荧光素酶转导的人T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞运输

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。...

移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

本视频展示了一种在小鼠模型中追踪双特异性抗体诱导T细胞向肿瘤迁移的方法。将经荧光素酶转导的效应T细胞注射到皮下移植肿瘤异种移植物的小鼠体内。随后引入双特异性抗体，使其同时结合T细胞和肿瘤细胞。通过生物发光成像追踪T细胞的定位，信号强度反映T细胞浸润肿瘤的程度。...

一种体内追踪双特异性抗体诱导T细胞向肿瘤迁移的技术

我们介绍一种活细胞成像方法，可揭示T细胞活化过程中蛋白质的动态变化。我们展示了T细胞铺展实验、共聚焦显微镜与成像分析相结合的使用方法，以获得定量结果，用于追踪T细胞活化全过程中的信号复合物形成。...

T细胞信号复合体形成的实时活体成像

我们介绍一种用于监测非黏附性免疫细胞径向迁移能力的实验方案 体外 使用细胞沉降多联管/载玻片装置，在肿瘤细胞单层或细胞外基质蛋白上追踪细胞迁移。通过明场显微镜和荧光显微镜观察，可评估细胞运动性及细胞毒性功能。...

逆转录病毒复制载体转导的非黏附性同种反应性T淋巴细胞的径向迁移能力与细胞毒性功能

在完成制备后 64铜修饰的单克隆抗体结合转基因小鼠T细胞受体，T细胞被放射性标记...

小鼠淋巴细胞标记 64铜-抗体受体靶向 在体实验 细胞迁移的PET/CT成像

用于定量评估淋巴细胞趋化性和迁移性的实验方案是免疫学研究中的重要工具。此处，一个 体外 该方案可实现对细胞迁移进行实时、多重评估，以及一种互补的 体内...

量化人单核细胞趋化性 体外 和小鼠淋巴细胞迁移 体内

本文介绍了一种通过逆转录病毒转导法生产小鼠CD19 CAR T细胞并进行临床前测试的实验方案，用于治疗经建立的同系A20...

一种用于CD19 CAR T细胞临床前评估的同源小鼠B细胞淋巴瘤模型

本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内...

动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

本方案提供了一种原代小鼠T细胞分离的方法，以及在特定环境条件下对T细胞迁移进行延时显微成像并进行定量分析的技术。...

原代小鼠CD8+ T细胞的实时体外迁移实验

我们提出了改进的逆转录病毒转导技术，用于研究受体介导的淋巴细胞在器官和特定微环境中的定位，结合竞争性归巢实验分析。该方法可深入揭示免疫细胞迁移机制，并在未来的基础研究和治疗研究中具有广阔的应用前景。...

高效逆转录病毒转导与竞争性归巢用于研究G蛋白偶联受体介导的T细胞在多种组织微环境中的定位

了解利用荧光素酶转导人T细胞以实时追踪其在体内向肿瘤迁移的方法。该技术可重复监测T细胞归巢动力学和持久性，无需牺牲动物，适用于评估双特异性抗体的抗肿瘤疗效。

利用荧光素酶转导的人源T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞迁移

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