Name: 在2D结构中模拟人类小脑体 外 发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 了解利用诱导多能干细胞在二维单层结构中生成小脑细胞的细胞培养技术。该方法可研究早期人类小脑发育及其与神经精神疾病的关联，为发育和病理研究提供经济高效的实验模型。

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我们感谢Jenny Gringer Richards在验证对照受试者方面所做的细致工作，对照诱导多能干细胞（iPSCs）即来源于这些受试者。本研究得到以下资助：NIH T32 MH019113（资助D.A.M.和K.A.K.）、Nellie Ball信托基金（资助T.H.W.和A.J.W.）、NIH R01 MH111578（资助V.A.M.和J.A.W.）、NIH KL2 TR002536（资助A.J.W.），以及Roy J. Carver慈善信托基金（资助V.A.M.、J.A.W.和A.J.W.）。&#160;插图使用BioRender.com制作。

本研究已获得爱荷华大学机构审查委员会批准，批准编号为 201805995，以及爱荷华大学人类多能干细胞委员会批准，批准编号为 2017-02。在取得受试者书面知情同意后，采集其皮肤活检样本。成纤维细胞在 DMEM 培养基中培养，添加 15% 胎牛血清（FBS）和 1% MEM 非必需氨基酸溶液，培养条件为 37 °C、5% CO2。使用附加体质粒重编程试剂盒对成纤维细胞进行重编程，电穿孔转染采用核转染仪，操作步骤遵循制造商说明书（见材料表）。所有操作均在 II 级 A2 型生物安全柜（简称&#34;hood&#34;）中进行。所有细胞培养基均不含抗生素；因此，所有进入生物安全柜的物品均需用 70% 乙醇擦拭清洁。所有细胞培养基及组分均经过无菌过滤或在生物安全柜内开启，以维持无菌状态。
1. 实验准备
<ol>
	<li>制备基底膜基质（BMM）包被的培养板。 
	注意：BMM在较高温度下凝固更快。必须快速制备培养板，并立即置于4 °C保存。
	<ol>
		<li>将BMM（参见材料表）置于冰上或4 °C环境中解冻，至少2小时，或过夜。</li>
		<li>将DMEM/F12与BMM混合，终浓度为80 µg/mL。将BMM溶液分装至组织培养皿中（35 mm培养皿加1 mL，60 mm培养皿加2 mL），在接种细胞前于37 °C孵育至少1小时或过夜。 
		注意：未使用的培养皿可在4 °C保存2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白（PLO/层粘连蛋白）包被的培养板。
	<ol>
		<li>用无菌DPBS+/+配制20 µg/mL的PLO（参见材料表），每孔加入1 mL至6孔板中。在培养箱中37 °C孵育过夜。</li>
		<li>次日，用真空吸液器吸除PLO溶液，并用DPBS+/+洗涤两次。在生物安全柜中自然晾干。 
		注意：晾干后的培养板可用铝箔包裹，在4 °C保存最多2周，以备后续使用。</li>
		<li>用DPBS+/+配制10 µg/mL的层粘连蛋白（参见材料表），每孔加入1 mL至6孔板中。在培养箱中37 °C孵育至少3小时或过夜。</li>
		<li>用真空吸液器吸除层粘连蛋白溶液，每孔加入1 mL培养基或无菌DPBS+/+。 
		注意：层粘连蛋白包被表面不得干燥。应立即加入PBS或适当的培养基以防止干燥。包被后的培养板可在4 °C保存最多2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备多能干细胞（PSC）传代溶液。 
	注意：制备PSC传代溶液需要使用渗透压计（参见材料表）10。
	<ol>
		<li>将11.49 g氯化钾（KCl）和0.147 g二水合柠檬酸钠（HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O）溶解于400 mL无菌细胞培养级水中（参见材料表）。</li>
		<li>测量溶液总体积，并记录为初始体积（Vi）。</li>
		<li>测定渗透压，并根据公式 Vi × Oi = Vf × 570 mOsm，通过添加无菌细胞培养级水将渗透压调整至570 mOsm。</li>
		<li>使用0.20 µm滤器过滤除菌，分装为10 mL等份。室温（RT）保存，最长可达6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备多能干细胞（PSC）培养基。 
	注意：iPSC在含有耐热型FGF2的培养基中维持培养（参见材料表），可实现无需周末换液的培养方案。本实验方案未尝试其他市售PSC培养基。
	<ol>
		<li>将PSC培养基添加剂在4 °C过夜解冻。</li>
		<li>将10 mL PSC培养基添加剂加入500 mL基础PSC培养基中。分装为25 mL等份，于−20 °C保存。 
		注意：冷冻等份可在−20 °C保存6个月。解冻后的等份应保存于4 °C，并在2周内使用完毕。细胞可使用含10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）的PSC培养基进行冷冻，用于长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备PSC复苏培养基。
	<ol>
		<li>在PSC培养基中添加50 nM chroman、1.5 µM emricasan、1x 多胺添加剂和0.7 µM trans-ISRIB（CEPT鸡尾酒11）（参见材料表）。</li>
		<li>使用0.20 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，最长可保存4周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备拉制玻璃移液管。
	<ol>
		<li>在本生灯上方将22.9 cm（9英寸）长的玻璃巴斯德移液管拉成两段，断裂位置约在颈部下方2 cm处，形成两根移液管，其中较细的一段比另一段短约4 cm。</li>
		<li>借助火焰将拉细端的尖端弯曲，形成平滑的&#34;r&#34;形。</li>
		<li>将拉制好的移液管放入高压灭菌袋中，进行高压灭菌以实现灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备小脑分化培养基（CDM）。
	<ol>
		<li>将IMDM与Ham's F12营养混合物按1:1比例混合。向混合液中添加1x L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂、1%（v/v）化学成分明确的脂质浓缩液、0.45 mM 巯基甘油、15 µL/mL 去铁转铁蛋白、5 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）和7 µg/mL 胰岛素（参见材料表）。</li>
		<li>使用0.20 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，并在1个月内使用完毕。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备小脑成熟培养基（CMM）。
	<ol>
		<li>在Neurobasal培养基中添加1x L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂和1x N-2添加剂（参见材料表）。</li>
		<li>使用0.20 µm滤器过滤除菌，4 °C保存，并在2周内使用完毕。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 无饲养层iPSC培养
<ol>
	<li>按照以下步骤解冻细胞。
	<ol>
		<li>将BMM培养板（步骤1.1）放入37 °C培养箱中，使其凝固至少1小时或过夜，然后再解冻细胞。</li>
		<li>在37 °C下预热10 mL PSC解冻培养基（步骤1.5）。</li>
		<li>将装有细胞的冻存管从液氮中转移至37 °C水浴中。 
		注意：为避免在细胞培养环境中产生污染源，不建议使用标准水浴锅。可将新鲜水在小烧杯中加热至37 °C，制成一次性使用的水浴。</li>
		<li>当冻存管中仅剩一小块冰时，将其从水浴中取出，擦干管体，并喷洒70%乙醇。将冻存管转移至超净台，使用2 mL或5 mL血清移液管（见材料表），轻柔地将细胞转移至15 mL锥形离心管中。</li>
		<li>在轻轻旋转锥形管的同时，逐滴加入8 mL PSC解冻培养基。在室温下以200 × g离心5分钟。</li>
		<li>使用真空抽吸装置小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞重悬于2 mL PSC解冻培养基中。</li>
		<li>吸除培养板中的BMM，将重悬的细胞逐滴均匀地加入培养板中。</li>
		<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中。次日更换为PSC培养基，之后每日更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤维持细胞培养。
	<ol>
		<li>在37 °C下预热所需体积的PSC培养基（例如，每35 mm培养板使用1 mL培养基）。</li>
		<li>观察培养板中是否存在分化细胞或克隆，并使用拉制玻璃移液管（步骤1.6）去除分化细胞。 
		注意：iPSC克隆具有光滑的边缘，细胞形态一致。</li>
		<li>每日更换耗尽的培养基，每3-4天传代一次，或在细胞融合度达到70%时进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>传代细胞。
	<ol>
		<li>在传代前至少1小时或过夜，将所需数量的BMM培养板放入培养箱中。在37 °C下预热所需量的PSC培养基（步骤1.3）。</li>
		<li>使用拉制玻璃移液管清除任何分化细胞或克隆。</li>
		<li>使用真空抽吸装置吸除耗尽的培养基，每35 mm培养皿加入1 mL PSC解离培养基。在37 °C孵育1-3分钟。 
		注意：如果在加入PSC培养基前，克隆已在PSC传代溶液中脱落，可缩短孵育时间。</li>
		<li>吸除PSC传代溶液，加入预热的PSC培养基。</li>
		<li>使用无菌200 µL移液器吸头，在一个方向上平行划线，然后将培养板旋转90°，再划一组与之前垂直的划线（在培养板上形成交叉网格图案）。</li>
		<li>从设定好的培养板中吸除BMM溶液。使用血清移液管收集克隆，并将其分配至新的BMM培养板中。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育。每日更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻存细胞。
	<ol>
		<li>通过标记内容准备冻存管，并在超净台中用紫外光（UV）灭菌30分钟（见材料表）。</li>
		<li>通过向PSC培养基中添加10%（v/v）DMSO制备PSC冻存培养基。参照步骤2.3.2-2.3.5操作。</li>
		<li>使用5 mL血清移液管将细胞转移至15 mL锥形离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟。</li>
		<li>小心吸除培养基，将细胞沉淀重悬于PSC冻存培养基中。</li>
		<li>分装至冻存管中。将冻存管放入冻存盒，并置于−80 °C冰箱中。</li>
		<li>次日，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小脑分化
注意：开始分化前，将诱导多能干细胞传代至六个35 mm培养皿中，当细胞融合度达到70%时即可进行分化。每个35 mm培养皿将转移至6孔板中的一个孔。
<ol>
	<li>第0天，将健康的iPSC集落转移至悬浮培养以形成拟胚体（EB）。
	<ol>
		<li>向6孔超低吸附（ULA）培养板的每孔中加入1 mL CDM（见步骤1.7），并添加10 µM Y-27632和10 µM SB431542（参见材料表），放入培养箱中预温，待转移的集落准备好后立即加入各孔。</li>
		<li>使用拉制的玻璃移液管清除已分化的细胞。吸除培养基后，每35 mm培养皿加入1 mL PSC传代溶液。在37 °C孵育3分钟，随后吸除溶液，并加入2 mL添加了10 µM Y-27632和10 µM SB431542的CDM。 
		注意：若在加入CDM前集落已在PSC传代溶液中脱落，可适当缩短孵育时间。</li>
		<li>在透射光倒置显微镜下，使用4倍物镜，以拉制玻璃移液管的弯曲边缘轻柔地将集落剥离。待所有集落均被剥离后，使用10 mL血清移液管将其全部轻柔转移至6孔ULA板的一个孔中。对每个iPSC培养皿重复此操作。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。 
		注意：若集落过大或相互融合，可用拉制玻璃移液管的尖端将其切分为更小的片段，以形成较小的拟胚体（EB）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天，向每孔中加入FGF2，使其终浓度为50 ng/mL。 
	注意：用于小脑分化的FGF2不耐热。本方案未使用耐热型FGF2进行验证。</li>
	<li>第7天，更换1/3体积的培养基。每孔总培养体积为3 mL时，使用1,000 µL移液器轻柔吸除1 mL用过的培养基，并补充1 mL新鲜CDM。继续将拟胚体（EB）培养7天。</li>
	<li>第14天，使用1,000 µL移液器轻柔吸除绝大部分用过的培养基。为尽量减少对拟胚体的损伤，轻轻晃动培养板使所有拟胚体聚集于板中央，然后倾斜培养板，从边缘缓慢吸除液体。
	<ol>
		<li>随着液体量减少，缓慢将培养板放平并继续吸除，保留足够液体以避免拟胚体干燥。随后，加入3 mL添加了10 µM Y-27632的新鲜CDM。使用10 mL血清移液管将拟胚体转移至PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中（见步骤1.2）。 
		注意：根据后续实验需求，可将拟胚体转移至6孔PLO/层粘连蛋白包被板，或单个拟胚体转移至PLO/层粘连蛋白包被的24孔板的单个孔或盖玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第15天，吸除培养基并更换为新鲜CDM。 
	注意：必须向各孔中加入足量培养基，以确保两次换液之间有足够的液体量，因为培养过程中会发生蒸发（例如，6孔板每孔应加入3 mL培养基）。若培养基已开始酸化（变为透明发黄），即使未到预定换液时间，也应立即更换，直至实验结束。</li>
	<li>第21天，吸除用过的培养基并更换为CMM。第28天，更换为新鲜CMM。第35天，收获细胞用于后续实验。</li>
</ol>
4. RNA 提取的样品制备
<ol>
	<li>吸去培养基，向6孔板的每个孔中加入500 µL细胞解离试剂（见材料表）。静置数秒后吸去。</li>
	<li>将培养板盖上盖子，在室温下孵育2分钟。轻敲培养板边缘以使细胞脱落。</li>
	<li>加入1 mL CMM（步骤1.8），并将细胞收集至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>使用台式小型离心机（见材料表）在室温下以最高速度（最大2000 × g）离心30秒，沉淀细胞，弃去上清液，并加入1 mL 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞沉淀。</li>
	<li>再次使用台式小型离心机在室温下离心30秒，沉淀细胞，并用PBS再洗涤一次。</li>
	<li>沉淀细胞后弃去PBS，用含苯酚和异硫氰酸胍的裂解试剂（见材料表）裂解细胞。 
	&#8203;注意：在含苯酚和异硫氰酸胍&#160;的试剂中裂解的细胞&#160;可在−80 °C下保存长达1年。根据所用RNA提取方法和试剂的不同，细胞也可直接在培养皿中裂解。由于培养皿中细胞数量较少，使用硅胶膜离心柱（见材料表）进行RNA提取可获得更高的RNA得率。</li>
</ol>
5. 免疫荧光染色前的细胞准备
注意：对于24孔板，每孔一个EB即可。
<ol>
	<li>第35天，吸除废弃培养基，并向每孔加入1 mL含钙镁的DPBS（DPBS+/+）洗涤细胞（适用于24孔板的一个孔）。</li>
	<li>吸除DPBS+/+，每孔加入500 µL用DPBS+/+配制的预冷4%多聚甲醛（PFA，参见材料表），室温孵育20分钟。</li>
	<li>去除4% PFA，按照步骤5.1的方法用DPBS+/+洗涤细胞两次。每孔加入1 mL DPBS+/+，将细胞置于4 °C保存，直至进行染色。 
	注意：建议在固定后1周内完成免疫荧光染色，以避免细胞脱落和抗原丢失。然而，根据抗体种类及靶标蛋白的细胞定位，固定后最长可在4周内进行染色。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

模拟人类小脑发育的能力 体外 对于疾病建模以及深入理解正常脑发育具有重要意义。更简单且成本较低的实验方案有助于在多个科研实验室中生成可重复的数据，并促进广泛实施。本文描述了一种小脑分化方案，采用经改良的拟胚体（EBs）生成方法，无需使用酶或解离试剂，并结合Muguruma等报道的生长因子.4 以及一种改良的二维单层细胞培养方案，该方案类似于Holmes等人的方法.5.
整个实验方案首先从诱导多能干细胞（iPSCs）生成拟胚体（EBs），随后诱导小脑分化，最后进行二维单层培养的铺板。在此过程中，第7至14天之间可观察到大量细胞死亡。由于存在细胞损失，建议起始时使用较大量的拟胚体；对于一孔6孔板的二维培养细胞，建议至少从六块培养板（直径35 mm或60 mm）的iPSCs开始。此外，在将拟胚体接种至PLO/层粘连蛋白包被的培养皿时加入Y-27632，可显著提高拟胚体在基质上的贴附率。需定期肉眼检查培养体系中的培养基状态。若发现培养基变黄（...

理解人类小脑发育过程及其关键时间窗口，不仅对于揭示神经发育障碍的潜在病因至关重要，也有助于发现新的治疗干预靶点。人类小脑发育的建模 体外 一直具有挑战性，但随着时间推移，已涌现出多种将人类胚胎干细胞（hESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）分化为小脑谱系命运的实验方案1,2,3,4,5,6,7,8此外，建立能够产生可重复结果、相对简单（以减少误差）且不涉及高昂经济成本的实验方案非常重要。
最早的关于小脑分化的实验方案是通过将胚状体（EBs）接种于二维培养体系中，并利用多种生长因子诱导其向小脑命运分化而建立的，这些生长因子的作用方式类似于 体内 发育，包括 WNT、BMPs 和 FGFs1,9近期发表的方案主要在三维类器官培养中使用 FGF2 和胰岛素诱导分化，随后使用 FGF19 和 SDF1 生成菱脑唇样结构3,4，或使用了 FGF2、FGF4 和 FGF8 的组合5两种小脑类器官诱导方法均获得了相似的三维小脑类器官，因为两种方案在相同时间点均报告了相似的小脑标志物表达。Holmes 和 Heine 对其三维方案进行了扩展5 以证明可从最初形成3D聚集体的人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）生成2D小脑细胞。此外，Silva等7 证明了采用与Holmes和Heine相似的方法，通过调整从3D转换至2D培养的时间点，并延长生长和成熟时间，可生成代表成熟小脑神经元的2D细胞。
本方案通过使用胰岛素和FGF2诱导无饲养层的诱导多能干细胞（iPSCs）形成悬浮培养的类胚体（EBs），并在第14天将EBs接种于PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中进行二维生长与分化，从而诱导小脑命运。至第35天可获得具有小脑特征的细胞。该方法能够在二维环境中重现小脑发育的早期阶段，使研究人员能够针对需要单层结构进行实验的特定科学问题开展研究。此外，本方案易于进一步优化，例如结合微图案化表面、轴突发芽实验以及细胞分选技术，以富集目标细胞群体。

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26D</td><td></td></tr><tr><td>1-硫代甘油</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-26B</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 滤器单元，0.2 &amp;micro;m aPES，50 mm 直径</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 易握式组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>4D 核转染核心单元</td><td>Lonza</td><td>276885</td><td>Nucleofector</td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25D</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 易握式组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>6 孔超低吸附培养板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>9&quot; 一次性巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>脱铁转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>化学成分明确的脂质浓缩液</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Cayman</td><td>34681</td><td></td></tr><tr><td>II 级 A2 型生物安全柜</td><td>NuAire, Inc.</td><td>NU-540-600</td><td>生物安全柜，带紫外灯</td></tr><tr><td>Costar 24 孔板，TC 处理</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 孔板，TC 处理</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Cayman</td><td>22204</td><td></td></tr><tr><td>Epi5 附加体质粒 iPSC 重编程试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8-Flex</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>含热稳定 FGF2 的 PSC 培养基</td></tr><tr><td>EVOS XL Core 成像系统</td><td>Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优选级</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰胺添加剂</td></tr><tr><td>Ham's F12 营养混合物</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>人抗 EN2 抗体，小鼠来源</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-293311</td><td></td></tr><tr><td>人抗 Ki67/MKI67 抗体，兔来源</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB7617</td><td></td></tr><tr><td>人抗 PTF1a 抗体，兔来源</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-98726</td><td></td></tr><tr><td>人抗 TUBB3 抗体，小鼠来源</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Gibco</td><td>12585</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td>Labnet International</td><td>C1310</td><td>台式迷你离心机</td></tr><tr><td>Monarch RNA 纯化试剂盒（50 &amp;micro;g）</td><td>New England BioLabs</td><td>T2040</td><td>硅胶柱离心纯化柱</td></tr><tr><td>Monarch 总 RNA 小量提取试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>T2010</td><td>硅胶柱离心纯化柱</td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>多胺添加剂</td><td>Sigma</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸（PLO）</td><td>Sigma</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>54317</td><td></td></tr><tr><td>透明自封袋</td><td>Steriking</td><td>SS-T2 (90x250)</td><td>高压灭菌袋</td></tr><tr><td>柠檬酸二钠二水合物&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，无菌，PES 0.22 &amp;micro;m，30 mm 直径</td><td>Research Products International</td><td>256131</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Cayman</td><td>16258</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>苯酚和异硫氰酸胍</td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1x）</td><td>Gibco</td><td>12604039</td><td>细胞解离试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蒸气压渗透压计</td><td>Wescor, Inc.</td><td>Model 5520</td><td>渗透压计</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

模拟人类小脑发育 体外 在二维结构中

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

小脑的精确且适时的发育不仅对准确的运动协调和平衡至关重要，而且对认知功能也具有重要作用。此外，小脑发育的异常已被认为与多种神经发育障碍相关，包括自闭症、注意力缺陷多动障碍（ADHD）和精神分裂症。以往对人类小脑发育的研究仅能通过尸检研究或神经影像学手段进行，然而这些方法在揭示发育过程中发生的分子与细胞水平变化方面存在局限性 体内 在早期发育阶段，许多神经发育障碍开始形成。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）由体细胞生成技术的出现，以及将iPSCs进一步再分化为神经元的能力，为研究这些疾病奠定了基础 体外 早期脑发育的建模。本研究提供了生成适用于二维（2D）单层结构应用的小脑细胞的简化步骤。这些代表早期发育阶段的小脑细胞来源于人诱导多能干细胞（iPSCs） 通过 以下步骤：首先，在三维（3D）培养条件下形成类胚体，随后用 FGF2 和胰岛素处理以促进小脑命运的特化，最后在多聚-L-鸟氨酸（PLO）/层粘连蛋白包被的基质上以单层形式进行终末分化。在分化第35天，由iPSC衍生的小脑细胞培养物表达小脑标志物，包括 ATOH1、PTF1α、PAX6 和 KIRREL2，表明该方案可生成谷氨酸能和GABA能小脑神经元前体细胞以及浦肯野细胞前体细胞。此外，分化所得细胞呈现明显的神经元形态，并对神经元身份的免疫荧光标志物（如 TUBB3）呈阳性。这些细胞表达轴突导向分子，包括Sema4C、Plexin-B2 和 Neuropilin-1，可作为研究神经突起生长和突触连接分子机制的模型。该方法生成的人类小脑神经元适用于需要二维单层培养格式的下游应用，包括基因表达、生理学和形态学研究。

三维至二维小脑分化概述 
小脑细胞从诱导性多能干细胞（iPSCs）开始生成。图1A展示了整体实验流程以及分化过程中主要成分的添加。在第0天，使用拉制的玻璃移液管在含有SB431542和Y-27632的CDM培养基中轻轻提起iPSC集落（图1B），形成拟胚体（EBs），并将其转移至超低吸附培养板中。在第2天加入FGF2。第7天更换三分之一培养基，并观察到拟胚体的形成（图1C）。第14天，将增大的拟胚体（图1D）接种到经PLO/层粘连蛋白包被的培养皿中，培养基为添加Y-27632的CDM。第15天，更换为不含Y-27632的CDM培养基。细胞开始从拟胚体向外迁移（图1E），沿包被表面扩展。第21天进行完全换液，并将培养基更换为CMM。此后每周更换一次培养基（若培养基酸化较快，可更频繁更换）。至第35天，可观...

本方案介绍了从诱导性多能干细胞生成小脑细胞二维单层培养物的方法，用于研究小脑发育的早期阶段。

小脑的精确且适时的发育不仅对准确的运动协调和平衡至关重要，而且对认知功能也至关重要。此外，……

该方法有助于研究早期人类小脑发育过程，以及其在神经精神疾病中可能发生的改变。该方法的主要优势在于，无需执行复杂的操作步骤，即可在二维层状结构中生成发育早期的人类小脑细胞，且具有成本效益。制作拉制毛细管在初期可能较为困难，但通过练习和时间积累，会逐渐掌握更易操作的拉制方法。实验准备开始时，在巴斯德移液管颈部下方约两厘米处进行加热，使用本生灯将一根长22.9厘米的巴斯德移液管拉制成两根玻璃移液管。较细的一端比另一端约短四厘米。将拉制好的移液管尖端在火焰上弯曲，形成平滑的R形，然后将拉制的移液管放入高压灭菌袋中，并在高压灭菌器中进行灭菌。在第0天，向每个六孔超低吸附（ULA）板的孔中加入1毫升小脑分化培养基，培养基中添加10 µM Y-27632和SB-431542，并将培养板放入培养箱中，直至悬浮的细胞集落准备好加入各孔中。使用拉制的玻璃移液管清洗已分化的细胞。吸去培养基，每个35毫米培养皿中加入1毫升iPSC传代溶液。在37摄氏度孵育3分钟后，吸去培养基，加入2毫升小脑分化培养基，培养基中添加10微摩尔Y-27632和SB-431542。在倒置透射光显微镜4倍放大下，用拉制玻璃移液管的弯曲边缘挑起细胞集落。待所有集落均被挑起后，用10毫升血清移液管轻柔地将全部集落转移至一个六孔ULA培养板的孔中。对每一块iPSC培养板重复此操作，并将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育。在第2天，向每个孔中加入FGF2，使其终浓度为50纳克/毫升。在第7天，通过吸取1毫升用过的培养基并替换为1毫升新鲜的小脑分化培养基，更换三分之一的培养基。将拟胚体孵育七天。第14天时，轻轻旋转培养板，使所有拟胚体聚集于培养板中央。然后倾斜培养板，用1000微升移液器从边缘吸除全部用过的培养基。随着培养基量的减少，缓慢将培养板放平并继续吸除培养基，保留足够的液体以避免将胚状体吸出。接着，加入3毫升新鲜的小脑分化培养基，其中添加10微摩尔Y-27632。然后，使用10毫升血清移液管将胚状体转移至经多聚-L-鸟氨酸-层粘连蛋白包被的培养皿中。第15天，吸除培养基，并更换为新鲜的小脑分化培养基。在第0天，将iPSC集落进行清理后转移至含有SB-431542和Y-27632的小脑分化培养基中，并置于超低吸附培养板中以生成拟胚体。第2天加入FGF2，并在第7天更换1/3培养基，结果在第14天观察到拟胚体体积增大。从第15天开始，细胞从类胚体向外迁移到包被的表面。从第21天起将培养基完全更换为小脑成熟培养基，到第35天时形成了具有神经元样形态和复杂结构的单层细胞。第35天的基因表达分析显示，这些细胞表达早期小脑前体细胞标志物，如谷氨酸能前体细胞、ATOH1、GABA能前体细胞、PTF1α，以及浦肯野前体细胞标志物KIRREL2和SKOR2。此外，还观察到菱形唇标志物 OTX2 和主要位于前部的神经元特异性标志物 SIX3 的表达。第35天收获的细胞进行免疫荧光标记，结果显示小脑标志物 EN2 和 PTF1α、神经元标志物 β-tubulin III 以及增殖标志物 KI67 均呈阳性染色。使用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色，显示了细胞核。要成功实现分化，关键在于使用健康且未分化的iPSC集落作为起始材料，并尽可能使用 freshly reconstituted 的试剂。

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在2D结构中模拟人类小脑体 外 发育

本视频展示了一种将人诱导性多能干细胞分化为小脑前体细胞的实验方案。该方案包括将干细胞克隆转移至超低吸附培养板以形成类胚体，利用生长因子促进其分化，随后将类胚体转移至基质包被的培养板以实现贴壁。后续步骤包括诱导细胞迁移，并添加成熟培养基，以引导谷氨酸能和GABA能小脑神经前体细胞以及浦肯野细胞前体的发育。...

一种从诱导性多能干细胞生成小脑细胞二维单层培养的技术

本视频演示了在小鼠原代小脑颗粒神经元中建立神经元损伤模型的方法。该方法概述了使用NMDA（一种兴奋性神经递质受体激动剂）和甘氨酸（一种共激动剂）诱导神经元损伤的步骤。NMDA和甘氨酸结合于特定的神经元受体，导致受体过度激活，从而引起大量细胞内钙离子内流，最终导致神经元损伤和死亡。...

建立小鼠原代小脑颗粒神经元损伤模型

小脑外颗粒层是发育中大脑内发生最大规模过渡性扩增的部位。本文介绍了一种在增殖高峰期靶向该层进行遗传修饰的实验方案 离体...

离体 培养鸡小脑切片及颗粒细胞前体的靶向电穿孔

本方案描述了一种从6-7日龄幼鼠中分离和培养原代小鼠大脑颗粒神经元（CGNs）的简单方法，可高效转导CGNs以进行功能缺失和功能获得研究，并利用同一培养模型模拟NMDA诱导的神经元兴奋性毒性、低钾诱导的细胞死亡、DNA损伤以及氧化应激。...

建立小鼠原代小脑颗粒神经元的神经元死亡与变性模型

我们描述了一种简化的hPSCs三维分化方案，该方案使用成分明确的培养基并减少生长因子，能够生成具有早期神经上皮结构且表达小脑相关标志物的细胞聚集体；此外还提供一种可选的二维改良方法，通过单层培养分化细胞以获得功能性神经元。...

简化的3D小脑分化方案及可选的2D改良方法

本文介绍了一种从小鼠小脑制备脑片器官型培养物的方法，并通过免疫组织化学染色显示髓鞘，适用于研究中枢神经系统中髓鞘形成及再髓鞘化的机制。...

制备及髓鞘化器官型小脑切片培养物的免疫染色

本方案描述了一种动态培养系统，用于在化学成分明确且无饲养层的条件下，利用一次性生物反应器生成尺寸可控的人多能干细胞聚集体，并进一步诱导其向小脑类器官分化。...

由人多能干细胞可扩展地生成成熟小脑类器官及通过免疫染色进行表征

本文描述了一种方法，用于在小鼠出生后脑发育过程中可视化颗粒神经元的突触发生，该时期这些细胞会精细调节其突触结构，并形成突触以整合到整个脑神经回路中。...

利用 体内 出生后电穿孔法研究小脑颗粒神经元形态及突触发育

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

本视频演示了一种从E13大鼠背侧脊髓分离并培养联合神经元的方法。离体培养的联合神经元可用于研究轴突生长与导向的细胞和分子机制。...

从胚胎脊髓中分离和培养联合神经元

了解利用诱导多能干细胞在二维单层结构中生成小脑细胞的细胞培养技术。该方法可研究早期人类小脑发育及其与神经精神疾病的关联，为发育和病理研究提供经济高效的实验模型。

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