Name: 小鼠结肠隐窝三维培养离体研究肠道干细胞功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学习小鼠结肠隐窝三维培养技术，用于研究肠道干细胞功能及claudin-7基因敲除的影响。该方法为炎症性肠病和结直肠癌治疗提供新靶点。

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本研究由 NIH DK103166 资助。

所有动物实验和操作均经东卡罗来纳大学（ECU）动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院和东卡罗来纳大学关于实验动物护理与使用的指南进行。通过将 C57BL6 claudin-7-flox 转基因小鼠与 Villin-CreERT2 小鼠杂交，构建了可诱导的肠道特异性 claudin-7 基因敲除小鼠模型19。本研究使用了3月龄的雄性和雌性小鼠。
1. 试剂/仪器准备
<ol>
	<li>在开始相关实验前，将以下试剂/设备预冷：用于在隐窝分离过程中洗涤结肠组织的磷酸盐缓冲液（PBS）；用于上皮解离液孵育的摇床/旋转仪（置于4 °C冰箱中）。
	<ol>
		<li>去除凝胶基质（参见 材料表从 -20 °C 取出并在冰上解冻，然后接种。</li>
		<li>在接种隐窝之前，将离心机预冷至 4 °C。</li>
		<li>冷却0.1%柠檬酸钠缓冲液（参见 材料表）并置于冰上保存，直至后续使用 原位 细胞死亡检测</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开始相关实验前，将以下试剂预热：接种前将96孔培养板预热24小时；L-WRN培养基（参见 材料表）在添加到培养板中的隐窝之前以及每次更换培养基之前。
	<ol>
		<li>将水浴加热至 94 °C，然后进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠结肠隐窝分离
<ol>
	<li>按照以下步骤准备所需的培养基。 
	注意：此处培养基的体积是针对两只小鼠的结肠组织计算的。
	<ol>
		<li>准备上皮细胞解离培养基：30 mL 1x PBS + 400 µL 0.5 M EDTA + 50 µL 10 mM Y-27632 二盐酸盐（参见 材料表）。使用前置于冰上保存。</li>
		<li>准备隐窝解离培养基：10 mL 1x PBS + 10 µL 10 mM Y-27632 二盐酸盐。使用前置于冰上保存。</li>
		<li>补充 L-WRN 培养基：50 mL L-WRN 培养基 + 47.5 mL 含 L-谷氨酰胺的高糖 DMEM + 500 µL L-谷氨酰胺 + 500 µL 青霉素/链霉素 + 1,000 µL B-27 补充剂（50x）+ 500 µL N2 补充剂（100x）+ 50 µL HEPES（1 M）缓冲液（参见 材料表）。</li>
		<li>将完全（补充后）的 L-WRN 培养基过滤，并分装后于 -20 °C 保存，最长可保存 3 个月。 
		注意：解冻后的培养基在 4 °C 下可稳定保存最多 2 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行隐窝分离。
	<ol>
		<li>为进行全身麻醉，将 1 mL 异氟烷加入棉球中，并将其放入容积为 0.09 立方英尺的麻醉室内的塑料盒中（参见 材料表）。将小鼠放入麻醉室中，直至呼吸停止（约 3–5 分钟），然后实施颈椎脱位20。</li>
		<li>沿小鼠腹部中线做约 2 英寸的切口，将背部皮肤固定，暴露腹腔。从近端在盲肠下方、远端在直肠上方剪断，分离出结肠21。</li>
		<li>使用镊子去除附着在结肠上的脂肪组织。用镊子的平端轻轻推出粪便，并将组织纵向剪开。</li>
		<li>使用镊子用冷的 1x PBS 清洗组织 10–15 次，每次清洗之间用镊子在 PBS 中轻轻搅动组织&#34;旋转&#34;。</li>
		<li>使用干净锋利的剪刀将组织剪成约 3–5 mm 大小的小块。</li>
		<li>对第二只小鼠重复上述过程，并将组织块合并至含有冷上皮细胞解离培养基（步骤 2.1.1）的 50 mL 离心管中。</li>
		<li>将结肠组织块在上皮细胞解离培养基中于 4 °C 下轻轻振荡孵育 90 分钟。</li>
		<li>让组织碎片沉降至管底，然后小心弃去上清液，避免扰动组织沉淀。用冷的 1x PBS 清洗组织 10–15 次时重复此操作。最后一次清洗时尽可能弃尽 PBS。</li>
		<li>向含有结肠组织块的 50 mL 管中加入隐窝解离培养基（步骤 2.1.2），手动持续震荡 5–10 分钟。 
		注意：解离后的隐窝会使培养基变浑浊。</li>
		<li>在细胞培养超净台中，使用 70 µm 尼龙细胞滤网（参见 材料表）将组织和培养基过滤至新的 50 mL 管中。</li>
		<li>在室温下以 200 x g 离心 10 分钟，弃去上清液，避免扰动含有隐窝的沉淀。 
		注意：根据设备情况，可将滤过的液体转移至 15 mL 管中进行离心。</li>
		<li>用约 3–4 mL 冷的 1x PBS 重悬沉淀。</li>
		<li>用移液器吸取 10 µL 分离得到的隐窝，在显微镜载玻片上划线。在显微镜下计数完整、较长的隐窝数量，以估算每 10 µL 中的隐窝浓度。</li>
		<li>计算为在 96 孔板中接种 10 个隐窝/µL 所需离心的隐窝体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 隐窝铺板
<ol>
	<li>在4 °C条件下，将适量分离的隐窝置于1.5 mL微量离心管中，以200 × g离心5分钟。</li>
	<li>使用1,000 µL移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀的隐窝。</li>
	<li>向沉淀的隐窝中加入100 µL凝胶基质（足够用于九个孔），轻轻吹打混匀，避免引入气泡。 
	注：有关凝胶基质与隐窝混合的详细说明，请参见讨论部分。通常情况下，100 µL足以用于九个孔。</li>
	<li>让凝胶基质部分凝固（约1–2分钟）。</li>
	<li>将含有隐窝的凝胶基质每孔10 µL接种至预热的96孔培养板中，形成圆顶状。 
	注：将圆顶置于孔中央，注意避免凝胶基质扩散至孔壁。有关凝固与接种的详细说明，请参见讨论部分。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育10–20分钟，使凝胶基质完全凝固。</li>
	<li>制备L-WRN培养基的最终工作液。
	<ol>
		<li>向10 mL L-WRN培养基（见步骤2.1.3）中加入100 µL青霉素/链霉素溶液（4 °C下可稳定保存2周）。</li>
		<li>向900 µL含青霉素/链霉素的L-WRN培养基中添加以下补充物：0.9 µL 1 mg/mL EGF + 0.9 µL 10 mM Y-27632二盐酸盐。 
		注：上述体积适用于九个孔。Y-27632二盐酸盐仅在第0天（接种时）添加。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每孔加入100 µL培养基，注意避免破坏圆顶结构。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
</ol>
4. 在培养物中构建紧密连接蛋白-7 基因敲除
<ol>
	<li>接种后，让隐窝在培养条件下正常生长24小时。</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，加入2.7 µL的1 mmol/L 4-羟基他莫昔芬（4OH-Tamoxifen）至900 µL L-WRN培养基中（终浓度为3 µmol/L），并加入0.9 µL的1 mg/mL EGF。 
	注意：4OH-他莫昔芬储备液的配制是通过将粉末状4OH-他莫昔芬（见 材料表用1×PBS将浓度调节至1 mmol/L。</li>
	<li>从孔中移除旧培养基 通过 真空抽吸</li>
	<li>向每个孔中加入 100 µL 含 4OH-Tamoxifen 的培养基，并标记为 claudin-7 cKO/4OH-TAM。 
	注意：对照孔中需加入DMSO。含有新鲜4OH-他莫昔芬的培养基必须每2天更换一次。</li>
	<li>37 °C 培养，直至下次换液（约 2-3 天）。</li>
</ol>
5. 结肠类器官的维持
注意：培养基必须每 2-3 天更换一次。培养时间最长可达 12 天。
<ol>
	<li>制备新鲜的L-WRN完全工作液：900 µL L-WRN培养基 + 0.9 µL 1 mg/mL EGF。</li>
	<li>从孔中移除旧培养基 通过 真空抽吸。向孔中加入新鲜培养基。 
	注意：切勿破坏穹顶结构。</li>
	<li>37 °C 培养，直至下次换液。 
	&#8203;注意：培养物可根据实验需求维持并传代相应时长。本研究中的培养物通常维持 9 至 12 天，但也可根据需要延长至 15 或 20 天。</li>
</ol>
6. 结肠类器官的收获与包埋
<ol>
	<li>从孔中移除旧培养基 通过 真空抽吸</li>
	<li>在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定类器官1小时。 
	注意：PFA 为有毒物质，使用该试剂时应采取适当防护措施。</li>
	<li>从孔中移除4% PFA 通过 真空抽吸后，在4 °C下加入30%蔗糖溶液，作用24小时。</li>
	<li>标记一个塑料模具，并用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充至其容量的90%（参见 材料表).</li>
	<li>从孔中移除30%蔗糖溶液 通过 真空抽吸。向每个孔中加入10 µL的1x PBS。</li>
	<li>用移液器吸头轻轻刮擦孔板底部，使含有类器官的细胞团脱落。</li>
	<li>用移液器吸除含有解离类器官的 PBS，并将液体转移至含有 OCT 的模具中。 
	注意：避免在OCT包埋剂中产生气泡。</li>
	<li>继续此操作，直至所有类器官从所有孔中完全移除。</li>
	<li>在不锈钢杜瓦瓶中，加入干冰颗粒和2-甲基丁烷（用量以覆盖干冰颗粒为宜）（参见 材料表).</li>
	<li>用镊子夹住含有类器官的OCT包埋块，置于2-甲基丁烷上方，进行速冻。</li>
	<li>将含有类器官的OCT包埋块置于-80 °C保存，直至准备切片（可保存长达1年）。</li>
</ol>
7. 免疫荧光
<ol>
	<li>使用冷冻切片机（见材料表）在 -20 °C 下将含有类器官的 OCT 包埋块切成 5 µm 厚的切片。</li>
	<li>对每张切片，在显微镜下检查以确认捕获到类器官。切片完成后，将载玻片储存于 -80 °C，直至准备染色（可储存长达 6 个月）。</li>
	<li>将载玻片置于 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中，在 94 °C 下加热 10 分钟。 
	注意：该缓冲液通过将柠檬酸钠溶解于去离子水中配制而成，用盐酸调节 pH 至 6。</li>
	<li>让载玻片在室温下冷却 20 分钟，然后用蒸馏水冲洗 5 分钟。</li>
	<li>将载玻片放入染色架中（见材料表），加入 0.2% Triton X-100，并与 100 mM 甘氨酸在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 1× PBS 每次冲洗 5 分钟，重复三次。用 5% 牛血清白蛋白（BSA）在室温下封闭 45 分钟。</li>
	<li>加入 claudin-7 抗小鼠兔源一抗22（用 1% BSA 稀释），在 4 °C 下孵育过夜。用 1× PBS 每次冲洗 10 分钟，重复三次。</li>
	<li>加入 Cy3 标记的抗兔二抗23（用 1% BSA 稀释），在室温下孵育 1 小时。用 1× PBS 每次冲洗 10 分钟，重复三次。</li>
	<li>使用含 DAPI 的合适封片介质（见材料表）封片，并加盖盖玻片。</li>
</ol>
8. 细胞死亡检测
<ol>
	<li>在室温下用 4% 多聚甲醛将类器官固定在孔板中 1 小时。用 1x PBS 洗涤 5 分钟。</li>
	<li>将培养板置于冰上，用含0.1% Triton X-100的冰冷0.1%柠檬酸钠缓冲液孵育2分钟。用1×PBS洗涤两次，每次5分钟。</li>
	<li>准备TUNEL反应24,25 使用TMR Red，一种 原位细胞死亡检测试剂盒（参见 材料表加入50 µL TUNEL反应试剂至每个孔中。</li>
	<li>在37 °C、避光、湿润环境中孵育1小时。 
	注意：所有后续步骤均须在避光条件下完成。</li>
	<li>用1×PBS冲洗三次，每次5分钟。用1:2,500的Hoechst（溶于1×PBS中，见下文）孵育 材料表3 分钟</li>
	<li>用1×PBS冲洗三次，每次5分钟。使用TRITC滤光片在荧光显微镜下观察图像（参见 材料表).</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

类器官培养是研究干细胞功能、肠道生理学、药物筛选、人类肠道疾病以及组织再生与修复的优秀模型7,8,9,10,11,26。尽管该技术具有诸多优势，但其建立过程可能具有挑战性。在整个实验流程的各个步骤中均需格外小心，尤其是在铺板阶段。将分离得到的隐窝与凝胶基质混合时，务必充分上下吹打，以彻底打散离心后形成的隐窝沉淀，并使隐窝在基质中均匀分布。同时，在吹打过程中应避免将气泡引入基质中。为此，吹打操作应缓慢进行，并将移液器枪头朝向1.5 mL离心管底部。
此外，在整个过程中凝胶基质不能完全凝固。为防止过早凝固，需通过小心移液进行混匀，然后将离心管置于冰上，并重复此过程。当分离的隐窝与凝胶基质充分混合...

肠道类器官培养是一种三维（3D）ex vivo 系统，该系统通过从原代组织的肠隐窝中分离干细胞，并将其接种于凝胶基质中进行培养1,2。这些干细胞具有自我更新、自我组织以及器官功能特性2。类器官能够模拟组织微环境，相较于二维（2D）in vitro 细胞培养模型更接近于in vivo模型，但其可操作性低于传统细胞培养3,4。该模型克服了2D培养模型中存在的诸多障碍，例如缺乏正常的细胞间黏附、细胞与基质相互作用以及细胞群体的均一性问题，同时也减少了动物模型的局限性，如高昂的成本和漫长的实验周期5。肠道类器官——当由结肠隐窝来源的干细胞培养时也称为结肠类器官（colonoids）——本质上是包含上皮层和腔体的小型器官，其上皮层包含所有在in vivo条件下存在的细胞类型。该模型可用于研究肠道的多个方面，如干细胞微环境、肠道生理学、病理生理学以及肠道形态发生3,5,6。此外，它还为药物发现、研究炎症性肠病（IBD）和结直肠癌等人类肠道疾病、开发患者特异性的个体化治疗方案以及组织再生研究提供了优良的模型系统4,7,8,9。同时，类器官系统还可用于研究细胞间通讯、药物代谢、细胞活力、增殖能力以及对刺激的反应7,8。尽管动物模型可用于测试潜在的肠道疾病治疗方法，但其应用受到明显限制，例如难以同时评估多种药物。此外，in vivo实验中存在更多混杂因素，且相关成本高、耗时长。相比之下，类器官培养系统可在较短时间内同时筛选多种治疗手段，并可通过使用患者来源的类器官培养实现个体化治疗4,8。结肠类器官模拟组织结构、微环境及功能的能力，使其成为研究组织再生与修复的理想模型9。本实验室已建立小肠类器官培养系统，用于研究claudin-7对小肠干细胞功能的影响10。在本研究中，我们建立了大肠类器官培养系统，旨在研究在条件性claudin-7敲除（cKO）模型中，干细胞自我更新、分化和增殖能力的有无或变化。
Claudin-7 是一种非常重要的紧密连接（tight junction, TJ）蛋白，在肠道中高表达，对维持紧密连接的功能和完整性至关重要11。条件性基因敲除（cKO）小鼠表现出类似炎症性肠病（IBD）的表型，伴有严重炎症、溃疡、上皮细胞脱落、腺瘤以及细胞因子水平升高11,12。尽管普遍认为claudin家族蛋白对上皮屏障功能至关重要，但近年来发现claudin还具有新的功能，参与细胞增殖、迁移、癌症进展以及干细胞功能的调控10,12,13,14,15,16,17。目前尚不清楚claudin-7如何影响结肠干细胞微环境及其功能。由于肠道约每5–7天快速自我更新一次，因此维持干细胞微环境以及活跃干细胞的正常功能至关重要18。本文建立了一种系统，用于研究claudin-7对结肠干细胞微环境可能存在的调控作用。

<table><tbody><tr><td>0.09 立方英尺省空间真空干燥器&amp;nbsp;</td><td>United States Plastic Corp</td><td>78564</td><td>麻醉室</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>1× Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>ThermoFisher</td><td>J61899.AK</td><td></td></tr><tr><td>4-羟基他莫昔芬（4OH-TAM）</td><td>Sigma</td><td>579002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 尼龙细胞筛</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 孔培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂（50×）</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-7 抗小鼠兔抗体</td><td>Immuno-Biological Laboratories&amp;nbsp;</td><td>18875</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（24 × 50-1.5）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>vwr</td><td>25608-916</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RCF BME，2 型</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3533-005-02</td><td>凝胶基质</td></tr><tr><td>Cy3 抗兔抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>杜瓦瓶</td><td>Thomas Scientific</td><td>1173F61</td><td></td></tr><tr><td>含 L-谷氨酰胺的高糖 DMEM</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FLoid 成像系统</td><td>ThermoFisher</td><td>4477136</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Fluoro-Gel II</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-50</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（100×）</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>JT Baker</td><td>4059-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）缓冲液</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>原位细胞死亡检测试剂盒，TMR Red</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Pivetal</td><td>07-893-8440</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN 培养基</td><td>哈佛医学院胃肠道类器官分离与培养中心</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>小鼠手术器械包</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂（100×）</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度（OCT）包埋剂&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sequenza 染色架</td><td>vwr</td><td>10129-584</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-279</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>真空滤器（0.22 &amp;micro;m；醋酸纤维素）</td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

肠道上皮每5-7天更新一次，这一过程由位于隐窝区域底部的肠道上皮干细胞（IESC）群体所调控。IESC包括活跃的干细胞，它们能够自我更新并分化为多种上皮细胞类型，以及静息态干细胞，后者在组织损伤时作为储备干细胞发挥作用。肠道上皮的再生依赖于这些活跃IESC的自我更新和分化能力。此外，隐窝干细胞群体的平衡以及干细胞微环境的维持对肠道再生至关重要。类器官培养是一种重要且具有吸引力的研究方法，可用于研究调控干细胞存活与功能的蛋白质、信号分子及环境信号。该模型相比动物模型成本更低、耗时更短，且更易于操作。类器官还能模拟组织微环境，具有体内相关性。in vivo 相关性。本实验方案描述了结肠隐窝的分离、将分离得到的隐窝细胞嵌入三维凝胶基质系统，并进行培养以形成具有自我组织、增殖、自我更新和分化能力的结肠类器官。该模型允许研究人员对环境进行操控——例如敲除特定蛋白（如claudin-7）、激活或抑制信号通路等——以研究这些干预如何影响结肠干细胞的功能。具体而言，本研究探讨了紧密连接蛋白claudin-7在结肠干细胞功能中的作用。claudin-7对于维持肠道稳态以及屏障功能和完整性至关重要。在小鼠中敲除claudin-7会引发类似炎症性肠病的表型，表现为肠道炎症、上皮增生、体重减轻、黏膜溃疡、上皮细胞脱落以及腺瘤形成。此前已有报道指出，claudin-7在小肠上皮干细胞功能中是必需的。在本方案中，建立了结肠类器官培养系统，用于研究claudin-7在大肠中的作用。

为了研究claudin-7对结肠干细胞的调控作用，按照上述方法并如图1A所示，从小鼠结肠组织中分离出结肠隐窝。隐窝从原代组织中分离后，接种于96孔板中的三维基质中，培养11天（图1）。正常的健康隐窝在第2天时管腔闭合，形成类球状结构，并在约第5天开始出芽并分化为多种上皮细胞类型（图1B）。结肠类器官培养至第11天后收获，用于后续实验（图1B）。为了在培养中敲除claudin-7，隐窝先正常培养24小时。24小时后，加入3 µmol/L 4OH-他莫昔芬（TAM）处理，并继续培养10天。每2天更换一次含新鲜4OH-TAM的培养基。对照孔中使用DMSO作为溶剂对照。claudin-7缺陷的隐窝（claudin-7 KO）无法正常形成类球状结构，并在加入4OH-TAM处理1天后迅速开始死亡（图1B）。
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本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。

肠上皮每5-7天更新一次，这一过程由位于隐窝底部的肠上皮干细胞（IESC）群体调控。

本方案提供了一种在可调控环境中研究结肠干细胞功能的方法，相较于动物模型可显著节省时间成本。类器官培养能够在无免疫干扰的环境中研究干细胞功能，从而精确定位特定因素的作用，例如敲除紧密连接蛋白-7（claudin-7）所产生的效应。了解干细胞功能的机制可能为炎症性肠病和结直肠癌等致残性疾病提供新的治疗靶点。开始从安乐死小鼠中分离结肠隐窝时，沿小鼠体中线做一条约两英寸长的切口，然后将皮肤向两侧展开并固定，以暴露腹部。从近端在盲肠下方切断结肠，从远端在直肠上方切断，以分离结肠。接着，使用镊子去除附着在结肠上的脂肪组织。用镊子的平端将分离出的结肠内的粪便推出后，沿纵轴将组织切开。用冷的PBS洗涤组织10至15次，每次洗涤之间用镊子轻轻搅动组织。然后使用一把干净且锋利的剪刀，将组织切成大小约为3至5毫米的小块。从另一只安乐死的小鼠中分离出结肠后，将所有组织块放入含有冷上皮解离培养基的50毫升离心管中，并在4摄氏度下轻轻摇动孵育90分钟。孵育后，让组织碎片沉降到管底。待其沉降后，在不扰动组织碎片的情况下弃去上皮解离培养基。用冷的PBS洗涤组织时，重复此步骤10至15次。最后一次洗涤时，尽可能弃去PBS。接着，在50毫升离心管中向洗涤后的结肠组织块加入冷的隐窝解离培养基，手动振荡5至10分钟。在细胞培养超净台内，使用70微米尼龙细胞滤网将含有组织的培养基过滤至新的50毫升离心管中。过滤后，在室温下以 200 × g 离心 10 分钟，随后弃去上清液，注意不要扰动沉淀的隐窝。用三到四毫升冷的 PBS 重悬沉淀。取 10 µL 隐窝悬液，沿直线滴加到显微镜载玻片上。使用显微镜计数完整且较长的隐窝数量，以估算隐窝浓度，并计算在96孔板中每微升接种10个隐窝所需的隐窝适当体积。在1.5毫升微量离心管中，将适量分离的隐窝在4摄氏度下以200 ×g离心5分钟。然后，使用1,000微升移液器小心吸除上清液，避免扰动已沉淀的隐窝。然后，向沉淀的隐窝中加入 100 µL 凝胶基质，避免引入气泡。静置 1 至 2 分钟，直至凝胶基质部分凝固。接着，将含有隐窝的凝胶基质混合物每孔 10 µL 接种至预热的 96 孔培养板的各孔中，形成圆顶状结构。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10至20分钟，使凝胶基质完全凝固。最后，向每孔中加入100微升新鲜配制的含抗生素的L-WRN工作液，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。收集类器官时，通过真空抽吸去除各孔中的旧培养基，并在室温下用4%多聚甲醛固定类器官1小时。然后用真空抽吸法从孔中移除4%多聚甲醛，并在4°C条件下，每孔加入100微升30%蔗糖处理类器官。24小时后，用真空抽吸法移除孔中的30%蔗糖，随后每孔加入10微升PBS。用移液器吸头轻轻刮擦孔底，使含有圆顶结构的类器官解离。接下来，用移液器将含有解离类器官的 PBS 从孔中移除，并转移至一个已标记的塑料模具中，模具内预先填充了90%的最佳切割温度包埋剂（OCT 化合物）。重复此操作，直至所有孔中的类器官均被移除。向装有干冰颗粒的不锈钢杜瓦瓶中加入2-甲基丁烷，用量以完全覆盖干冰颗粒为宜。通过将含有类器官的OCT包埋块稳定地悬置于2-甲基丁烷上方，进行速冻。最后，将含有类器官的OCT包埋块保存于-80摄氏度，直至准备切片。代表性图像展示了从含有claudin-7的正常隐窝成功生长出的结肠类器官。含有 claudin-7 的隐窝在第 2 天开始形成类球体，第 5 天开始出芽，并持续生长和出芽，直至第 9 天收获。相比之下，缺乏 claudin-7 的隐窝无法形成正常的结肠类器官。经 4-羟基他莫昔芬处理 2 至 3 天后，claudin-7 敲除的隐窝呈现为圆形的细胞团块。与对照组不同，隐窝未能生长成健康的类球体。对收获的对照组和条件性敲除类器官进行claudin-7的免疫荧光染色，证实了在培养过程中claudin-7的成功敲除。对照组结肠类器官在第9天时几乎未见凋亡信号。然而，claudin-7 基因敲除的结肠类器官在同一时期表现出较高的细胞凋亡。接种前需确保基质胶部分凝固。若在部分凝固前接种，会导致凝胶基质扩散，无法形成圆顶结构，从而影响隐窝的存活与生长。该方案可用于药物发现、细胞间通讯研究、药物代谢、细胞活力与增殖分析，以及患者特异性个体化治疗的开发。类器官培养体系的建立，极大地推动了疾病研究和个体化医学的发展。

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关键词：类器官，小肠绒毛上皮，去分化，三维培养

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小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能离体

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