在2D结构中模拟人类小脑体 外 发育

这种方法可以帮助研究早期人类小脑发育以及它在神经精神疾病中如何改变。该方法的主要优点是在2D层结构中生成发育的早期人小脑细胞，而无需执行复杂的步骤。它也具有成本效益。

制作拉移液器在开始时可能很棘手，但随着时间的推移，以更容易使用的方式拉移移液器会变得更容易。开始实验准备，将一个22.9厘米的巴斯德移液器拉到颈部下方约两厘米处，在本生燃烧器上方，以创建两个玻璃移液器。较薄的一面将比另一面短约四厘米。

将拉动侧的尖端弯曲在火焰上以形成光滑的R，然后将拉动的移液器放入高压灭菌器套筒中，并在高压灭菌器中对其进行消毒。在第零天，向六孔超低附着或ULA板的每个孔中加入一毫升补充有10微摩尔Y-27632和SB-431542的小脑分化培养基，并将其放入培养箱中，直到提升的菌落准备好添加到孔中。使用拉动玻璃移液管清洁分化的细胞。

吸出培养基，每 35 毫米培养皿加入 1 毫米的 iPSC 传代溶液。在37摄氏度下孵育三分钟后，吸出培养基并加入补充有10微摩尔Y-27632和SB-431542的两毫米小脑分化培养基在透射光倒置显微镜的4倍放大倍数下，使用拉动玻璃移液器的弯曲边缘提起菌落。提起每个菌落后，使用 10 毫升血清移液管将所有菌落轻轻转移到六孔 ULA 板的一个孔中。

对每个iPSC板重复此过程，并将细胞在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育。在第二天，向每个孔中加入FGF2，以调整每毫升50纳克的最终浓度。在第七天，通过吸出一毫升用过的培养基并用一毫升新鲜的小脑分化培养基代替来更换三分之一的培养基。

孵育胚状体七天。在第14天，旋转板以将所有胚状体聚集在板的中心。然后倾斜板并使用 1000 微升移液器从边缘吸出所有用过的培养基。

随着培养基量的减少，慢慢将板放平并继续吸出，留下足够的培养基以避免将拟胚体拉出。接下来，加入三毫升补充有10微摩尔Y-27632的新鲜小脑分化培养基。然后使用10毫升血清移液管将胚状体转移到聚-L-鸟氨酸层粘连蛋白包被的培养皿中。

在第15天，吸出培养基并用新鲜的小脑分化培养基代替。在第0天，将iPSC菌落清洁并提升到含有SB-431542和Y-27632的小脑分化培养基中，并放入超低附着板中以产生胚状体。在第2天添加FGF2，在第7天改变1/3培养基，导致胚胎体在第14天显示增大。

细胞在第15天开始沿着涂层表面从拟胚体向外迁移。从第21天开始，培养基完全转变为小脑成熟培养基，到第35天时，细胞具有神经元样形态和复杂性的单层细胞。第35天的基因表达分析显示，这些细胞表达早期小脑祖细胞标志物，如谷氨酸能祖细胞、ATOH1、GABA能祖细胞、PTF1α和浦肯野祖细胞标志物KIRREL2和SKOR2。

此外，还观察到菱形唇标志物OTX2和大部分前神经元特异性SIX3的表达。第35天收获的细胞的免疫荧光标记显示小脑标志物EN2和PTF1 α，神经元标志物β微管蛋白III和增殖标志物KI67染色阳性。用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚或 DAPI 进行核染色显示细胞核。

为了成功分化，从健康和未分化的iPSC菌落开始，并使用尽可能新鲜复溶的试剂至关重要。