小鼠肝部分切除术后再生肝细胞的分离
December 2nd, 2022
富含脂质的肝细胞是肝脏再生所固有的，但通常在密度梯度离心时丢失。在这里，我们提出了一种优化的细胞分离方案，该方案保留了脂肪变性肝细胞，在小鼠部分肝切除术后产生具有代表性的再生肝细胞群。
该协议的总体目标是提出一种优化的方法，用于在部分肝切除术后小鼠中分离肝细胞，而无需密度梯度离心。我们通常在早期再生期间看到很大比例的脂质肝细胞。由于密度低，通常在密度梯度离心时丢失的那些脂肪性肝细胞通过该方案保留。
要准备灌注设备，请使用鲁尔锁连接器将 26 号IUI插管连接到管道的出口端。然后冲洗管路并将管子的入口端插入水浴中预热的灌注缓冲管中。用温热的灌注缓冲液以每分钟三毫升的泵速灌注。
在进行手术之前，请确保小鼠已充分麻醉。然后用手术磨砂液和70%乙醇清洁腹部。然后切断缝合线以重新打开先前为部分肝切除术制作的中线切口，并轻轻地将伤口边缘拉开。
如果肝切除术超过 24 至 48 小时，请拆下缝合线并用剪刀或手术刀割破皮肤。使用牵开器或简单的夹子保持腹部开放。腹腔应尽可能暴露，以优化通道和可视化。
将5-0聚丙烯缝合线固定在胸骨上。用头拉它并将其固定在这个位置。使用无菌棉签将肠道向右移动，以显示门静脉和腔静脉。
用湿布保留肠道。在鼠标后腿附近放置一个大约两厘米高的重物，例如金属配重环。然后将带有连接的 26 号IUI插管的管子放在物体上，并将针头小心地放在腔静脉顶部。
根据需要调整管子的长度。将胶原酶储备溶液转移到预热的消化缓冲管中。每只动物准备10至20毫升的消化缓冲液。
将泵速调整为每分钟三毫升后打开泵。缓冲液到达针头后，丢弃前两到三毫升预热的灌注缓冲液。要对下腔静脉进行插管，请使用无菌棉签轻轻地将腔静脉向穿刺下方的尾部拉动，以便提供的张力有助于将套管插入静脉。
将 26 号IUI插管以浅角度插入肾脏下方的下腔静脉，同时缓冲液穿过针头。确保针斜面朝上。当针头进入管腔时，在导管的闪光腔中寻找血液。
将针头再推进两到三毫米，以确保导管尖端进入静脉。将塑料导管滑过针头并再滑入腔静脉五毫米。缓慢而小心地取出针头。
两到三秒后，寻找肝脏中形成的白点或门静脉肿胀，这表明灌注缓冲液流经肝脏并从中央静脉进入肝小叶。等待门静脉在肝脏表面形成白点的一到两秒内明显肿胀。用剪刀尽可能远离肝门切断门静脉。
将流速增加到每分钟四到七毫升，具体取决于动物的体重、肝脏大小和初始肝切除术的程度。用镊子或血管夹夹住门静脉 7 到 10 秒钟。确保没有液体通过。
大约 30 秒后进行第二次钳夹，并确保肝脏肿胀和放松。继续冲洗动物三到四分钟，观察从门静脉流出的透明缓冲液。在消化缓冲液到达肝脏之前夹住门静脉三到四秒钟。
确保在释放钳夹时肝脏放松，并且灌注液保持清澈。一旦消化缓冲液到达肝脏，再次夹住门静脉。释放钳夹后，肝脏不应放松。
以每分钟五毫升的流速消解约四分钟。随着消化的进展，寻找肝脏开始肿胀的迹象和肝脏表面的小透明切片。观察肝脏呈现出湿布的质地，看起来几乎湿透。
用湿的无菌棉签小心地触摸稠度，以探测稠度。继续灌注，直到可以观察到肝脏表面纹理的显着差异。观察到肝脏呈现非常浅的颜色和气泡外观，表明Glisson的囊与实质分离。
一旦肝脏获得这些特性，就停止消化。在空气进入肝脏之前取下针头。用镊子抓住叶之间的中央结缔组织，并将其作为锚点轻轻向上提起。
切断肝脏与其他器官的所有连接并切除胆囊。轻轻地从腹腔中取出肝脏。要小心，因为在这个阶段它会很脆弱。
将肝脏放入冰冷的保存缓冲液中。将肝脏转移到10厘米的培养皿中，并在肝脏表面的几个位置加入10毫升冰冷的威廉姆斯中等E.破裂Glisson胶囊。用两把镊子抓住中央部分。
慢慢将它们拉开，让胶囊撕裂而不损坏肝细胞，并通过轻轻摇动胶囊来释放细胞。通过 100 微米细胞过滤器将 5 毫升肝髓过滤到 50 毫升管中。用10毫升新鲜冰冷培养基冲洗过滤器，并通过细胞过滤器过滤剩余的5毫升纸浆。
在 4 摄氏度下以 50 G 离心提取物五分钟。吸出大部分上清液，留下一毫升通过轻轻旋转管来重悬细胞。加入40毫升冷威廉姆斯E培养基，重复该步骤三次。
按照文本手稿中的说明继续分离肝细胞。在小鼠肝切除术70%后，最终肝细胞产量约为10至15×10至第6，平均最终活力为78%。在延长86%肝切除术后，肝细胞产量为4至9×10至第6，平均存活率为65%。
部分肝切除术后，与正常肝脏相比，肝细胞显示出与脂质含量增加相对应的增加的细胞大小。在肝部分切除术后24小时观察到小鼠肝细胞中脂质含量增加，这被视为粒度增加或通过增大的肝细胞内存在脂质囊泡直接观察到。在使用经典的密度梯度纯化方法时，上清液中丢失了大的脂肪肝细胞，细胞沉淀中仅收集了较小的瘦肝细胞。
通过改进的方案，脂质填充的肝细胞不会丢失，并且所有肝细胞都被沉淀。重复夹紧有助于冲洗过程。这样，肝脏就可以最好地清除可能抑制消化酶的剩余血液成分。
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概述
本文介绍了一种优化的小鼠部分肝切除后肝细胞分离的方案。该方法有效地保留了富含脂质的肝细胞，这些细胞通常在密度梯度离心过程中会丢失，从而允许对再生肝细胞群体进行研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 肝脏再生
- 肝细胞分离
背景
- 富含脂质的肝细胞对肝脏再生至关重要。
- 密度梯度离心通常会导致这些细胞的丢失。
- 优化分离方法可以增强肝脏再生的研究。
- 本研究着重于改进手术后肝细胞的恢复。
研究目的
- 开发一种保留脂肪变性肝细胞的方案。
- 提供一种可靠的方法来研究再生肝细胞。
- 消除肝细胞分离中使用密度梯度离心的需求。
使用的方法
- 使用26号IUI导管准备灌流设备。
- 用温暖的灌流缓冲液冲洗和引流管道。
- 保持每分钟三毫升的泵速。
- 在小鼠部分肝切除后分离肝细胞。
主要结果
- 该方案成功保留了富含脂质的肝细胞。
- 分离的肝细胞代表了一个更准确的研究群体。
- 观察到再生肝细胞的恢复增强。
- 该方法对未来的肝脏再生研究具有前景。
结论
- 优化的分离方案对肝细胞恢复有效。
- 保留脂肪变性肝细胞对于研究肝脏再生至关重要。
- 这种方法可以促进肝脏生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of regenerating hepatocytes post-partial hepatectomy is critical for accurate modeling of liver regeneration and metabolic adaptation in preclinical research. Traditional density-gradient methods bias cell recovery, excluding lipid-laden populations essential for representative downstream analyses. This protocol enables comprehensive sampling of hepatocyte subtypes, supporting predictive confidence in early discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of regenerative pathways by capturing all hepatocyte phenotypes, including steatotic cells.
- Supports functional target validation by providing a representative cellular context post-injury.
- Improves predictive confidence for pathway modulation and mechanistic de-risking in liver biology.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of primary hepatocyte systems suitable for high-content and single-cell analyses.
- Enhances assay reproducibility by eliminating cell-type selection bias inherent to density-gradient purification.
- Enables reliable evaluation of compound effects on diverse hepatocyte populations during regeneration.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling transient steatosis and regenerative dynamics.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by maintaining physiological cell diversity.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by reducing artifacts from selective cell loss.
Pipeline & Workflow Integration
This isolation protocol fits at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling robust hypothesis testing and downstream functional assays.
- Discovery Biology: Captures the full spectrum of regenerating hepatocytes for pathway and target studies.
- Screening: Delivers unbiased, reproducible cell preparations for assay development and compound profiling.
- Analytics: Supports quantitative single-cell and population-level measurements of regenerative phenotypes.
- Translational Research: Aligns with disease-relevant models of liver injury and regeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, broadly applicable protocol for hepatocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in liver regeneration studies.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and scalability of hepatocyte isolation workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing representative cellular material for early-stage evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery and perfusion techniques.
- Needs access to peristaltic pumps, temperature control, and sterile surgical infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible cell isolation and downstream analyses.
- Adaptable to various mouse models of liver injury and regeneration.
- Potential limitations include technical variability in perfusion and digestion steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Perfusion Equipment and Animal Surgery
2:51
Cannulation and Perfusion
5:03
Digestion
6:21
Preparation of the Liver
6:51
Hepatocyte Extraction and Isolation
8:11
Results: A Reliable and Straightforward Method for Isolating High Yield Normal and Steatotic Murine Hepatocytes
9:37
Conclusion
