小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点完整性的评估

非整倍体是人类早期流产最主要的遗传学原因。染色体分离的大多数错误发生在卵母细胞的减数分裂过程中。因此，评估卵母细胞中纺锤体组装检查点对于理解卵母细胞为何容易出错至关重要。

本文中，我们描述了三种通过结合活体成像和免疫荧光技术，检测小鼠卵母细胞中纺锤体组装检查点（SAC）完整性的方法，分别针对检查点中的不同关键步骤进行系统评估。实验操作将由本实验室的研究助理 Dr. Cecilia Blengini 演示。首先，按照论文所述，准备 1 毫升含有诺考达唑（nocodazole）和雷沃斯宁（reversine）的培养基，并以 DMSO 作为对照。

进行卵母细胞成熟和活体成像时，使用已在培养箱中预热的96孔板。分别向第一、第二和第三孔中加入150 µL的对照DMSO、诺考达唑（nocodazole）以及诺考达唑加雷沃森（reversine）处理液，并将该板置于培养箱中，保持与文中所述相同的培养条件。

为启动卵母细胞成熟，将卵母细胞依次转移至6滴含有DMSO但不含米力农的100微升培养液中，以去除米力农。然后将其放入96孔板中对应的孔内。操作时在体视显微镜下观察卵母细胞，并使用手动或口控移液器进行操作。

使用配备有孵育室的明场显微镜对卵母细胞进行成像，孵育室环境控制在37摄氏度、5%二氧化碳和80%湿度。以20分钟为间隔，在24小时内采集卵母细胞中层平面的图像。通过识别发生不对称胞质分裂、在卵细胞旁出现一个小细胞且该小细胞位于共同的透明带内的细胞，统计排出极体的卵母细胞数量。

使用成像软件查看图像。将前期一停滞的卵母细胞显微注射预先制备好的浓度为100纳克每微升的securin-gfp cRNA。显微注射后，将卵母细胞置于二氧化碳培养箱中恢复，并翻译RNA至少三小时。

然后在96孔板的三个不同孔中，分别加入150微升含有或不含5微摩尔诺考达唑的培养基，以及150微升含有0.5微摩尔逆转素的培养基。将显微注射后的卵母细胞通过六滴不含米力农的培养基进行洗涤，并将三分之一的卵母细胞转移至每种处理组中。

将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳和80%湿度的培养箱中，直至卵母细胞恢复减数分裂，大约在洗去米力农后三小时。使用配备培养室的荧光显微镜记录卵母细胞成熟的图像。采用图像分析软件定量分析securin-gfp的降解情况，并打开GFP通道的图像，从时间0.1开始。

在首选的分析软件中，使用选择工具或形状工具标记每个卵母细胞，并为每个细胞生成一个感兴趣区域。使用相同的感兴趣区域选择一个背景区域，用于后续扣除，并在所有时间点测量每个感兴趣区域内的GFP像素强度。最后，从每个GFP值中减去背景区域的测量值。

将减数分裂分为三组后，将每组减数分裂细胞转移至100 µL不含米力农的培养液滴中。用矿物油覆盖液滴，并将它们分别置于培养箱中孵育3小时、5小时和7小时，以使其分别达到早前期I、晚前期I和中期I阶段。在指定时间点，使用九孔玻璃培养皿，将卵母细胞转移至含有2%多聚甲醛的PME缓冲液500 µL液滴中，在室温下固定20分钟。

然后将细胞转移至含有500微升封闭液的新孔中。为继续检测MAD2，将卵母细胞转移至含有500微升通透化溶液的新孔中。在室温下孵育20分钟后，将细胞转移至新的封闭液孔中，孵育10分钟。

将卵母细胞转移至含有抗MAD2抗体和抗着丝粒抗体的30微升封闭液液滴中，在室温下孵育2小时。将细胞转移至添加了0.5%Triton的30微升PME缓冲液液滴中，以洗去多余的初级抗体，并在湿盒中孵育10分钟。将细胞转移至含有次级抗体（如抗人633和抗兔568）的30微升封闭液液滴中。

室温孵育一小时。将细胞转移到含有 DAPI 的 10 µL 封片剂液滴中，以在显微镜载玻片上封片。在盖玻片的每个角落添加少量凡士林小点。

小心地将它们放置在封片剂液滴上方，并缓慢按压以使其均匀分布。使用透明指甲油将盖玻片密封固定在载玻片上。使用配备40或63倍物镜的共聚焦显微镜对动粒进行成像。

利用抗着丝粒抗体信号确定能够对整个染色体区域进行成像的Z轴范围。经DMSO处理的对照组卵母细胞在从米力农释放后约14小时排出第一极体。在SAC激活后，经诺考达唑处理的卵母细胞阻滞在第一次减数分裂中期，未排出极体。

然而，在没有SAC激活的情况下，卵母细胞即使没有动粒微管连接，仍会排出一个极体。评估了卵母细胞成熟过程中securin-gfp的降解速率。其中，经对照DMSO处理的卵母细胞，其securin-gfp荧光强度在米力农洗脱后约10小时开始下降。

当卵母细胞在SAC激活剂诺考达唑存在下成熟时，securin-gfp的水平在整个减数成熟期间保持稳定。相比之下，当使用雷沃斯宁处理以抑制SAC激活时，securin-gfp的模式加快，降解始于米力农洗脱后约4小时，这与SAC被抑制的结果一致。采用共聚焦成像技术检测了发育至早前期I、晚前期I和中期I的卵母细胞的着丝粒和MAD2。

为了评估纺锤体组装检查点（SAC）信号的强度，对定位于动粒的MAD2蛋白的像素强度进行了定量分析。在早前期I阶段，当大多数动粒尚未与微管连接时，MAD2在动粒上的招募水平显著。随着进入晚前期I，MAD2的水平逐渐降低；当所有动粒均稳定连接微管后，至中期I时MAD2信号几乎完全消失。

需要强调的是，每种技术都有其局限性和相应的解读方式。我们建议结合使用这些方法来评估纺锤体组装检查点（SAC）的完整性。这三种实验方法使研究人员能够评估卵母细胞中SAC的严格性，从而深入了解人类卵子非整倍体的潜在成因。