Name: 评估小鼠卵母细胞中纺锤体组件检查点完整性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 了解如何通过活细胞成像和免疫荧光技术评估小鼠卵母细胞中的纺锤体组装检查点完整性。该方法结合实时成像与蛋白检测，帮助研究人员深入理解染色体分离机制及其在生殖生物学中的重要意义。

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本项目由美国国立卫生研究院提供资助（R35GM136340，授予 KS）。

本研究中使用的所有小鼠均按照罗格斯大学机构动物使用与护理委员会（方案编号 201702497）以及美国国立卫生研究院的指导原则进行饲养和管理。所有涉及动物实验的操作程序均已获得上述监管机构的批准。本研究中使用的小鼠均为 6 至 8 周龄的 CF-1 雌性小鼠。
1. 实验准备
<ol>
	<li>在开始SAC评估之前，按照先前发表的文献报道收集小鼠卵母细胞12将收集的卵母细胞均分为三组，置于含有2.5 µM milrinone的Chatot、Ziomek和Bavister（CZB）培养基中培养（参见 材料表以避免减数分裂恢复13. 
	注意：CZB 成分：81.6 mM NaCl；4.8 mM KCl；1.2 mM KH2PO4；1.2 mM MgSO₄4-7H2O；0.27 mM 丙酮酸钠；1.7 mM CaCl₂2；30.8 mM DL-乳酸；7 mM 牛磺酸；0.1 mM EDTA；25 mM NaHCO₃3；庆大霉素；以及0.3% BSA。</li>
	<li>按照先前所述方法制备用于显微注射的cRNA12,14. 从小鼠生发泡卵母细胞cDNA中扩增小鼠Securin基因，随后亚克隆至含有Gfp序列的pMDL2载体中15,16.
	<ol>
		<li>为了制备Securin-Gfp cRNA，用Nde I酶切线性化质粒。进行 体外 使用T3 RNA聚合酶进行转录并纯化cRNA16. 
		&#8203;注意：将cRNA以2-3 µL分装，于-80 °C保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 诺考达唑处理与活细胞成像
<ol>
	<li>准备含有 5 µM 诺考达唑（NOC）的 1 mL 培养基（CZB），另准备 1 mL 含 5 µM NOC 和 0.5 µM 反向素（NOC + REV）的培养基，以及 1 mL 含二甲基亚砜（DMSO）（1:2000）的培养基作为对照（参见材料表）。</li>
	<li>用于卵母细胞成熟和活体成像时，使用已在 37 °C、5% CO2、&#160;80% 湿度的培养箱中预热的 96 孔板。在第一孔中加入 150 µL 的对照 DMSO 处理液；在第二孔中加入 150 µL 的 NOC 处理液；在第三孔中加入 150 µL 的 NOC + REV 处理液。将该 96 孔板置于与上述相同条件的培养箱中，直至使用。 
	注意：在 96 孔板中，应避免使用第一行和第一列，因为边缘的阴影会影响图像质量。</li>
	<li>为启动减数分裂成熟，需去除米力农。在体视显微镜下以 30x–64x 放大倍数观察卵母细胞，通过将卵母细胞依次转移至六滴含 DMSO 的无米力农培养基（每滴 100 µL）中，洗去原有培养基中的米力农，并使用手动或口控移液器将卵母细胞转移至 96 孔板的相应孔中。
	<ol>
		<li>使用手动或口控移液器逐个吸取卵母细胞并转移至下一液滴，以计数卵母细胞，避免丢失。卵母细胞为单个、较大（直径约 80 µm）、圆形的细胞。细胞核呈中心位置的“按钮”状结构，细胞膜和透明带包裹着卵母细胞。 
		注意：在液滴间转移卵母细胞时，应尽量减少液体的携带量，以实现米力农从培养基中的最佳去除。若卵母细胞未能恢复减数分裂，可能是米力农未被有效清除所致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对 NOC 和 NOC + REV 处理组重复相同操作（步骤 2.3）。</li>
	<li>使用配备有环境可控培养室的明场显微镜对卵母细胞进行成像，成像条件为：37 °C、5% CO2、80% 湿度。在 24 小时内，每隔 20 分钟采集一次卵母细胞中层平面的图像。</li>
	<li>通过识别经历不对称胞质分裂的细胞，统计排出第一极体（PB）的卵母细胞数量。结果表现为一个小型细胞（PB）位于卵细胞旁，并处于共同的透明带内。使用图像分析软件（ImageJ，参见材料表）查看图像。</li>
	<li>将图像序列导入图像分析软件，逐帧推进，直至观察到一个或多个细胞完成不对称胞质分裂。计算排出极体的卵母细胞占总卵母细胞数的百分比17。</li>
</ol>
3. 监测减数成熟过程中Securin-gfp降解的模式
<ol>
	<li>离心3 µL的 Securin-Gfp cRNA（步骤 1.2）在 19,283 × g 条件下 4 °C 下孵育 30 分钟18. 
	注意：使用上清液，以避免加载可能在显微注射过程中导致针头堵塞的杂质。</li>
	<li>参照文献中详细描述的步骤，逐步进行卵母细胞显微注射12将第1.2步制备的Securin-gfp cRNA以100 ng/µL的浓度显微注射入处于前期I停滞的卵母细胞中。</li>
	<li>显微注射后，将卵母细胞置于CO₂培养箱中孵育，使其恢复并进行RNA翻译2 孵育至少3小时。使用自动多通道荧光成像系统观察卵母细胞以检测表达情况（参见 材料表）以观察 GFP 信号。</li>
	<li>如步骤2.2所述，在96孔板的三个不同孔中，分别加入150 µL培养基（含或不含5 µM诺考达唑）以及150 µL含0.5 µM逆转素的培养基。</li>
	<li>将显微注射后的卵母细胞依次通过六滴不含米力农的培养液洗涤，并将1/3的卵母细胞转移至每种处理组中。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 并在约洗去米力农后3小时，卵母细胞恢复减数分裂时，保持80%的湿度。 
	注意：使用放大倍数为30x–64x的体视显微镜观察核膜破裂，作为减数分裂恢复的标志。</li>
	<li>使用配备培养箱室的荧光显微镜，按照步骤2.6所述方法记录卵母细胞成熟过程的图像。采用明场设置在孔中定位卵母细胞，使用488滤光片检测Securin-gfp信号，并调整荧光强度以避免细胞过曝。
	<ol>
		<li>如果成像系统是自动化的，请保存每个卵母细胞在孔板中的位置。由于Securin-gfp均匀分布于细胞质中，需在24小时内每隔20分钟拍摄一次卵母细胞的中位平面图像。若需在一张图像中捕获多个卵母细胞，可使用较低倍率的物镜（如10倍）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用图像分析软件定量分析Securin-gfp的降解。打开GFP通道的图像，从时间点1开始。在首选的分析软件中，使用选择工具或形状工具标记每个卵母细胞，并为每个细胞生成一个感兴趣区域（ROI）。
	<ol>
		<li>使用相同的 ROI 选择一个背景区域，以供后续减除。测量每个 ROI 中 GFP 的像素强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用第3.8步中生成的每个卵母细胞的感兴趣区域（ROI），测量所有时间点的GFP荧光强度。 
	注意：在某些软件程序中，一个 &#34;分析&#34; 选项卡用于选择测量功能。
	<ol>
		<li>然后，进入下一个时间点，重复此过程以测量每个时间点的GFP强度。最后，从每个GFP数值中减去在步骤3.8中选定的背景区域的ROI测量值。该分析将得到每个卵母细胞在每个时间点的Securin-gfp强度值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从Securin降解模式中提取不同参数：（a）Securin-GFP降解开始的时间，该时间点反映SAC沉默的起始时刻；（b）Securin-GFP信号达到最低值的时间，该时间点表明SAC沉默已降至阈值以下，足以激活APC/C并实现Securin-GFP的完全降解；（c）Securin-GFP降解的速率19这表明了SAC活性降至APC/C激活及Securin-GFP降解所需阈值水平以下的速度。</li>
</ol>
4. 减数分裂成熟过程中通过免疫荧光检测动粒对 MAD2 的招募
注意：卵母细胞的采集与成熟操作请参考先前发表的报告12。
<ol>
	<li>将卵母细胞分为三组。将每组卵母细胞转移至100 µL不含米力农的培养液滴中。用矿物油覆盖液滴，并将其置于培养箱中（37 °C、5% CO2 和80%湿度）分别培养3小时、5小时和7小时，以获得处于早前期I、晚前期I和中期I阶段的卵母细胞。 
	注意：将每个时间点的样本分别置于不同的培养皿中，以避免多次从培养箱中取出同一培养皿，从而影响减数分裂成熟的正常进程。</li>
	<li>在指定的时间点，将卵母细胞转移至9孔玻璃培养皿中含500 µL 2%多聚甲醛（PFA）的1×PHEM缓冲液液滴中，在室温下固定20分钟，操作方法如前所述20。随后，将细胞转移至一个洁净孔中，加入500 µL封闭液（PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3）中。 
	注意：PHEM缓冲液成分：60 mM PIPES；25 mM HEPES；10 mM EGTA；2 mM MgCl2。 
	注意：可在此步骤暂停，将卵母细胞保存在9孔板的封闭液中，于4 °C下存放，直至合适时间再继续完成免疫荧光染色。</li>
	<li>为继续进行MAD2检测，将卵母细胞转移至含500 µL透化液（PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3）的洁净孔中，在室温下孵育20分钟，然后将细胞转移至新的封闭液孔中，孵育10分钟。</li>
	<li>后续免疫荧光步骤使用带凹槽的96孔板盖，操作方法如前所述20。使用加湿避光暗盒以避免光照和液体蒸发。将卵母细胞转移至含30 µL封闭液的液滴中，加入抗MAD2抗体（1:1000，兔源）和抗着丝粒抗体（ACA）（1:30，人源）（见材料表），在室温下孵育2小时。 
	注意：96孔板盖可同时处理多种蛋白和多个样本组。</li>
	<li>为洗去未结合的一抗，将细胞转移至含30 µL补充0.5% Triton的1×PHEM缓冲液液滴中，在加湿暗盒中孵育10分钟。重复此步骤两次。</li>
	<li>进行第四次洗涤，将细胞转移至含30 µL不含0.5% Triton的1×PHEM缓冲液液滴中，孵育10分钟。</li>
	<li>将细胞转移至含30 µL封闭液的液滴中，加入二抗，如抗人IgG-633（1:200）和抗兔IgG-568（1:200）（见材料表），在室温下孵育1小时。 
	注意：根据显微镜的激光器或滤光片选择合适的荧光染料组合。</li>
	<li>为洗去未结合的二抗，重复步骤4.5–4.6。</li>
	<li>为将细胞封片于显微镜载玻片上，将细胞转移至含10 µL含DAPI（0.1 mg/mL）的封片剂液滴中（见材料表）。在盖玻片四角各加少量凡士林小点，小心地将其覆盖在封片剂液滴上，缓慢按压使液体均匀分布。用透明指甲油将盖玻片密封固定于载玻片上。有关封片过程的更详细描述，请参见参考文献20。</li>
	<li>使用配备40x或63x物镜的共聚焦显微镜对动粒成像（见材料表）。利用ACA信号确定可覆盖整个染色体区域的z轴扫描范围。 
	注意：某些成像系统可采用4.0倍光学放大和0.5 µm的z轴步长。不同系统参数可能有所差异，需进行优化。</li>
	<li>使用图像分析软件分析动粒处MAD2的荧光强度。生成z轴最大投影图，然后拆分各通道。</li>
	<li>首先，使用ACA通道创建掩膜：选择ACA通道，设定阈值以识别所有动粒信号。进入编辑选项卡并创建选区，然后基于该选区生成ROI（感兴趣区域）。</li>
	<li>选择MAD2通道，并导入步骤4.12中创建的选区。选择最适合MAD2信号的阈值方法，并测量荧光强度。 
	注意：应在对照处理组中确定阈值方法，并在分析不同处理组时保持一致。</li>
	<li>为计算相对像素强度，将每个细胞的强度值除以实验中野生型（WT）卵母细胞的平均强度值。</li>
</ol>

<ol><li>Gruhn, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+errors+in+human+eggs+shape+natural+fertility+over+reproductive+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span.</a> Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).</li>
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<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2851(2011).</li>
<li>Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+specific+phosphodiesterase+isoenzyme+inhibitors+during+in+vitro+maturation+of+bovine+oocytes+on+meiotic+and+developmental+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity.</a> Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).</li>
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<li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li>
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<li>Hagting, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+securin+proteolysis+is+controlled+by+the+spindle+checkpoint+and+reveals+when+the+APC%2FC+switches+from+activation+by+Cdc20+to+Cdh1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1.</a> Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+RZZ+and+Bub1-KNL1+in+mitotic+checkpoint+signaling+and+kinetochore+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion.</a> Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).</li>
<li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

纺锤体组装检查点是细胞分裂过程中一种关键的调控机制，旨在防止染色体分离错误。该机制使细胞有足够时间纠正动粒-微管（KT-MT）的异常连接。卵母细胞的减数分裂是一个易出错的过程，大多数染色体错误分离发生在减数分裂I期，导致非整倍体卵子的产生，而这是人类早期流产和不孕的主要原因1,24。目前有多种假说正在被验证，以阐明为何雌性减数分裂容易出错。其中一个可能的原因是，与体细胞相比，纺锤体组装检查点（SAC）效率较低，允许在一个或多个动粒错误连接的情况下启动后期9,10,25。因此，全面研究卵母细胞中SAC的作用机制并鉴定其关键调控因子，对于理解整倍体卵子形成过程至关重要。
本方案描述了三种用于评估纺锤体组装检查点（SAC）完整性的不同方面的技术：激活与沉默。由于每种检测方法在结果解读上均...

非整倍体由染色体分离错误引起，是早期流产的主要原因，并与减数分裂过程中的错误高度相关1。减数分裂不同于有丝分裂，因其包含两次细胞分裂，而其间无DNA复制步骤。在减数分裂I中，同源染色体分离，而姐妹染色单体仍保持在一起。在卵母细胞中，该步骤容易出错，导致产生非整倍体卵子2。
为防止染色体分离错误，大多数细胞类型会激活一种称为纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint, SAC）的监控机制，以暂停细胞周期。该机制可感知动粒（kinetochore, KT）与微管（microtubule, MT）之间的连接状态，并在染色体以双极方式排列时感知由此产生的张力3。未连接微管的动粒会触发SAC反应，该反应始于SAC的主要调控因子MPS1被招募至动粒3,4。MPS1启动其他SAC组分的招募，作为平台形成有丝分裂检查点复合物（mitotic checkpoint complex, MCC）。MCC由MAD1、MAD2、BUB3和BUBR1组成，可扩散至细胞质中，通过结合并隔离APC/C的激活因子CDC20来抑制APC/C的活化。当所有动粒均稳定连接微管且染色体排列于中期板时，SAC被沉默，MCC解离并释放CDC20，从而允许APC/C被激活。活化的APC/C降解Securin和Cyclin B，这是启动后期（anaphase）的两个关键步骤5,6。在体细胞中，SAC非常严格，单个未连接的动粒即可激活该检查点，并足以诱导细胞周期停滞6。然而，在卵母细胞减数分裂过程中，SAC更为宽松，卵母细胞即使存在一个或多个未连接的动粒，仍可进入减数第一次分裂后期（anaphase I）6,7,8,9,10。理解为何卵母细胞中SAC更为宽松，是当前研究领域持续关注的重点。导致SAC激活或SAC沉默缺陷的机制，可能引发染色体分离错误，或导致细胞周期长期停滞及细胞死亡。因此，评估维持卵母细胞SAC完整性的机制，对于理解形成健康、整倍体卵子的过程至关重要。
本方案通过检测纺锤体组装检查点（SAC）的不同关键步骤，全面评估小鼠卵母细胞减数分裂过程中SAC的完整性。首先，描述了在诱导SAC激活后评估SAC反应的方法。该激活通过使用诺考达唑（nocodazole）产生未附着的动粒来实现，诺考达唑是一种可使微管（MTs）去聚合的药物11。其次，通过追踪卵母细胞成熟过程中Securin的降解动态，描述了一种监测SAC沉默的方法。最后，采用基于免疫荧光的检测方法，测量MAD2（MCC组分之一）在动粒上的招募情况。上述这些检测方法共同对卵母细胞减数分裂成熟过程中的SAC完整性进行了全面评估。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔-Alexa-568</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 成像系统</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>EVOS 载物台培养箱</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>培养箱腔室</td></tr><tr><td>未包被玻璃底 96 孔板 N 1.5</td><td>MatTek Corporation</td><td>P96G-1.5-5-F</td><td></td></tr><tr><td>羊抗人-Alexa-633</td><td>Life Technologies</td><td>A21091</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>人源抗 ACA 抗体</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-234</td><td>稀释比例 1/30</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>配备 63&amp;times;, 1.40 NA 油浸物镜的 Leica SP8 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Sigma</td><td>M7774</td><td></td></tr><tr><td>米力农</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 MAD2 抗体</td><td>Biolegend</td><td>924601</td><td>稀释比例 1/1000；先前为 Covance #PRB-452C</td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

非整倍体是导致人类早期流产和妊娠失败的主要遗传异常。大多数导致非整倍体的染色体分离错误发生在卵母细胞的减数分裂过程中，但目前尚不完全清楚为何卵母细胞的减数分裂容易出错。在细胞分裂过程中，细胞通过激活纺锤体组装检查点（SAC）来防止染色体分离错误。这一调控机制依赖于对动粒（KT）-微管（MT）连接的检测以及对纺锤体纤维所产生的张力的感知。当动粒未与微管连接时，SAC被激活，从而阻止细胞周期的进程。SAC首先由MPS1激酶激活，进而触发有丝分裂检查点复合物（MCC）的招募和形成，该复合物由MAD1、MAD2、BUB3和BUBR1组成。随后，MCC扩散至细胞质中并结合CDC20，即后期促进复合物/环体（APC/C）的激活因子。一旦动粒与微管连接且染色体排列在中期板上，SAC即被沉默，CDC20被释放，APC/C被激活，从而引发Cyclin B和Securin的降解，促使细胞进入后期。与体细胞相比，卵母细胞中的SAC功能较弱，因为即使存在未连接的动粒，细胞仍可进入后期。目前仍需进一步研究以明确SAC为何更具宽容性，以及这种宽容性是否是导致卵母细胞染色体分离错误的原因之一。本实验方案描述了三种用于全面评估小鼠卵母细胞SAC完整性的技术。这些技术包括使用诺考达唑（nocodazole）解聚微管以评估SAC反应，通过监测Securin降解的动力学来追踪SAC的沉默过程，以及通过免疫荧光检测MAD2在动粒上的招募情况。这些技术共同提供了对SAC完整性的全面评估，有助于深入理解产生健康卵子所需的关键机制。

通过诺考达唑处理评估纺锤体组装检查点（SAC）的响应性 
本实验的目的是评估SAC的激活状态及其强度。使用诺考达唑使纺锤体微管解聚，导致所有动粒均未与微管连接，从而引发由SAC介导的细胞周期阻滞。在当前的成像系统中，经DMSO处理的对照组卵母细胞在从米力农释放后约14小时排出第一极体（图1，上图）。与SAC激活一致，经诺考达唑处理的卵母细胞阻滞在第一次减数分裂中期，且未排出极体（图1，中图）。为了证明该检测方法是SAC活性的可靠指标，我们使用MPS1抑制剂雷维斯尼（reversine）来阻止SAC的激活21。当SAC无法被激活时，卵母细胞即使缺乏动粒-微管（KT-MT）连接，仍会排出极体（图1，下图）。SAC功能减弱的卵母细胞则表现出混合表型——部分卵母细胞发生阻滞，而另一些则排出极体17。该通过诺考达唑处理与否来成熟小鼠卵母...

染色体分离错误是卵母细胞中的常见现象。因此，研究纺锤体组装检查点可为产生健康卵子所需的机制提供重要线索。本方案描述了三种互补的检测方法，用于评估小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点的完整性。

非整倍体是导致人类早期流产和妊娠失败的主要遗传异常。大多数染色体分离错误由此...

非整倍体是人类早期流产最主要的遗传学原因。染色体分离的大多数错误发生在卵母细胞的减数分裂过程中。因此，评估卵母细胞中纺锤体组装检查点对于理解卵母细胞为何容易出错至关重要。本文中，我们描述了三种通过结合活体成像和免疫荧光技术，检测小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点（SAC）完整性的方法，分别针对检查点中的不同关键步骤进行系统评估。实验操作将由本实验室的研究助理 Dr. Cecilia Blengini 演示。首先，按照论文所述，准备 1 毫升含有诺考达唑（nocodazole）和雷沃斯宁（reversine）的培养基，并以 DMSO 作为对照。进行卵母细胞成熟和活体成像时，使用已在培养箱中预热的96孔板。分别向第一、第二和第三孔中加入150 µL的对照DMSO、诺考达唑（nocodazole）以及诺考达唑加雷沃森（reversine）处理液，并将该板置于培养箱中，保持与文中所述相同的培养条件。为启动卵母细胞成熟，将卵母细胞依次转移至6滴含有DMSO但不含米力农的100微升培养液中，以去除米力农。然后将其放入96孔板中对应的孔内。操作时在体视显微镜下观察卵母细胞，并使用手动或口控移液器进行操作。使用配备有孵育室的明场显微镜对卵母细胞进行成像，孵育室环境控制在37摄氏度、5%二氧化碳和80%湿度。以20分钟为间隔，在24小时内采集卵母细胞中层平面的图像。通过识别发生不对称胞质分裂、在卵细胞旁出现一个小细胞且该小细胞位于共同的透明带内的细胞，统计排出极体的卵母细胞数量。使用成像软件查看图像。将前期一停滞的卵母细胞显微注射预先制备好的浓度为100纳克每微升的securin-gfp cRNA。显微注射后，将卵母细胞置于二氧化碳培养箱中恢复，并翻译RNA至少三小时。然后在96孔板的三个不同孔中，分别加入150微升含有或不含5微摩尔诺考达唑的培养基，以及150微升含有0.5微摩尔逆转素的培养基。将显微注射后的卵母细胞通过六滴不含米力农的培养基进行洗涤，并将三分之一的卵母细胞转移至每种处理组中。将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳和80%湿度的培养箱中，直至卵母细胞恢复减数分裂，大约在洗去米力农后三小时。使用配备培养室的荧光显微镜记录卵母细胞成熟的图像。采用图像分析软件定量分析securin-gfp的降解情况，并打开GFP通道的图像，从时间0.1开始。在首选的分析软件中，使用选择工具或形状工具标记每个卵母细胞，并为每个细胞生成一个感兴趣区域。使用相同的感兴趣区域选择一个背景区域，用于后续扣除，并在所有时间点测量每个感兴趣区域内的GFP像素强度。最后，从每个GFP值中减去背景区域的测量值。将减数分裂分为三组后，将每组减数分裂细胞转移至100 µL不含米力农的培养液滴中。用矿物油覆盖液滴，并将它们分别置于培养箱中孵育3小时、5小时和7小时，以使其分别达到早前期I、晚前期I和中期I阶段。在指定时间点，使用九孔玻璃培养皿，将卵母细胞转移至含有2%多聚甲醛的PME缓冲液500 µL液滴中，在室温下固定20分钟。然后将细胞转移至含有500微升封闭液的新孔中。为继续检测MAD2，将卵母细胞转移至含有500微升通透化溶液的新孔中。在室温下孵育20分钟后，将细胞转移至新的封闭液孔中，孵育10分钟。将卵母细胞转移至含有抗MAD2抗体和抗着丝粒抗体的30微升封闭液液滴中，在室温下孵育2小时。将细胞转移至添加了0.5%Triton的30微升PME缓冲液液滴中，以洗去多余的初级抗体，并在湿盒中孵育10分钟。将细胞转移至含有次级抗体（如抗人633和抗兔568）的30微升封闭液液滴中。室温孵育一小时。将细胞转移到含有 DAPI 的 10 µL 封片剂液滴中，以在显微镜载玻片上封片。在盖玻片的每个角落添加少量凡士林小点。小心地将它们放置在封片剂液滴上方，并缓慢按压以使其均匀分布。使用透明指甲油将盖玻片密封固定在载玻片上。使用配备40或63倍物镜的共聚焦显微镜对动粒进行成像。利用抗着丝粒抗体信号确定能够对整个染色体区域进行成像的Z轴范围。经DMSO处理的对照组卵母细胞在从米力农释放后约14小时排出第一极体。在SAC激活后，经诺考达唑处理的卵母细胞阻滞在第一次减数分裂中期，未排出极体。然而，在没有SAC激活的情况下，卵母细胞即使没有动粒微管连接，仍会排出一个极体。评估了卵母细胞成熟过程中securin-gfp的降解速率。其中，经对照DMSO处理的卵母细胞，其securin-gfp荧光强度在米力农洗脱后约10小时开始下降。当卵母细胞在SAC激活剂诺考达唑存在下成熟时，securin-gfp的水平在整个减数成熟期间保持稳定。相比之下，当使用雷沃斯宁处理以抑制SAC激活时，securin-gfp的模式加快，降解始于米力农洗脱后约4小时，这与SAC被抑制的结果一致。采用共聚焦成像技术检测了发育至早前期I、晚前期I和中期I的卵母细胞的着丝粒和MAD2。为了评估纺锤体组装检查点（SAC）信号的强度，对定位于动粒的MAD2蛋白的像素强度进行了定量分析。在早前期I阶段，当大多数动粒尚未与微管连接时，MAD2在动粒上的招募水平显著。随着进入晚前期I，MAD2的水平逐渐降低；当所有动粒均稳定连接微管后，至中期I时MAD2信号几乎完全消失。需要强调的是，每种技术都有其局限性和相应的解读方式。我们建议结合使用这些方法来评估纺锤体组装检查点（SAC）的完整性。这三种实验方法使研究人员能够评估卵母细胞中SAC的严格性，从而深入了解人类卵子非整倍体的潜在成因。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

评估小鼠卵母细胞中纺锤体组件检查点完整性

卵母细胞在减数分裂成熟过程中由于染色体分离错误而容易发生非整倍性。非整倍体卵子可导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。本文介绍了将目标物质导入卵母细胞的方法，以及研究减数分裂成熟过程和评估倍性的方法。...

小鼠卵母细胞显微注射、成熟及倍性评估

本文介绍了一种通过特异性siRNA介导的mRNA耗竭，随后进行免疫荧光分析，以评估小鼠卵母细胞中减数分裂纺锤体组装与结构的实验方案。该方案适用于 体外...

通过siRNA介导的沉默技术评估小鼠卵母细胞中的减数分裂纺锤体

本文介绍了一种基于核仁组织对小鼠窦状卵泡卵母细胞进行表征的实验方案。...

基于核仁染色质结构的小鼠窦卵泡卵母细胞的分离与鉴定

已知哺乳动物的卵子发生过程容易出错，尤其是由于染色体错误分离所致。本文描述了小鼠减数分裂前期、中期I和中期II阶段卵母细胞的染色质铺展制备方法。这些基础技术可用于研究哺乳动物卵子发生过程中染色质结合蛋白及染色体形态的变化。...

从前期到第二次减数分裂中期的小鼠卵母细胞发育分析用染色质铺展制备方法

随着与人类疾病相关的遗传变异逐渐被揭示，开发能够快速评估这些已鉴定变异生物学意义的系统变得日益重要。本方案描述了利用小鼠卵母细胞评估人类基因在女性减数分裂Ⅰ期中功能的方法。...

利用小鼠卵母细胞评估人类基因在减数分裂Ⅰ期的功能

我们提供了利用偏振光显微镜无创评估人类卵子成熟度的临床方案概述。...

人类卵母细胞成熟度评估及其临床应用

本文介绍了一种优化的实验方案，利用近红外飞秒激光在小鼠卵母细胞第一次减数分裂中期实现细胞质微管组织中心的去除。...

小鼠卵母细胞胞质微管组织中心的多光子激光消融

维持卵母细胞基因组的完整性对于确保胚胎遗传信息的准确性至关重要。本文介绍了一种用于检测哺乳动物雌性生殖细胞中DNA双链断裂的精确方案。...

小鼠卵母细胞中DNA双链断裂的检测

小鼠卵母细胞减数分裂染色体铺片的制备用于联会与重组的评估

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

了解如何通过活细胞成像和免疫荧光技术评估小鼠卵母细胞中的纺锤体组装检查点完整性。该方法结合实时成像与蛋白检测，帮助研究人员深入理解染色体分离机制及其在生殖生物学中的重要意义。

小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

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