Name: 一种基于流式细胞术的高通量技术筛选整合素抑制药物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 15 s
Description: 了解基于流式细胞术的高通量筛选技术，用于发现抑制人中性粒细胞β2整合素活化的小分子药物。该方法为抗炎药物开发提供新思路。

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我们感谢康涅狄格大学健康中心流式细胞术核心实验室的Evan Jellison博士和Li Zhu女士在流式细胞术方面的协助，感谢康涅狄格大学健康中心免疫学系的Lynn Puddington博士对仪器设备的支持，感谢康涅狄格大学健康中心临床研究核心实验室的Slawa Gajewska女士和Paul Appleton博士在获取血液样本方面的帮助。我们感谢康涅狄格大学医学院的Christopher &#34;Kit&#34; Bonin博士和Geneva Hargis博士在本手稿的科学写作与编辑方面提供的帮助。本研究获得了美国国立卫生研究院、国家心肺血液研究所（R01HL145454）、国家普通医学科学研究所（P20GM121176）、美国心脏协会职业发展奖（18CDA34110426）以及康涅狄格大学健康中心启动基金的资助。图1使用BioRender.com制作。

在获得知情同意后，从匿名的健康人类供体采集肝素抗凝全血样本，该研究方案已获康涅狄格大学健康中心机构审查委员会批准，遵循《赫尔辛基宣言》的原则。所有供体均签署了知情同意书。本研究的纳入/排除标准经过审慎制定，以确保参与者的适宜性并尽量降低潜在风险。符合条件的参与者年龄介于18至65岁之间，不限种族，需具备英语流利能力，并能够自主提供知情同意。排除的参与者包括无法自行提供知情同意者（例如需要法定授权代表者）、年龄小于18岁或大于65岁者、被监禁者以及孕妇。此外，参与者必须未使用抗炎药物且无炎症性疾病。当前存在感染或正在经历慢性或急性炎症状态者亦被排除。最后，有当前或近期新型冠状病毒感染史的个体不符合本研究的入组资格。这些标准的制定旨在保障参与者的安全与适宜性，同时尽量减少可能影响研究结果的混杂因素。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>中性粒细胞培养基：通过向不含酚红的 RPMI-1640 中添加 2% 人血清白蛋白来制备中性粒细胞培养基（参见 材料表).</li>
	<li>fMLP 溶液：将 10 mM fMLP 二甲基亚砜（DMSO）储存液稀释 100 倍，配制 fMLP 溶液（参见 材料表用不含酚红的RPMI 1640培养基溶解，配制成100 µM的fMLP溶液。</li>
	<li>抗体溶液：将120 µL藻红蛋白别藻蓝素（APC）标记的单克隆抗体mAb24（mAb24-APC）稀释（参见 材料表），报告β2整合素的高亲和力构象，在10 mL中性粒细胞培养基中配制，制成1.2 µg/mL的mAb24-APC溶液。</li>
	<li>化合物文库：将初始浓度为10 mM的化合物文库用溶剂稀释至1 mM，即加入5 µL的10 mM文库溶液（参见 材料表将1 mM化合物文库使用液体处理仪以每孔5 µL的体积转移至空的384孔板中。随后，使用液体处理仪将45 µL DMSO加入384孔板中。</li>
	<li>如图所示 图1，四个孔（1、2、23、24）仅含有DMSO而不含化合物，作为筛选中的阳性和阴性对照。每个孔中加入45 µL不含酚红的RPMI-1640培养基进行进一步稀释，使所有化合物的终浓度为100 µM。</li>
</ol>
2. 从人血液中分离中性粒细胞
<ol>
	<li>使用血清移液管，将 4 mL 血液小心地叠加到 15 mL 离心管中 8 mL 商业密度梯度介质上（参见材料表）（图 2A）。</li>
	<li>在 20 °C 条件下，以 550 × g 离心 30–50 分钟。转子减速过程应缓慢进行（减速因子为 1）。 
	注意：中性粒细胞（图 2B 中的条带 2）与红细胞的分离效果可能因供体而异。对于大多数供体，30 分钟离心已足够。然而，若分离不完全，则某些供体可能需要额外延长 10–30 分钟离心时间（图 2C）。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器小心吸除血浆（顶部黄色液体）和单个核细胞（上层浑浊条带；即 图 2B 中的 PBMC 条带）。</li>
	<li>从下层浑浊条带（图 2B 中的中性粒细胞条带）及其下方约 3–4 mL 处收集中性粒细胞，转移至含有 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）的 15 mL 离心管中。通过轻轻倒置混匀 2–3 次，使中性粒细胞悬液均匀。</li>
	<li>在 20 °C 条件下，以 400 × g 离心 10 分钟，随后小心倾倒去除上清液。</li>
	<li>用 5 mL PBS 轻柔重悬沉淀物，并在 20 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>通过倾倒法去除上清液，并使用真空抽吸仔细清除管口周围及管壁上的任何残留上清液。将沉淀物重悬于 1 mL 中性粒细胞培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。通常，从 8 mL 人血中可获得 1 至 4 × 107 个中性粒细胞。 
	注意：中性粒细胞悬液中可能存在红细胞污染。红细胞通常不会显著影响大多数检测，且有助于防止中性粒细胞活化/预激活27。但在计数前需裂解红细胞以获得准确的中性粒细胞浓度。将 10 µL 细胞悬液加入 891 µL 去离子水中，孵育 10–30 秒以裂解红细胞，随后加入 99 µL 10× PBS 以平衡渗透压，防止中性粒细胞发生裂解。</li>
	<li>通过添加中性粒细胞培养基，将细胞密度调整至 6.25 × 105 个细胞/mL。</li>
</ol>
3. 384孔板的制备
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中，将1 mL抗体溶液（1.2 µg/mL mAb24-APC）与0.2 mL中性粒细胞培养基混合，配制为1 µg/mL的mAb24-APC溶液。然后，取25 µL该混合液加入384孔板的阴性对照孔中（即图1中的蓝色孔）。</li>
	<li>在15 mL离心管中，将9 mL抗体溶液与21.6 µL fMLP溶液（100 µM）以及1.7784 mL中性粒细胞培养基混合，配制为含1 µg/mL mAb24-APC和200 nM fMLP的混合溶液。随后，取25 µL该混合液加入384孔板的阳性对照孔和检测孔中（即图1中的红色孔和蓝色孔）。</li>
	<li>使用多通道移液器，将化合物文库板中100 µM的化合物溶液各5 µL转移至384孔板中。</li>
	<li>在室温下，以500 × g 离心1分钟。 
	&#8203;注意：离心板时需使用摆动吊篮转子及配套的板用吊篮。</li>
</ol>
4. 细胞处理
<ol>
	<li>使用16通道移液器（5-50 µL量程，对应384孔板的每一列）向每个孔中加入20 µL中性粒细胞悬液。用移液器轻柔吹打混匀5-10次，每次吹打之间保持一致的时间间隔。 
	注意：各孔中的终浓度如下：中性粒细胞 2.5 × 105 cells/mL（所有孔）；mAb24-APC 0.5 µg/mL（所有孔）；fMLP 100 nM（阳性对照孔和检测孔）；化合物 10 µM（检测孔）。</li>
	<li>将板置于摇床上，300 rpm，室温（RT）孵育10分钟。</li>
	<li>使用16通道移液器向每孔加入3 µL 16%多聚甲醛（PFA）以固定细胞（终浓度约为0.91%）。然后将板置于冰上孵育10分钟。 
	&#8203;注意：建议在加入中性粒细胞和PFA时，不同列之间保持一致的时间间隔。这可确保每个孔中的中性粒细胞与fMLP和mAb24-APC的孵育时间相同。</li>
</ol>
5. 流式细胞术
<ol>
	<li>打开流式细胞仪（参见材料表），并确保连接仪器的计算机也已开启。</li>
	<li>确保鞘液容器已加满，废液容器为空且正确连接至仪器。</li>
	<li>将384孔板装载到流式细胞仪的样品加载器上。确保板的A1孔与加载器上的A1标记对齐。</li>
	<li>打开软件并创建新实验。选择384孔板，并选择所需的荧光染料。接着点击板设置，拖动选择所有孔，然后点击样品。打开&#34;高通量&#34;开关，并在速率面板中选择高。
	<ol>
		<li>在体积框中输入50。选择奇数列中的样品，然后激活&#34;振荡&#34;开关。最后，在右侧面板中为样品命名。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击绘图与设门。然后点击应用按钮（绿色圆圈上的两个箭头），随后点击运行按钮（三角形）。等待数秒以观察来自第一孔的一些细胞，然后点击暂停按钮。
	<ol>
		<li>调节FSC和SSC电压，以确保细胞在图中清晰可见。点击采集，然后点击运行按钮（三角形）以开始检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞仪将从每个孔中依次采集约50 µL、含1000–3000个中性粒细胞的样本。完成整个384孔板大约需要3小时。</li>
	<li>所有样品检测完成后，导出.fcs文件以用于下一步分析。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>打开流式细胞术数据分析软件（参见材料表）。选择包含所有 .fcs 文件的文件夹，并将其拖拽至软件窗口中，然后释放以将数据导入软件。</li>
	<li>双击一个样本，在弹出的窗口中根据 FSC 和 SSC28,29,30 对中性粒细胞进行单细胞设门，如图3所示。选择已设门的行，并将其拖拽至文件夹，然后释放，以将该设门策略应用于该文件夹中的所有样本。</li>
	<li>使用软件的表格编辑器功能，计算并导出每个孔中中性粒细胞的 APC 中位荧光强度（MFI）。点击编辑选项卡下的添加列。在统计选项卡中选择中位数，选择已设门的细胞群体中性粒细胞，并选择APC作为参数。点击确定按钮。</li>
	<li>返回到&#34;表格编辑器&#34;选项卡，在&#34;分组&#34;选项卡中选择所有样本，然后点击创建表格按钮。将弹出一个新窗口显示所生成的表格。将其保存为文本、CSV 或 Excel 文件。</li>
	<li>打开导出的表格，计算阳性对照和阴性对照样本的 APC MFI 的平均值和标准差（图4）。</li>
	<li>使用以下公式计算该板的 Z' 因子（Z'）： 
	Z' = 1 - 3(σp + σn)/(µp - µn)， 
	其中 σp 和 σn 分别为阳性对照和阴性对照的标准差，µp 和 µn 分别为阳性对照和阴性对照的均值31。 
	注：Z' 因子反映阳性与阴性对照分布之间的分离程度。Z' = 0 表示无分离，Z' = 0.5 表示中等分离。如先前研究所述31，Z' &#62; 0.5 表明该检测适用于化合物筛选。Z' 在 0.5 至 0 范围内可接受，但可能仅能识别出强效阳性结果，这些结果需在二次检测中进一步验证。</li>
	<li>当化合物处理的中性粒细胞的 APC MFI 低于阳性对照 MFI 减去其三倍标准差时（P = 0.0013，由图4中的虚线表示），可将该化合物视为筛选中的&#34;阳性结果&#34;。</li>
</ol>

Screening of β2 Integrin Activation Inhibitors in Human Neutrophils

作者声明不存在竞争性财务利益。

中性粒细胞刺激和染色的启动与终止由中性粒细胞和固定剂PFA的加入决定。因此，确保向每列加入中性粒细胞或PFA的时间间隔相同至关重要，以保证每个孔中中性粒细胞的刺激和染色时间保持一致。由于中性粒细胞寿命较短，整个实验必须在同一天内完成，从供者采血到流式细胞术检测结束均需如此。中性粒细胞对温度变化极为敏感，当暴露于快速升温环境时（例如从4 °C升至室温，或从室温升至37 °C）可能发生激活。此外，根据我们以往的经验，当中性粒细胞保存在冰上或4 °C时，fMLP诱导的β2整合素激活不会发生（数据未显示）。因此，在固定前，全血和中性粒细胞应始终保持在室温或20 °C（包括分离过程中的离心步骤）。切勿将全血和中性粒细胞置于冰上。
在阴性对照中，mAb24 的染色结果应非常低。如果在实验中观察到较高的 mAb24 染色水平，请检查以下几点：（1）固定前实验过程中温度是否发生显著变化；（2）中性粒细胞培养基中是否存在 fMLP 或内毒素污染；（3）样品处理是否过于剧烈，例如在移液和混匀过程中产生气泡。
本实验方案采用 mAb24 报告 β2 整联蛋白头部结构域的开放状态。理论上，KIM127 是一种可报告 β2 整联蛋白伸展状态的单克隆抗体34,35，可与 mAb24 联合使用，以全面评估 β2 整联蛋白的构象变化。然而，KIM127 染色的信噪比（1.5 至 2 倍）不如 mAb24（5 至 10 倍），通常在 384 孔板检测中无法提供令人满意的 Z' 因子。在 96 孔板检测中，可在进行流式细胞术前对样本进行洗涤，从而降低可溶性抗体带来的背景信号。因此，基于 KIM127 的检测可在 96 孔板中进行，但其通量低于 384 孔板检测。
由于该方法使用荧光强度作为读数来评估药物对整合素的抑制作用，一些具有荧光性质的药物可能会干扰实验结果。此外，在10分钟刺激期间诱导中性粒细胞死亡的毒性药物也会表现出类似整合素抑制的现象。能够抑制中性粒细胞脱颗粒的药物会降低整体β2整合素的表达水平，这类脱颗粒抑制剂也将在我们的筛选中被识别出来。因此，需要通过其他对照进行二次筛选，以确认阳性结果的抑制效应。二次筛选可用于验证阳性结果，并进一步确定其作用机制。除了重复mAb24检测外，还将使用广谱抗人CD18抗体评估细胞表面总的CD18表达水平。通过mAb24测得的活化型β2整合素水平将根据总的CD18表达进行归一化处理，从而帮助我们判断该药物的作用机制是否涉及拮抗整合素活化和/或抑制CD18在细胞表面的表达。此外，在二次筛选中还应进行细胞活力检测，以排除阳性化合物可能存在的毒性效应。
该实验方案存在一些局限性。首先，单克隆抗体 mAb24 仅在整合素处于高亲和力状态时才能检测到其 β2 I 样结构域。因此，该方法无法通过检测 mAb24 结合的减少来识别如 lifitegrast 这类作用于 α/β I 样变构位点的拮抗剂。事实上，lifitegrast 会增强 mAb24 的结合32，并在使用 mAb24 检测时表现出异常升高的 MFI 值（图 4）。对于此类异常结果，可能需要借助其他检测方法来验证这些候选化合物是否为类似 lifitegrast 的 α/β I 样变构拮抗剂。其次，本实验的 Z' 因子未达到理想水平，未来可通过使用自动移液和振荡设备进一步优化。遗憾的是，本实验室目前缺乏验证该假设所需的设备。若无法通过上述方法进一步提升 Z' 因子，则进行双份或三份重复实验将有助于识别假阳性与假阴性结果。此外，延长孵育时间可能有助于发现更多活性化合物，这一点已在已知的 β2 整合素激活抑制剂 Nexinhib20 的实验中得到观察——该抑制剂需孵育一小时才能发挥抑制作用。本研究主要聚焦于快速起效化合物的筛选，但研究人员应注意可根据自身研究需求调整孵育时间。
据我们所知，这是首个针对β2整合素拮抗剂的高通量筛选方法。该方法可用于鉴定能够直接结合β2整合素并阻止其构象变化形成中等或高亲和力状态的小分子化合物，类似于近期报道的对整合素αIIbβ3和α4β1不具有&#34;激动性&#34;特性的拮抗剂26。中性粒细胞在多种炎症性疾病中起关键作用，例如心肌缺血-再灌注损伤36、脓毒症37以及自身免疫性疾病38,39。与基于抗体的药物相比，小分子药物在治疗这些疾病方面可能具有更高的灵活性。本筛选获得的阳性化合物可能为炎症性疾病的治疗提供潜在候选药物。
目前的方法是一种基于荧光抗体的高通量筛选技术。由于针对β140,41,42,43,44、αIIbβ345,46以及αL整合素47,48,49,50的活化报告抗体也已存在，因此该方法可拓展用于鉴定其他整合素的拮抗剂。例如，构象敏感性抗体HUTS-21可结合β1杂合结构域51,52,53，已被用于高通量筛选，以鉴定极迟抗原-4（VLA-4，整合素α4β1）的变构拮抗剂54。本筛选方法还可经修改和拓展，用于发现抑制或促进其他细胞表面受体表达的药物，例如可增加囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）在囊性纤维化（CF）细胞表面表达的化合物。在囊性纤维化中，多种突变导致CFTR蛋白错误折叠，从而造成细胞膜上CFTR表达缺失55。已有研究表明，小分子药物能够恢复CFTR的表达56。对于实验方案的修改，需延长药物孵育时间至数小时，以允许蛋白质表达发生变化。

许多炎症性疾病的特点是在肿胀或损伤部位出现中性粒细胞的浸润1。为了浸润这些组织，中性粒细胞必须完成中性粒细胞募集级联反应，该过程包括在内皮上停滞、穿过血管壁的外渗以及向组织内的募集2。循环中的中性粒细胞需要β2整合素的活化才能完成这一级联反应，尤其是在停滞阶段。因此，抑制整合素功能、减少中性粒细胞黏附、外渗和募集的药物可能有效治疗炎症性疾病3,4。
β2整合素此前已被作为炎症性疾病的治疗靶点。一种直接靶向整合素αLβ2的单克隆抗体——依法珠单抗（Efalizumab）——曾被开发用于银屑病的治疗5。然而，由于其严重的副作用——由JC病毒再激活引起的进行性多灶性白质脑病——该药物已被撤市6,7。新型抗炎性整合素靶向疗法应考虑保留白细胞的抗感染功能，以最大限度地减少不良反应。依法珠单抗的副作用可能与其单克隆抗体在血液中长时间循环有关，这可能导致免疫功能的长期抑制8。最近一项研究表明，依法珠单抗可介导αLβ2的交联以及α4整合素的非预期内化，为该药物的副作用提供了另一种解释9。因此，半衰期较短的小分子拮抗剂可能有助于避免此类问题。
本文介绍了一种利用人中性粒细胞高通量筛选小分子β2整合素拮抗剂的方法。β2整合素的活化需要其胞外域发生构象变化，从而暴露并增强与其配体的结合亲和力。在经典的“开关刀”模型中，弯曲-闭合状态的整合素胞外域首先伸展为伸展-闭合构象，随后其头部结构域打开，形成完全活化的伸展-开放构象10,11,12,13。此外还存在另一种替代通路，即从弯曲-闭合状态经由弯曲-开放状态最终转变为伸展-开放构象14,15,16,17,18,19。构象特异性抗体mAb24可结合于人β2-I样结构域中的一个表位，该表位仅在胞外域头部结构打开时方可被识别20,21,22,23。
此处使用 mAb24-APC 检测 β2 整合素是否被激活。为激活中性粒细胞及整合素，采用细菌来源的短效趋化肽 N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP），该肽可激活中性粒细胞 β2 整合素24，本方案中用作刺激物。当fMLP与中性粒细胞上的Fpr1结合后，会激活涉及G蛋白、磷脂酶Cβ和磷脂酰肌醇3-激酶γ的下游信号级联反应。这些信号事件最终导致整合素活化 通过 内向外信号通路18,25除了直接与β2整合素结合并阻止整合素活化构象变化的小分子拮抗剂外26, 能够抑制β2整合素内向-外向激活信号通路中组分的化合物也可通过该方法检测。自动化流式细胞仪可实现高通量筛选。发现新的拮抗剂不仅有助于深入理解整合素的生理功能，还可为基于整合素的抗炎治疗提供转化医学见解。

<table><tbody><tr><td>16通道移液器</td><td>Thermo</td><td>4661090N</td><td>仪器</td></tr><tr><td>384孔板</td><td>Greiner</td><td>784201</td><td>材料</td></tr><tr><td>APC抗人CD11a/CD18（LFA-1）抗体 克隆：m24</td><td>BioLegend</td><td>363410</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Bravo&amp;nbsp;自动化液体处理平台&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>384多通道液体处理仪</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td>仪器</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Becton, Dickinson &amp;amp; Company</td><td>NA</td><td>软件</td></tr><tr><td>人血清白蛋白溶液（25%）</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Lifitegrast</td><td>Thermofisher</td><td>&amp;nbsp;50-208-2121</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Nexinhib20</td><td>Tocris</td><td>6089</td><td>试剂</td></tr><tr><td>N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）</td><td>Sigma</td><td>F3506</td><td>试剂</td></tr><tr><td>16%多聚甲醛溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>试剂</td></tr><tr><td>板用转子桶</td><td>Eppendorf</td><td>UL155</td><td>配件</td></tr><tr><td>板式振荡器&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>88-861-023</td><td>仪器</td></tr><tr><td>PolymorphPrep</td><td>PROGEN</td><td>1895 (之前为 1114683)</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Prestwick化学文库化合物板（10 mM）</td><td>Prestwick Chemical Libraries</td><td>Ver19_384</td><td>1520个小分子，98%为已上市批准药物（经FDA、EMA、JAN及其他机构批准）</td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基，无酚红</td><td>Gibco</td><td>11-835-030</td><td>试剂</td></tr><tr><td>摆动转子头&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td>转子</td></tr><tr><td>ZE5细胞分析仪</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Model ZE5</td><td>仪器</td></tr></tbody></table>

一种基于流式细胞术的整合素抑制药物高通量筛选技术

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

本方案旨在建立一种利用构象变化报告抗体和高通量流式细胞术鉴定β2整合素活化小分子拮抗剂的方法。该方法也可作为其他基于抗体的高通量筛选方法的参考。β2整合素是白细胞特异性的黏附分子，在免疫应答中起关键作用。中性粒细胞依赖整合素活化从血液循环中迁移出来，不仅参与抗感染，也参与多种炎症性疾病。调控β2整合素的活化为治疗中性粒细胞相关炎症性疾病提供了可行策略。在本方案中，采用一种单克隆抗体mAb24，该抗体特异性结合β2整合素的高亲和力头部结构域，用于定量检测分离的原代人中性粒细胞表面β2整合素的活化水平。以N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）作为刺激剂激活中性粒细胞的β2整合素。本研究使用可自动检测384孔板样品的高通量流式细胞仪，在3小时内评估320种化合物对β2整合素活化的抑制作用。通过该方法可鉴定直接靶向β2整合素或靶向G蛋白偶联受体启动的整合素“由内而外”活化信号通路中相关分子的化合物。

代表性384孔板筛选结果（图4）显示，阴性对照的mAb24-APC平均荧光强度（MFI）为3236 ± 110，而阳性对照的mAb24-APC MFI为7588 ± 858。该孔板的Z'因子约为0.33，处于可接受范围内31。然而，Z'值还需通过二次检测进一步验证。
为标准化数据，将所有数值进行缩放，使阳性均值的最大值为1，阴性均值的最小值为0。Z'因子将在二次检测中进行更严格的验证。本板的阈值设定为0.41，即相对MFI低于0.41的样本将被视为抑制fMLP诱导的人中性粒细胞β2整合素活化的阳性结果。本板未发现任何阳性结果。
为验证该方案的有效性，使用了Nexinhib20（通过拮抗Rac-1功能抑制β2整合素活化）和lifitegrast（直接拮抗整合素αLβ2）32,33。然而，Nexinhib20的孵育时间调整为1小时，lifitegrast则为半小时。这些实验所得数据采用上述相同的缩放方法进行归一化处理，随后将这些数据点与微孔板实验结果合并进行整体分析（图4）。
<img alt="96孔板示意图、检测结果、阳性/阴性对照、化合物分布分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64401/64401fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：化合物筛选的孔板布局。 示意图展示了在384孔板中筛选化合物与对照的排列方式。阴性对照孔以蓝色表示（第1列和第23列），阳性对照孔以红色表示（第2列和第24列）。测试孔以米色表示（第3至22列）。箭头指示读板顺序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64401/64401fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="血液分离过程；使用密度梯度法分离外周血单个核细胞的试管设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64401/64401fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用密度梯度介质分离中性粒细胞。 代表性照片展示使用密度梯度介质成功与不成功的中性粒细胞分离结果。(A) 首先，将 4 mL 血液叠加至 8 mL 密度梯度介质上。(B) 离心后应可见两条浑浊的条带：上层条带主要含有外周血单个核细胞（PBMCs），下层条带主要含有中性粒细胞及少量红细胞（RBCs）。大部分红细胞沉积于管底。(C) 分离不成功的示例，红细胞未完全沉淀，且未观察到中性粒细胞条带。此时需要额外离心（10–30 分钟）以实现中性粒细胞条带的分离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64401/64401fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱、细胞群体分析、中性粒细胞、单细胞百分比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64401/64401fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：利用FSC/SSC图谱对中性粒细胞进行设门分析。 典型的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图谱，展示用于鉴定中性粒细胞的设门策略。（A）根据流式细胞仪记录的前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）对中性粒细胞进行设门。（B）进一步根据前向散射的宽度（FSC-W）和高度（FSC-H）对单细胞进行设门，以及（C）根据侧向散射的宽度（SSC-W）和高度（SSC-H）进行设门。颜色标度表示细胞密度，从红色到黄色、绿色，再到蓝色，密度逐渐降低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64401/64401fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="点图比较不同化合物处理下归一化的 mAb24 MFI；图例标明阳性/阴性对照。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64401/64401fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：代表性 384 孔板的筛选结果。 代表性 384 孔板的筛选结果，显示 Z' 因子为 0.3。阴性对照和阳性对照分别用蓝色和红色圆点表示。经不同化合物处理的测试样品以米色圆点表示。虚线代表用于识别阳性信号的平均荧光强度（MFI）阈值。由于所有测试化合物的 MFI 值均高于阈值线，因此未发现任何 β2 整合素拮抗剂。本图汇总了独立实验中已知 β2 整合素拮抗剂在不同孵育时间下的测试结果（Nexinhib20 孵育 1 小时，lifitegrast 孵育半小时）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64401/64401fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案描述了一种基于流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定可抑制人中性粒细胞上β2整合素活化的小分子药物。

本方案旨在建立一种方法，用于鉴定β2整合素活化的小分子拮抗剂，利用……

我们的研究聚焦于中性粒细胞整合素。在本研究中，我们旨在建立一种方法，用于筛选β2整合素活化的小分子拮抗剂。我们相信，利用该方法可以发现新的拮抗剂，这不仅有助于加深对整合素生理功能的理解，还可为基于整合素的抗炎治疗提供转化医学层面的见解。未来，我们将致力于发现新的抗炎药物并解析其作用机制。使用血清移液管，将4毫升肝素化人血小心地叠加在含有8毫升密度梯度介质的15毫升离心管中。在20摄氏度下，以550 ×g离心30至50分钟。然后使用1 mL移液器移除含有血浆和单个核细胞的上层液体。从下层浑浊条带及其下方约3至4 mL处收集中性粒细胞，转入含有10 mL PBS的15 mL离心管中。轻轻倒置混匀管体2至3次，以混匀中性粒细胞悬液。将中性粒细胞悬液在 20 摄氏度下以 400 ×g 离心 10 分钟。然后小心弃去管中的上清液，并将沉淀重悬于 5 毫升 PBS 中。再次在 20 摄氏度下以 300 ×g 离心 10 分钟。去除上清液后，使用真空抽吸法清除管壁及管口周围的残留上清液。将沉淀物重悬于1毫升中性粒细胞培养基中。在1.5毫升离心管中，将1毫升浓度为1.2微克/毫升的抗体溶液与0.2毫升中性粒细胞培养基混合。向384孔板的阴性对照孔中加入25微升抗体溶液。在15毫升离心管中，将9毫升抗体溶液、21.6微升FMLP溶液和1.7784毫升中性粒细胞培养基混合。向384孔板的阳性对照孔和检测孔中各加入25微升该混合液。使用多通道移液器，从化合物文库板中转移5 µL化合物溶液至384孔板中。将悬液在500 ×g下离心1分钟。使用16通道移液器，向每孔加入20 µL中性粒细胞悬液。将培养板置于摇床上，300 RPM 振荡孵育 10 分钟。然后，为固定细胞，向每孔加入 3 µL 16% 多聚甲醛，并在冰上孵育 10 分钟。开启流式细胞仪后，将含有化合物处理的中性粒细胞悬液的 384 孔板放入样品架中。打开软件。启动新实验。选择384孔板并选择所需的荧光染料。然后点击“板设置”，拖动以选择所有孔，并点击“样本”。打开高通量开关，在速率面板中选择“高”。在体积框中输入 50。选择奇数列中的样本，并打开振荡开关。最后，在右侧面板中为样本命名。所测试化合物的平均荧光强度值均高于 cutoff 线，表明这些化合物中未发现β2整合素拮抗剂。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一种基于流式细胞术的高通量技术筛选整合素抑制药物

本视频展示了通过基于荧光的检测方法筛选免疫调节化合物。用这些化合物处理表达绿色荧光蛋白（GFP）表达盒的转基因小鼠来源的T淋巴细胞。增强或减弱的GFP信号可分别用于识别这些化合物的刺激或抑制作用。...

一种基于荧光的检测方法：利用基因工程淋巴细胞筛选免疫调节化合物

双分子荧光互补的流式细胞术分析为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种高通量的定量方法。该方法可用于绘制蛋白质结合位点图谱，以及筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。...

双分子荧光互补的流式细胞术分析：一种高通量定量研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法

静态黏附实验是一种强大的工具，可用于模拟T淋巴细胞与其他细胞类型之间的相互作用。该实验通过将标记的T细胞注入包被有黏附分子的孔板中以形成相互作用，随后使用酶标仪在多次洗涤后定量测定黏附细胞的数量。...

T淋巴细胞整合素活化研究的静态黏附实验

遗传性心律失常通常由突变引起，这些突变会改变一种或多种离子通道在细胞表面的递送。本文中，我们改进了流式细胞术检测方法，用于定量分析在tsA-201细胞中表达的重组离子通道的总蛋白和细胞表面蛋白的相对表达水平。...

利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

本研究介绍了一种基于荧光的新方法，该方法使用来自转基因小鼠的淋巴细胞。该方法适用于对具有抑制或促进淋巴细胞活化能力的小分子进行高通量筛选（HTS）。...

一种基于荧光的淋巴细胞检测方法，适用于小分子高通量筛选

本文介绍了一种高效筛选方案，用于鉴定可促进胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向星形胶质细胞分化的...

基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

本文描述了一种基于流式细胞术的细胞结合实验，主要用作筛选工具，用于鉴定能够抑制荧光标记的CXC趋化因子配体12（CXCL12）与CXC趋化因子受体4（CXCR4）结合的化合物。...

一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物

免疫细胞与血管壁的动态黏附是其归巢至肠道的前提条件。本文介绍了一种用于功能性研究的实验方案 体外...

用于炎症性肠病抗黏附疗法功能分析的动态黏附测定

本文采用基于流式细胞术的检测方法，筛选影响T细胞受体信号传导的化学抑制剂文库，以鉴定抑制剂及其作用靶点。此处描述的方法还可扩展用于高通量筛选。...

T细胞受体信号通路中介分子的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。...

一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

在抗癌适配体开发过程中，一个必要的步骤是检测其与靶标的结合能力。我们展示了一种基于流式细胞术的检测方法来研究这种结合，并强调了实验中必须包含阴性对照适配体，以及对该特定蛋白呈阳性或阴性的癌细胞的重要性。...

一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合检测方法用于评估抗癌适配体的选择性与特异性

了解基于流式细胞术的高通量筛选技术，用于发现抑制人中性粒细胞β2整合素活化的小分子药物。该方法为抗炎药物开发提供新思路。

一种基于流式细胞术的整合素抑制药物高通量筛选技术

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