小鼠结肠隐窝三维培养离体研究肠道干细胞功能

该协议提供了一种在可操纵环境中研究结肠干细胞功能的方法，其时间成本低于动物模型。类器官培养允许在无免疫环境中研究干细胞功能。这允许精确定位特定原因的影响，例如敲除claudin-7。

了解干细胞功能的机制可能会揭示炎症性肠病和结直肠癌等衰弱疾病的新治疗靶点。要开始从安乐死小鼠中分离结肠隐窝，请在小鼠中线下方切开约两英寸的切口。然后，将皮肤向后固定以露出腹部。

从近端切开结肠正下方的结肠，从远端切开直肠上方的结肠，以隔离结肠。接下来，使用镊子去除附着在结肠上的脂肪组织。用镊子的平端从分离的结肠中推出粪便后，纵向切开组织。

用冷PBS清洗纸巾10至15次，方法是在用镊子洗涤之间在PBS中旋转纸巾。然后用一把干净、锋利的剪刀，将组织切成大约三到五毫米的小块。从另一只安乐死小鼠中分离结肠后，将所有组织碎片合并到含有冷上皮解离培养基的50毫升离心管中，并将结肠组织碎片在上皮解离培养基中孵育90分钟在4摄氏度下轻轻摇动。

孵育后，让组织碎片沉入管底部。一旦沉淀，丢弃上皮解离介质而不破坏组织碎片。用冷PBS清洗纸巾10至15次时重复该过程。

在最后一次洗涤期间尽可能多地丢弃PBS。接下来，将冷隐窝解离介质添加到50毫升管中洗涤的结肠组织碎片中，并用手摇动5至10分钟。在细胞培养罩下，用70微米尼龙细胞过滤器将含有组织的培养基过滤到新鲜的50毫升离心管中。

过滤后，在室温下以200G离心管10分钟，然后丢弃上清液而不干扰颗粒状的隐窝。将沉淀重悬于三到四毫升冷PBS中。在显微镜载玻片上沿线移取10微升隐窝悬浮液。

使用显微镜，计算完整、长地穴的数量以估计隐窝浓度，并计算在 96 孔板中每微升接种 10 个隐窝所需的适当隐窝体积。在 1.5 毫升微量离心管中以 200 G 在 4 摄氏度下离心适量分离的隐窝五分钟。然后，使用1， 000微升移液管除去上清液，而不会破坏颗粒状的隐窝。

然后，向颗粒状隐窝中加入100微升凝胶基质，而不会引入气泡。等待一到两分钟，直到凝胶基质部分凝固。然后，将10微升凝胶基质与预热的96孔培养板的每个孔中的隐窝混合，以形成圆顶形状。

通过将板置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中，等待10至20分钟以使凝胶基质完全凝固。最后，向每个孔中加入100微升补充有抗生素的L-WRN培养基的新鲜制备的工作溶液，并将板在37摄氏度下在5%二氧化碳下孵育24小时。要收获类器官，请通过真空抽吸从孔中去除旧培养基，并在室温下用4%多聚甲醛固定类器官一小时。

然后通过真空抽吸从孔中除去4%的多聚甲醛，并在4摄氏度下每孔用100微升30%蔗糖处理类器官。24小时后，通过真空抽吸从孔中除去30%的蔗糖，然后向每个孔中加入10微升PBS。使用移液器吸头轻轻刮擦孔底部，以解离含有圆顶的类器官。

接下来，用移液管从孔中取出含有解离类器官的PBS，并将其转移到填充90%最佳切割温度或OCT化合物的标记塑料模具中。继续该过程，直到从所有孔中取出所有类器官。将2-甲基丁烷加入含有干冰颗粒的不锈钢杜瓦瓶中，足以覆盖颗粒。

快速冷冻含有OCT块的类器官，将其稳定地保持在2-甲基丁烷上方。最后，将含有类器官的OCT块储存在零下80摄氏度，直到准备好切片。代表性图像突出显示了含有claudin-7的正常隐窝中结肠类化合物的成功生长。

含有claudin-7的地穴在第二天开始形成球状体，在第五天开始萌芽，并继续生长和萌芽，直到第九天收获。相比之下，缺乏claudin-7的隐窝未能形成适当的结肠。用4-羟基他莫昔芬治疗两到三天后，claudin-7敲除隐窝显示为圆形细胞团块。

与对照组不同，隐窝没有长成健康的球体。收获的对照中claudin-7的免疫荧光染色和条件敲除类器官证实了培养物中claudin-7的成功敲除。对照结肠在第九天表现出很少的凋亡信号。

然而，claudin-7敲除结肠同时表现出高凋亡性。确保电镀前部分凝固。部分凝固前电镀会导致凝胶基质扩散，不会形成圆顶，影响隐窝的存活和生长。

该协议可用于药物发现，研究细胞通讯，药物代谢，活力，增殖以及开发患者特异性个性化治疗。类器官培养的建立彻底改变了疾病研究和个性化医学。