Name: 小鼠肝部分切除术后再生肝细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习小鼠肝部分切除术后再生肝细胞的优化分离方法，无需密度梯度离心即可保留富含脂质的肝细胞。该技术可提高肝细胞回收率，为肝脏再生研究提供可靠的细胞来源。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由瑞士国家科学基金会（项目资助号 310030_189262）资助。

<ol><li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+from+myth+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 1 Suppl 81-88 (2015).</li>
<li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li>
<li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li>
<li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLizardo+Thiebaud%2C+MJ+%22Liver+Pathology%22">Liver Pathology</a>. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2%2B+on+enzymatic+dispersion+of+isolated%2C+perfused+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li>
<li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+down-regulation+promotes+%CE%B2-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+%28HABR%29+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877(2015).</li>
<li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li>
<li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2%2F3+partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li>
<li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li>
<li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li>
<li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li>
<li>Roche, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoche%2C++%22Liberase+TM+Research+Grade%22">Liberase TM Research Grade</a>. , (2020).</li>
<li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes%2C+which+inhibits+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li>
<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li>
<li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li>
<li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+following+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22HPB%22%5BJournal%5D)">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li>
<li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li>
<li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-sweetened+beverage%2C+diet+soda%2C+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenteroly+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li>
<li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma%3A+a+problem+of+growing+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+body+weight+and+metabolic+%28dysfunction%29-associated+fatty+liver+disease+%28MAFLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Visceral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

已发表的方案提供了一种可靠且简便的方法，用于分离获得高产量的正常及脂肪变性小鼠肝细胞，适用于单细胞下游分析或经FACS分选后的细胞群体分析。与密度梯度纯化法相比，其显著优势在于细胞内的脂质含量几乎不影响肝细胞的有效得率。因此，脂肪变性肝细胞的比例得以保留并包含在后续分析中。这一点不仅对于脂肪生成性肝病的研究至关重要，而且在研究大部肝切除术后相关过程时也极为关键，因为在肝再生的最初2-3天内，肝细胞会表现出时空动态的脂肪变性。尽管在肝切除术后已开展过对分离肝细胞的（单细胞）分析19,20,21，但可以推断，所分析的细胞群体至少部分缺失了富含脂质的肝细胞，因此结果未能完全代表真实情况，而偏向于瘦型肝细胞。
目前，TRAS 的功能尚未完全阐明。例如，肝小叶内脂质含量的空间差异仍不清楚。因此，需要一种能够在不将这些细胞精确排除在分析之外的情况下实现定性和定量检测的方法（例如用于单细胞转录组学、流式细胞术和...

即使在发生重大组织损失后，肝脏仍能自我再生。这种独特的再生能力在部分（70%）肝切除的实验模型中得到了明确体现，该模型最早由 Higgins 和 Anderson 于 1931 年在大鼠中首次描述1。在此模型中，通过手术切除较大的肝叶，将动物体内 70% 的肝脏组织移除。剩余的肝叶随后通过代偿性肥大迅速生长，通常在术后约 1 周内恢复原有的肝脏质量，但并不恢复原有的肝脏结构2,3。此外，研究人员还开发了不同切除比例的其他肝切除模型，例如 86% 扩展性肝切除，其中残留肝组织过小而无法恢复，最终导致 30%–50% 的实验动物出现肝切除后肝功能衰竭（PHLF）并相继死亡4,5,6。这些模型可根据切除组织的多少，用于研究正常或失败的肝脏再生过程（图 1）。
尽管肝切除小鼠模型已被成功使用多年，但直到最近更先进的分析方法才使得在单细胞水平上获得更深入的见解成为可能。然而，对于大多数这些方法而言，获得单个肝细胞是基本前提。目前大多数原代肝细胞分离方案均基于两步胶原酶灌注技术，随后通过密度梯度纯化，以将活肝细胞与碎片、非实质细胞以及死亡细胞分离开来7,8,9。该方法最早由Berry和Friend于1969年提出10，并在1972年由Seglen及其同事进行了改进11,12。然而，由于梯度离心依赖于细胞的密度和大小，富含脂质的肝细胞在标准纯化过程中常常丢失。虽然此类损失在许多研究问题中可能微不足道，但对于早期肝再生研究而言却至关重要。在再生的最初两天内，再生小鼠肝脏中的肝细胞会积累脂质，导致细胞体积增大、密度降低。这种与再生相关的短暂性脂肪变性（TRAS）为肝脏再生提供能量来源，具有暂时性，但部分与主要增殖阶段重叠，并且在肝小叶（肝脏的功能单位）内分布不均13,14。然而，在大范围86%肝切除术后，TRAS同样会发生但持续存在，原因是再生受阻，脂质无法被氧化14。因此，在70%或86%肝切除术后采用梯度纯化法分离肝细胞将导致所得细胞群体缺乏代表性，因为大多数富含脂质的肝细胞因其密度较低而在纯化过程中丢失15。
在本改良的分离方案中，于C57BL/6小鼠肝切除术后24-48小时，采用经典的两步胶原酶灌注法分离肝细胞。通常，细胞分离所需的残余肝脏插管和灌注操作在此时间段内进行 通过 门静脉。然而，大范围切除术后残留的小部分肝脏中门静脉血管阻力较高16，因此灌注过程需十分轻柔。由于肝切除术不影响下腔静脉，因此可轻松进行逆向灌注 通过 下腔静脉插管。标准蠕动泵驱动加温后的溶液 通过 通过门静脉流出，采用逆行灌注法将导管插入下腔静脉至肝脏残余部分补充图 S1）。肝细胞通过胶原酶消化从格利森囊分离并释放。经过洗涤及采用低速离心法逐步分离获取活肝细胞后，这些肝细胞可用于任何后续分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td><td>BioLegend</td><td>423111</td><td>胺反应性活率染料</td></tr><tr><td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td><td>Provet AG</td><td>QN01AB06</td><td>注意：需要通风</td></tr><tr><td>EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML</td><td>-</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229</td><td>用水稀释至 70%</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FCS)</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td>-</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)，含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，含酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269-6x600ML</td><td>用于消化/保存</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)，无 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，无 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，无酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6x500ML</td><td>用作灌注缓冲液</td></tr><tr><td>HEPES 溶液，1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-100ML-F</td><td>-</td></tr><tr><td>Histoacryl 组织粘合剂（丁基-2-氰基丙烯酸酯）</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td>用于固定插管部位</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 染色染料溶液</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>-</td></tr><tr><td>Liberase 研究级</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>冻干胶原酶 I/II</td></tr><tr><td>0.9% NaCl 500 mL Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>123</td><td>-</td></tr><tr><td>Paralube Vet 软膏</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>-</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>A1286301</td><td>-</td></tr><tr><td>Sudan IV &amp;ndash; 脂质染色</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001423</td><td>-</td></tr><tr><td>Temgesic（盐酸丁丙诺啡）注射液 0.3 mg/mL</td><td>Indivior Europe Ltd.</td><td>345928</td><td>麻醉药品，需安全存放</td></tr><tr><td>台盼蓝，0.4%，无菌过滤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>Williams&amp;rsquo; Medium E</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4128-500ML</td><td>-</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL 刻度移液管，Greiner Cellstar</td><td>Merck</td><td>P7865</td><td>-</td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>TPP</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>BD Neoflon Pro IV 导管 26 G</td><td>BD Falcon</td><td>391349</td><td>-</td></tr><tr><td>细胞刮刀，旋转刀片宽度 25 mm</td><td>TPP</td><td>99004</td><td>-</td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛，100 &amp;micro;m 尼龙</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>-</td></tr><tr><td>带孔无菌手术巾</td><td>-</td><td>-</td><td>可重复使用的布料</td></tr><tr><td>16# 管用填充喷嘴（内径 3.1 mm）</td><td>Drifton</td><td>FILLINGNOZZLE#16</td><td>插入管中使用</td></tr><tr><td>流式细胞仪管，5 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352008</td><td>-</td></tr><tr><td>雄性鲁尔接头转接头，管内径 3.2 mm</td><td>Drifton</td><td>LM41</td><td>连接注射器的管路</td></tr><tr><td>培养皿，96 x 21 mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>-</td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>8614H</td><td>用于胸骨牵开</td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td>用于皮肤缝合</td></tr><tr><td>Prolene 8-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7470E</td><td>结扎胆囊</td></tr><tr><td>16# 管，壁厚 1.6 mm，内径 3.2 mm，外径 6.4 mm</td><td>Drifton</td><td>SC0374T</td><td>灌注管</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa 细胞分析流式细胞仪</td><td>BD</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Isis 啮齿类动物剃毛器</td><td>Aesculap</td><td>GT421</td><td>-</td></tr><tr><td>异氟烷工作站</td><td>Provet</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>低速离心机 &amp;ndash; Scanspeed 416</td><td>Labogene</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>改进型 Neubauer 计数板</td><td>Marienfeld</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>氧气浓缩器 &amp;ndash; EverFlo</td><td>Philips&amp;nbsp;</td><td>1020007</td><td>0 &amp;ndash; 5 L/min</td></tr><tr><td>Pipetboy &amp;ndash; Pipettor Turbo-Fix</td><td>TPP</td><td>94700</td><td>-</td></tr><tr><td>Shenchen 灌注泵 &amp;ndash; YZ1515x</td><td>Shenchen</td><td>YZ1515x</td><td>-</td></tr><tr><td>手术显微镜 &amp;ndash; SZX9</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ThermoLux 加热垫</td><td>Thermo Lux</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2，2700 转/分钟</td><td>NeoLab</td><td>7-0092</td><td>-</td></tr><tr><td>水浴锅 &amp;ndash; Precision GP 02</td><td>Thermo scientific</td><td>-</td><td>调节至 42 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

部分肝切除术已广泛用于研究小鼠肝脏再生，但为后续单细胞应用分离出高产量且存活率高的肝细胞仍具挑战性。在小鼠正常肝脏再生的前两天内，可观察到再生肝细胞中脂质显著积聚。这种被称为再生相关性短暂性脂肪变性（TRAS）的现象虽为暂时性，但与主要增殖阶段存在部分重叠。密度梯度纯化是目前大多数原代肝细胞分离方案的核心步骤。由于梯度纯化依赖于细胞的密度和大小，因此会将非脂肪变性肝细胞与脂肪变性肝细胞分离开。因此，脂肪变性的肝细胞常被丢失，导致所获得的肝细胞群体缺乏代表性。
本文所述方案介绍了一种简便且可靠的 体内 无论脂质含量如何分离再生肝细胞。在雄性C57BL/6小鼠肝切除术后24-48小时，采用经典的两步胶原酶灌注法分离肝细胞。标准蠕动泵驱动预热的灌注液 通过 将导管插入下腔静脉，利用逆行灌注技术经门静脉流出，灌注残余肝脏。通过胶原酶消化使肝细胞从格利森囊分离。经洗涤和仔细离心后，肝细胞可用于后续各项分析。总之，本文介绍了一种简单且可重复的小鼠部分肝切除术后分离再生肝细胞群体的技术。该方法也有助于脂肪肝疾病的研究。

在肝切除术后16小时，肝再生相关性苍白（TRAS）达到高峰，并在标准肝切除术后32-48小时内逐渐消失，但在扩大肝切除术后可持续超过48小时。肉眼可见，TRAS表现为肝脏残留部分的苍白外观（图1F），可在肝切除术后16至48小时的小鼠中观察到。
70%肝切除术后小鼠的估计最终肝细胞产量为10-15 × 106，扩展性86%肝切除术后为4-9 × 106，最终平均活力分别为78%和65%。该产量与整只小鼠肝脏的总产量50-70 × 106相比，符合预期百分比（图6A、C）。部分肝切除术后，肝细胞体积较正常肝脏增大，与其脂质含量增加相对应（图6B）。门控策略见补充图S4。
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-togethe...

富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。

部分肝切除术已广泛用于研究小鼠肝脏再生，但为了后续实验获得高产量的活肝细胞，其分离过程仍具挑战性。

本实验方案的总体目标是提供一种优化的小鼠部分肝切除术后肝细胞分离方法，无需使用密度梯度离心。在肝脏早期再生阶段，我们通常会观察到大量富含脂质的肝细胞。这些脂肪变性的肝细胞由于密度较低，在密度梯度离心中容易丢失，而本方案能够有效保留这些细胞。准备灌注设备时，使用鲁尔锁接头将26号IUI套管连接至管路的出口端。然后冲洗管路，并将管路的入口端插入水浴中预热的灌注缓冲液管内。以每分钟3毫升的泵速用温热的灌注缓冲液进行预灌注。在开始手术前，确保小鼠已充分麻醉。随后使用外科擦洗液和70%乙醇清洁腹部。然后剪开缝线，重新打开之前部分肝切除术时所做的正中切口，并轻轻拉开伤口边缘。如果肝切除术超过24至48小时，则需拆除缝线，并使用剪刀或手术刀切开皮肤。使用牵开器或简单的夹子保持腹腔开放。应尽可能充分暴露腹腔，以优化操作和视野。将5-0聚丙烯缝线固定于胸骨上，向头侧牵拉并固定于此位置。使用无菌棉签将肠管移至右侧，以暴露门静脉和下腔静脉。使用湿布覆盖以保留肠道。在小鼠后肢旁边放置一个高度约为两厘米的重物，例如金属砝码环。然后将连接有26号IUI导管的管路放在该重物上，并小心地将针头置于下腔静脉上方。根据需要调整管路长度。将胶原酶储备液转移至预热的消化缓冲液管中。每只动物准备 10 至 20 毫升消化缓冲液。将泵速调节至每分钟3毫升后启动泵。当灌注缓冲液到达针头时，弃去最初流出的2至3毫升预温缓冲液。进行下腔静脉插管时，使用无菌棉签轻轻向尾侧牵拉穿刺部位下方的下腔静脉，以提供适当张力，便于将导管插入静脉。在缓冲液流经针头的同时，将26号IUI导管以浅角度插入肾下方的下腔静脉。确保针头斜面朝上。当针头进入管腔时，观察导管的回血室是否有血液出现。将针头再向前推进2至3毫米，以确保导管尖端进入静脉。将塑料导管沿针头滑入静脉内，再推进约5毫米。缓慢且极其小心地取出针头。2至3秒后，观察肝脏中是否出现白色斑点或门静脉是否肿胀，这表明灌注缓冲液正流经肝脏，并从中央静脉进入肝小叶。在肝脏表面出现白色斑点后1至2秒内，待门静脉明显肿胀，用剪刀尽可能远离肝门处剪断门静脉。根据动物体重、肝脏大小以及初始肝切除范围，将流速提高至每分钟4到7毫升。用镊子或血管夹夹闭门静脉7到10秒，确保无液体通过。约30秒后进行第二次夹闭，确保肝脏膨胀并松弛。继续灌注动物3至4分钟，并观察门静脉流出的澄清缓冲液。在消化缓冲液到达肝脏前，夹闭门静脉3至4秒。确保松开夹子后肝脏能够放松，并且灌注液保持澄清。当消化缓冲液到达肝脏后，再次夹闭门静脉。夹闭松开后，肝脏不应出现放松现象。以每分钟5毫升的流速消化约四分钟。随着消化的进行，观察肝脏开始肿胀的迹象以及肝脏表面出现的小块透明区域。可见肝脏质地变得类似于一块湿润的布，几乎呈现湿软状。用湿润的无菌棉签轻轻触碰以检测其一致性。继续灌注，直至观察到肝脏表面质地发生明显变化。注意观察肝脏颜色变得非常浅，并呈现气泡状外观，表明格利森囊与实质组织分离。一旦肝脏获得这些特性，立即停止消化。在空气进入肝脏之前移除针头。用镊子夹住叶间中央的结缔组织，并轻轻向上提起，以此作为固定点。切断肝脏与其他器官的所有连接，并移除胆囊。轻柔地将肝脏从腹腔中取出。注意操作，因为此时肝脏较为脆弱，容易受损。将肝脏置于冰上预冷的保存缓冲液中。将肝脏转移至一个10厘米的培养皿中，并加入10毫升冰上预冷的Williams' Medium E。用尖头镊子在肝脏表面多个位置轻轻撕破格利森氏囊。用两对镊子夹住肝脏中央部位。缓慢地将它们拉开，使胶囊破裂但不损伤肝细胞，然后轻轻振荡胶囊以释放细胞。将5毫升肝组织匀浆液通过100微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。用10毫升新鲜的冰冻培养基冲洗滤网，并将剩余的5毫升组织匀浆液通过细胞滤网进行过滤。在4°C条件下，以50 × g离心提取物5分钟。吸除大部分上清液，留下1 mL液体，通过轻轻摇动试管重悬细胞。加入40 mL冷的Williams' E培养基，并重复该步骤3次。按照文稿中所述方法进行肝细胞的分离。小鼠接受70%肝切除术后，最终肝细胞产量约为10至15 × 10⁶，平均最终存活率为78%。而在扩展的86%肝切除术后，肝细胞产量为4至9 × 10⁶，平均存活率为65%。部分肝切除术后，肝细胞体积较正常肝脏增大，这与脂质含量增加相对应。在小鼠肝细胞中，部分肝切除术后24小时即可观察到脂质含量升高，表现为细胞颗粒度增加，或在体积增大的肝细胞内直接观察到脂滴囊泡的存在。在采用经典的密度梯度纯化方法时，较大的脂肪变性肝细胞会丢失在上清液中，而仅较小的非脂肪肝细胞会沉淀至细胞沉淀物中。通过改进的方案，富含脂质的肝细胞未发生丢失，所有肝细胞均被成功沉淀。重复夹闭操作有助于灌流过程的进行，从而可充分清除肝脏中残留的血液成分，避免这些成分对消化酶产生抑制作用。

isolation-regenerating-hepatocytes-after-partial-hepatectomy

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

小鼠肝部分切除术后再生肝细胞的分离

本文描述了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于分离人肝细胞。该方法也可应用于其他哺乳动物肝脏。所获得的肝细胞产量高、活性好，是肝脏再生、药代动力学和毒理学等科学研究领域的理想模型。...

通过两步胶原酶灌注法分离人肝细胞

用于观察血管再生的工具需要对血管树进行对比成像的方法。本视频展示了一种精细的注射技术，可用于实现血管树的最佳对比效果，并阐述了利用µCT及连续组织学切片对所得样本进行详细分析所带来的潜在优势。...

正常小鼠70%部分肝切除术后血管与实质再生的可视化

肝转移瘤切除术后肿瘤复发率较高，这一问题仍未解决。本研究所展示的小鼠模型可能有助于探讨此类复发的原因。该模型首次将肝切除模型与肝内肿瘤细胞注射相结合。...

肝切除术对肝内肿瘤生长的影响

本文介绍了一种新型的人源化小鼠肝脏模型，该模型通过将未成熟且具有扩增能力的人类肝干细胞移植到白蛋白-毒素受体介导的细胞敲除（TRECK）/SCID小鼠体内而建立。...

利用人肝干细胞构建人源化小鼠肝脏

本文展示了一种从成年小鼠分离原代肝细胞的酶法，并描述了使用ELISA和实时PCR定量炎症反应的方法。...

小鼠原代肝细胞培养物中炎症反应的诱导

我们描述了一种在NOD.SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/J）小鼠中进行部分肝切除术（PHx）并通过脾脏移植细胞的实验方案。该方案中，首先进行切口以暴露并切除肝脏左叶，随后另作切口，用于将细胞移植至脾脏内。...

NOD.SCID 小鼠部分肝切除术后肝细胞脾内移植

本文介绍了一种对新生（出生第0天）小鼠进行左肝叶部分切除的新方法。该新方案适用于研究新生期急性肝损伤及损伤应答反应。...

部分肝叶切除术：一种用于研究肝脏形态学再生的手术模型

本方案详细介绍了使用特殊静脉导管、标准化的一次性无菌管路、结合实时监测的温度控制以及报警系统，进行两步胶原酶灌注，以提高分离的原代大鼠肝细胞的活力、得率和功能的一致性。...

通过多参数灌注控制分离大鼠原代肝细胞

联合肝脏分割和门静脉结扎分阶段肝切除术（ALPPS）已被证实可在第一阶段手术后数周内显著促进肝脏再生。已建立接受ALPPS的动物模型，以探索肝脏再生潜力并获得理想的临床效果。...

一种在显微镜辅助下建立用于分阶段肝切除术的肝脏联合分割和门静脉结扎小鼠模型

小鼠部分肝切除（2/3，即66%）模型在文献中已有充分描述，但用于模拟肝移植后小体积综合征的更大范围肝切除模型则较少被采用。本文介绍一种在小鼠中实施的扩展性78%肝切除手术方法，该操作在健康小鼠中可导致约50%的术后死亡率。...

小鼠手术模型中的扩大78%肝切除术

学习小鼠肝部分切除术后再生肝细胞的优化分离方法，无需密度梯度离心即可保留富含脂质的肝细胞。该技术可提高肝细胞回收率，为肝脏再生研究提供可靠的细胞来源。

小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

探索更多视频