小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

本方案提供了一种在可调控环境中研究结肠干细胞功能的方法，相较于动物模型可显著节省时间成本。类器官培养能够在无免疫干扰的环境中研究干细胞功能，从而精确定位特定因素的作用，例如敲除紧密连接蛋白-7（claudin-7）所产生的效应。

了解干细胞功能的机制可能为炎症性肠病和结直肠癌等致残性疾病提供新的治疗靶点。开始从安乐死小鼠中分离结肠隐窝时，沿小鼠体中线做一条约两英寸长的切口，然后将皮肤向两侧展开并固定，以暴露腹部。

从近端在盲肠下方切断结肠，从远端在直肠上方切断，以分离结肠。接着，使用镊子去除附着在结肠上的脂肪组织。用镊子的平端将分离出的结肠内的粪便推出后，沿纵轴将组织切开。

用冷的PBS洗涤组织10至15次，每次洗涤之间用镊子轻轻搅动组织。然后使用一把干净且锋利的剪刀，将组织切成大小约为3至5毫米的小块。从另一只安乐死的小鼠中分离出结肠后，将所有组织块放入含有冷上皮解离培养基的50毫升离心管中，并在4摄氏度下轻轻摇动孵育90分钟。

孵育后，让组织碎片沉降到管底。待其沉降后，在不扰动组织碎片的情况下弃去上皮解离培养基。用冷的PBS洗涤组织时，重复此步骤10至15次。

最后一次洗涤时，尽可能弃去PBS。接着，在50毫升离心管中向洗涤后的结肠组织块加入冷的隐窝解离培养基，手动振荡5至10分钟。在细胞培养超净台内，使用70微米尼龙细胞滤网将含有组织的培养基过滤至新的50毫升离心管中。

过滤后，在室温下以 200 × g 离心 10 分钟，随后弃去上清液，注意不要扰动沉淀的隐窝。用三到四毫升冷的 PBS 重悬沉淀。取 10 µL 隐窝悬液，沿直线滴加到显微镜载玻片上。

使用显微镜计数完整且较长的隐窝数量，以估算隐窝浓度，并计算在96孔板中每微升接种10个隐窝所需的隐窝适当体积。在1.5毫升微量离心管中，将适量分离的隐窝在4摄氏度下以200 ×g离心5分钟。然后，使用1,000微升移液器小心吸除上清液，避免扰动已沉淀的隐窝。

然后，向沉淀的隐窝中加入 100 µL 凝胶基质，避免引入气泡。静置 1 至 2 分钟，直至凝胶基质部分凝固。接着，将含有隐窝的凝胶基质混合物每孔 10 µL 接种至预热的 96 孔培养板的各孔中，形成圆顶状结构。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10至20分钟，使凝胶基质完全凝固。最后，向每孔中加入100微升新鲜配制的含抗生素的L-WRN工作液，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。收集类器官时，通过真空抽吸去除各孔中的旧培养基，并在室温下用4%多聚甲醛固定类器官1小时。

然后用真空抽吸法从孔中移除4%多聚甲醛，并在4°C条件下，每孔加入100微升30%蔗糖处理类器官。24小时后，用真空抽吸法移除孔中的30%蔗糖，随后每孔加入10微升PBS。用移液器吸头轻轻刮擦孔底，使含有圆顶结构的类器官解离。

接下来，用移液器将含有解离类器官的 PBS 从孔中移除，并转移至一个已标记的塑料模具中，模具内预先填充了90%的最佳切割温度包埋剂（OCT 化合物）。重复此操作，直至所有孔中的类器官均被移除。向装有干冰颗粒的不锈钢杜瓦瓶中加入2-甲基丁烷，用量以完全覆盖干冰颗粒为宜。

通过将含有类器官的OCT包埋块稳定地悬置于2-甲基丁烷上方，进行速冻。最后，将含有类器官的OCT包埋块保存于-80摄氏度，直至准备切片。代表性图像展示了从含有claudin-7的正常隐窝成功生长出的结肠类器官。

含有 claudin-7 的隐窝在第 2 天开始形成类球体，第 5 天开始出芽，并持续生长和出芽，直至第 9 天收获。相比之下，缺乏 claudin-7 的隐窝无法形成正常的结肠类器官。经 4-羟基他莫昔芬处理 2 至 3 天后，claudin-7 敲除的隐窝呈现为圆形的细胞团块。

与对照组不同，隐窝未能生长成健康的类球体。对收获的对照组和条件性敲除类器官进行claudin-7的免疫荧光染色，证实了在培养过程中claudin-7的成功敲除。对照组结肠类器官在第9天时几乎未见凋亡信号。

然而，claudin-7 基因敲除的结肠类器官在同一时期表现出较高的细胞凋亡。接种前需确保基质胶部分凝固。若在部分凝固前接种，会导致凝胶基质扩散，无法形成圆顶结构，从而影响隐窝的存活与生长。

该方案可用于药物发现、细胞间通讯研究、药物代谢、细胞活力与增殖分析，以及患者特异性个体化治疗的开发。类器官培养体系的建立，极大地推动了疾病研究和个体化医学的发展。