小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

本实验方案的总体目标是提供一种优化的小鼠部分肝切除术后肝细胞分离方法，无需使用密度梯度离心。在肝脏早期再生阶段，我们通常会观察到大量富含脂质的肝细胞。这些脂肪变性的肝细胞由于密度较低，在密度梯度离心中容易丢失，而本方案能够有效保留这些细胞。

准备灌注设备时，使用鲁尔锁接头将26号IUI套管连接至管路的出口端。然后冲洗管路，并将管路的入口端插入水浴中预热的灌注缓冲液管内。以每分钟3毫升的泵速用温热的灌注缓冲液进行预灌注。

在开始手术前，确保小鼠已充分麻醉。随后使用外科擦洗液和70%乙醇清洁腹部。然后剪开缝线，重新打开之前部分肝切除术时所做的正中切口，并轻轻拉开伤口边缘。

如果肝切除术超过24至48小时，则需拆除缝线，并使用剪刀或手术刀切开皮肤。使用牵开器或简单的夹子保持腹腔开放。应尽可能充分暴露腹腔，以优化操作和视野。

将5-0聚丙烯缝线固定于胸骨上，向头侧牵拉并固定于此位置。使用无菌棉签将肠管移至右侧，以暴露门静脉和下腔静脉。

使用湿布覆盖以保留肠道。在小鼠后肢旁边放置一个高度约为两厘米的重物，例如金属砝码环。然后将连接有26号IUI导管的管路放在该重物上，并小心地将针头置于下腔静脉上方。

根据需要调整管路长度。将胶原酶储备液转移至预热的消化缓冲液管中。每只动物准备 10 至 20 毫升消化缓冲液。

将泵速调节至每分钟3毫升后启动泵。当灌注缓冲液到达针头时，弃去最初流出的2至3毫升预温缓冲液。进行下腔静脉插管时，使用无菌棉签轻轻向尾侧牵拉穿刺部位下方的下腔静脉，以提供适当张力，便于将导管插入静脉。

在缓冲液流经针头的同时，将26号IUI导管以浅角度插入肾下方的下腔静脉。确保针头斜面朝上。当针头进入管腔时，观察导管的回血室是否有血液出现。

将针头再向前推进2至3毫米，以确保导管尖端进入静脉。将塑料导管沿针头滑入静脉内，再推进约5毫米。缓慢且极其小心地取出针头。

2至3秒后，观察肝脏中是否出现白色斑点或门静脉是否肿胀，这表明灌注缓冲液正流经肝脏，并从中央静脉进入肝小叶。在肝脏表面出现白色斑点后1至2秒内，待门静脉明显肿胀，用剪刀尽可能远离肝门处剪断门静脉。

根据动物体重、肝脏大小以及初始肝切除范围，将流速提高至每分钟4到7毫升。用镊子或血管夹夹闭门静脉7到10秒，确保无液体通过。

约30秒后进行第二次夹闭，确保肝脏膨胀并松弛。继续灌注动物3至4分钟，并观察门静脉流出的澄清缓冲液。在消化缓冲液到达肝脏前，夹闭门静脉3至4秒。

确保松开夹子后肝脏能够放松，并且灌注液保持澄清。当消化缓冲液到达肝脏后，再次夹闭门静脉。夹闭松开后，肝脏不应出现放松现象。

以每分钟5毫升的流速消化约四分钟。随着消化的进行，观察肝脏开始肿胀的迹象以及肝脏表面出现的小块透明区域。可见肝脏质地变得类似于一块湿润的布，几乎呈现湿软状。

用湿润的无菌棉签轻轻触碰以检测其一致性。继续灌注，直至观察到肝脏表面质地发生明显变化。注意观察肝脏颜色变得非常浅，并呈现气泡状外观，表明格利森囊与实质组织分离。

一旦肝脏获得这些特性，立即停止消化。在空气进入肝脏之前移除针头。用镊子夹住叶间中央的结缔组织，并轻轻向上提起，以此作为固定点。

切断肝脏与其他器官的所有连接，并移除胆囊。轻柔地将肝脏从腹腔中取出。注意操作，因为此时肝脏较为脆弱，容易受损。

将肝脏置于冰上预冷的保存缓冲液中。将肝脏转移至一个10厘米的培养皿中，并加入10毫升冰上预冷的Williams' Medium E。用尖头镊子在肝脏表面多个位置轻轻撕破格利森氏囊。用两对镊子夹住肝脏中央部位。

缓慢地将它们拉开，使胶囊破裂但不损伤肝细胞，然后轻轻振荡胶囊以释放细胞。将5毫升肝组织匀浆液通过100微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。用10毫升新鲜的冰冻培养基冲洗滤网，并将剩余的5毫升组织匀浆液通过细胞滤网进行过滤。

在4°C条件下，以50 × g离心提取物5分钟。吸除大部分上清液，留下1 mL液体，通过轻轻摇动试管重悬细胞。加入40 mL冷的Williams' E培养基，并重复该步骤3次。

按照文稿中所述方法进行肝细胞的分离。小鼠接受70%肝切除术后，最终肝细胞产量约为10至15 × 10⁶，平均最终存活率为78%。而在扩展的86%肝切除术后，肝细胞产量为4至9 × 10⁶，平均存活率为65%。

部分肝切除术后，肝细胞体积较正常肝脏增大，这与脂质含量增加相对应。在小鼠肝细胞中，部分肝切除术后24小时即可观察到脂质含量升高，表现为细胞颗粒度增加，或在体积增大的肝细胞内直接观察到脂滴囊泡的存在。在采用经典的密度梯度纯化方法时，较大的脂肪变性肝细胞会丢失在上清液中，而仅较小的非脂肪肝细胞会沉淀至细胞沉淀物中。

通过改进的方案，富含脂质的肝细胞未发生丢失，所有肝细胞均被成功沉淀。重复夹闭操作有助于灌流过程的进行，从而可充分清除肝脏中残留的血液成分，避免这些成分对消化酶产生抑制作用。