一种用于研究肠道微生物组-神经系统轴的肠芯片模型

该方案具有重要意义，因为它首次实现了研究细菌物种对肠神经系统细胞的影响。由于肠神经系统不易获取，该模型为研究肠道微生物组对肠神经系统细胞的影响提供了可能。未来，该模型可用于探究患病患者肠道微生物组对肠神经系统细胞的影响，例如在帕金森病中的作用。

未来的一个可能目标是将该模型与其他器官芯片模型连接，以构建一个代表肠-脑轴的模型。该技术的可视化演示至关重要，因为该方案包含多个步骤，且每个步骤对于成功构建此模型都十分关键。本次操作演示将由系统生态学实验室的博士研究生Catherine Sedrani完成。

首先，拧紧螺丝以固定夹具的顶部和底部部件，然后通过握住盖子四角的螺丝，将已涂覆并干燥的底部聚碳酸酯盖从方形培养皿转移至夹具底座的上方。使用无菌镊子将上皮细胞培养室密封垫圈放置在聚碳酸酯盖上，确保膜面朝上。对齐垫圈与盖子上的螺丝孔，使盖子四角的进液口和出液口与垫圈上的开口对齐。

将三明治垫片顶部朝上放置在胶原垫片上方，然后将顶部聚碳酸酯盖板放在三明治垫片上。确保夹具盖板上的凸起接头与膜组件的入口和出口对齐，且底部盖板的螺纹与顶部盖板的开口匹配。

关闭装置时，将夹具盖放在聚碳酸酯盖上方并扣紧锁扣。为对管路进行预灌注，将带过滤器的通气针插入每个进液瓶和出液瓶隔膜中。使用洁净的无菌镊子，将120毫米长的针头插入250毫升血清瓶，将80毫米长的针头插入15毫升血清瓶。

将每根管路末端的40毫米针头插入流出液血清瓶中。上皮和神经管路的40毫米针头连接至同一个用于废弃培养基的流出瓶，细菌管路则连接至第二个流出瓶。

将泵的管路插入泵盒中。将蠕动泵设置为以每分钟5转的速度将培养基从进液瓶泵送至出液瓶，然后按下启动按钮以启动泵。确保管路的三通旋塞全部处于打开状态。

当培养基开始滴入流出液瓶时，确保管路和连接处无泄漏或气泡。当所有管路均插入流出液瓶后，将流速设置为每分钟2转，以连接初始装置。连接管路时，从流出侧开始，关闭三通旋塞阀。

断开短管与雌性引诱连接器的连接，将短管推到设备出口端口的凸缘上，将其连接至设备出口端口。为确保连接牢固且不漏液，需将管路完全推到底，使其与盖子接触。当一条管路完全连接到设备后，打开旋塞阀。

将泵的流速设为2转/分钟，并逐步将泵速提高至最大2.5转/分钟，以避免因压力积聚导致泄漏。让泵对腔室进行预充。当所有腔室均充满细胞培养基且装置内无气泡残留时，将泵速降至0.5转/分钟。

对于上皮细胞，使用胰蛋白酶-EDTA将Caco-2细胞从培养瓶中消化下来。将其重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，并用台盼蓝排斥法在Neubauer细胞计数板上进行细胞计数。将Caco-2细胞悬液在300×g条件下离心3分钟，弃去上清液以去除残留的胰蛋白酶-EDTA。

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬Caco-2细胞，制备成每毫升含0.35×10⁶个细胞的细胞悬液。取1.5毫升Caco-2细胞悬液转移至无菌的2毫升注射器中，并除去注射器内残留的气泡。关闭细菌室和神经元室管路上的三通旋塞阀，并通过将带有相应管路的盒组件从转子上取下，使管路与泵分离。

打开通向上皮腔室的进液管路上旋塞阀的盖帽，旋转阀门以将培养基流动方向重定向至开放连接端。让培养基持续流动，直至在旋塞阀的开放端出现一滴培养基。使用液滴-液滴连接法，将含有上皮细胞的注射器插入开放连接端，以防止插入过程中引入气泡。

转动旋塞阀，停止来自进液瓶的培养基流动，并使连接的注射器中的液体流入初始装置。将上皮室从泵上断开，缓慢推动注射器，向上皮室中接种 1.5 毫升细胞悬液。关闭出液旋塞阀，并断开注射器。

用盖子封闭旋塞的开口端，并保持腔室关闭至少两个小时。在此期间，接种神经元细胞。从培养箱中取出装置并移除管路后，缓慢打开夹子，然后取下盖子。

小心取下顶部的聚碳酸酯盖。将培养基收集到 1.5 毫升微量离心管中，并置于冰上。轻轻移除夹心垫圈，同时收集上皮腔室中的培养基，注意不要触碰细胞层。

将三明治形垫圈放入方形培养皿中，并向细菌室加入无菌的0.9%氯化钠水溶液，直至完全覆盖细菌室。在收集神经元室中的培养基的同时，缓慢取出胶原垫圈。将培养基转移至微量离心管后，立即将管子置于冰上。

将胶原蛋白垫放入方形培养皿中，并轻轻加入数毫升 PBS 至 Caco-2 细胞层，直至完全覆盖细胞层。将底部聚碳酸酯盖子放入方形培养皿中，并在神经元细胞上轻轻加入约两毫升 PBS，以防止在取样过程中细胞干燥。将培养基管在 4 °C 条件下离心五分钟。

将每支试管的上清液转移至新的微量离心管后，立即置于干冰上。针对两种不同的初始装置设置进行了CFU计数评估：罗伊氏乳杆菌与Caco-2细胞共培养，以及罗伊氏乳杆菌在人类微生物互作装置中的培养。

在两种实验条件下，CFU 计数均显著不同于 HuMix 接种物和收获的细胞，表明细菌细胞在初始装置内发生了生长。为了评估在装置中培养肠神经元是否改变细胞表型，使用倒置相差显微镜观察其整体形态。致密神经元网络的形成表明细胞已良好地贴附于经包被处理的装置聚碳酸酯盖上。

融合神经网络与垫圈界定的螺旋结构之间的边界清晰可见。神经类器官技术的潜力在于能够回答以往难以解决的问题，即由于缺乏代表性模型，人类肠道微生物组与肠神经系统之间的相互作用一直难以探究。