体外研究 研究结膜杯状细胞中基于性别的差异的方法
2023年7月28日
在基于性别的差异研究中，无酚红/无胎牛血清培养基是比晚期 RPMI 更好的选择，可在不改变结膜杯状细胞正常功能的情况下消除外源激素。
通过研究原代培养物中的杯状细胞功能，我们获得了对基于性别的眼表健康差异背后的机制的宝贵见解。我们通过消除系统中的激素和雌激素物质，修改了已经建立的结膜杯状细胞原代培养方法，从而能够更精确地控制性激素水平。这种修改提高了我们发现的准确性和可靠性。
细胞内钙测定是一种研究杯状细胞在各种刺激下的功能以及每种刺激触发的细胞内信号通路的方法。该技术可以扩展到眼部过敏、干眼症或结膜炎等眼表疾病的药物开发。该技术有助于筛选特定激素水平下各种分子对杯状细胞的影响。
刚接触这种技术的人经常难以将结膜组织与结缔组织分开。我们的建议是密切关注组织的质地和材料特性。结膜应该是有弹性的和半透明的，而结缔组织通常颜色较浅，呈棉纤维状。
首先，使用无菌手术刀，将人体结膜组织切成一毫米的立方块。在六孔板中，在每个孔中播种四块，其中含有一毫米的完全RPMI培养基。确保将碎片固定在盘子上。
将组织碎片在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 95% 空气中孵育。每隔一天更新一次培养基。接种后 72 小时后，取下组织塞并继续孵育，直到杯状细胞达到 70% 至 80% 汇合度。
接下来，用PBS冲洗细胞，并加入0.05%胰蛋白酶EDTA以将细胞从板底部分离。在显微镜下观察细胞脱离。一旦细胞分离，加入完整的RPMI培养基以使胰蛋白酶失活。
将细胞悬液以150G离心5分钟，并将沉淀重悬于无酚红RPMI培养基中。然后将细胞悬液重新接种到玻璃底培养皿上，用于细胞内钙浓度测量。对于 Fura-2 AM 加载，将含有 0.5%HEPES、0.5% BSA 和 0.5 微摩尔 Fura-2 AM、8 微摩尔 Pluronic acid F127 和 250 微摩尔磺吡拉酮的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液加入含有高脚杯细胞的玻璃底培养皿中。
将细胞在 37 摄氏度下孵育一小时，保护它们免受光照。孵育后，用含有250微摩尔磺吡喃酮的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液洗涤细胞。对于细胞内钙浓度测量，将含有装有Fura-2的细胞的培养皿置于显微镜下。
然后添加 200 倍放大倍率。找到包含 20 到 50 个单元格的代表性字段。使用手绘功能，在每个单元格周围画出轮廓，以将其与背景荧光区分开来，然后等待软件自动从测量中减去背景荧光。
单击"开始实验"按钮并等待 8 到 15 秒以确定细胞中的基线钙水平。然后小心地加入胆碱能激动剂卡巴酚，并继续测量至少 120 秒或直到钙水平恢复到基线水平。使用峰值细胞内钙浓度的变化，计算每个细胞在测量的前8至15秒的平均基础钙水平。
从数据集中删除平均基础钙水平等于或高于 500 纳摩尔的细胞。接下来，计算每个细胞的最大细胞内钙浓度。然后从同一细胞的最大测量细胞内浓度中减去基础钙水平值。
最后，平均培养皿中所有细胞的峰值细胞内钙浓度的变化。通过免疫荧光染色，利用杯状细胞标志物、细胞角蛋白和 Helix pomatia 凝集素 1 特异性抗体确认人结膜杯细胞的纯度。Fura-2 AM测定结果显示，在不含酚红的RPMI和1%BSA和完全RPMI培养基中孵育的细胞之间没有显著差异。
然而，当将晚期RPMI培养基组与完全RPMI培养基组进行比较时，观察到细胞内钙对卡巴酚的反应显着增加。最重要的是获得足够细胞密度的原代人杯状细胞培养物。在生长过程中，确保组织块粘附在培养板上，以便有效生长。
研究人员可以通过在刺激前将各种抑制剂、靶向受体或信号分子应用于细胞来探索特定途径的参与。还可以评估指示杯状细胞功能的其他参数，如粘蛋白分泌和丝裂原活化蛋白激酶的失活。通过互补测量，可以全面了解杯状细胞对不同刺激的反应。
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概述
本研究通过关注结膜杯状细胞的功能，探讨了眼表健康的性别差异。它强调了一种改良的培养方法，该方法消除了激素和雌激素物质，允许在不影响杯状细胞功能的情况下精确控制激素水平。
关键研究组成部分
研究领域
- 眼表健康
- 结膜杯状细胞功能
- 基于性别的生物学差异
背景
- 杯状细胞在维持眼表健康方面发挥着关键作用。
- 了解性激素如何影响这些细胞可以为眼部疾病的治疗计划提供更好的指导。
- 当前的方法经常引入外源性激素，可能会混淆结果。
使用的方法
- 人类结膜杯状细胞的原代培养
- 细胞内钙测量以评估细胞功能
- 免疫荧光染色以确认细胞纯度
主要结果
- 在先进的RPMI组中，与完全的RPMI组相比，观察到对刺激的钙反应显著增加。
- 在无酚红RPMI和完全RPMI中的细胞之间未发现反应的显著差异。
- 正确识别组织类型和仔细执行方法对成功至关重要。
结论
- 该研究提供了一种研究杯状细胞功能而不受激素干扰的改良方法。
- 这项工作为理解眼部健康和基于性别的差异提供了宝贵的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Eliminating exogenous hormone interference in primary human conjunctival goblet cell cultures enables precise interrogation of sex-based biological differences relevant to ocular surface disease. This method enhances predictive confidence in early discovery by isolating intrinsic cellular responses, supporting robust target validation and mechanistic de-risking for ocular therapeutics. The approach is positioned to inform portfolio decisions where sex-based variability may impact translational continuity and candidate selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of sex-based cellular mechanisms in ocular surface health.
- Supports functional target validation by isolating hormone-independent goblet cell responses.
- Facilitates mechanistic de-risking for candidate molecules targeting mucin secretion pathways.
- Improves predictive confidence for sex-specific therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, hormone-free system for quantitative intracellular calcium assays.
- Enables reproducible measurement of goblet cell function under defined conditions.
- Supports screening of compounds for effects on calcium signaling and mucin secretion.
- Establishes assay readiness for evaluating drug candidates in ocular surface disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant sex differences observed in clinical populations.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by maintaining physiological goblet cell function.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates with sex-specific efficacy profiles.
- Enables exploration of signaling pathways and biomarker responses relevant to translational research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust platform for hypothesis testing, target validation, and early mechanistic screening in ocular surface disease research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of sex-based differences in goblet cell signaling and function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative calcium readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of cellular responses across defined experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by preserving physiological relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for future studies on sex-based ocular biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in sex-based ocular research.
- Operational Value: Standardizes cell culture and assay conditions for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying sex-specific biological responses early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates with differentiated efficacy or safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell culture and tissue handling.
- Demands access to fluorescence microscopy and quantitative calcium imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of hormone-free media and assay protocols.
- Adaptable to other epithelial cell systems with careful optimization.
- Dependent on high-quality donor tissue and consistent cell density for reliable outputs.
