Name: 液相色谱-串联质谱法制备泪液蛋白质组学的蛋白质悬浮捕获样品 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学习使用蛋白质悬浮捕获技术制备泪液样品进行液相色谱-串联质谱分析。该方法利用Schirmer试纸收集人眼泪液，实现室温储存和高效肽段回收，可鉴定1183种蛋白质，为眼科非侵入性分子检测提供标准化方案。

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本工作由创新香港研发平台计划（InnoHK）和香港特别行政区政府；SHARP Vision研究中心；以及香港理工大学中医药创新研究中心（RCMI）资助。

受试者在参与研究前均签署了书面知情同意书。本研究获得了香港理工大学人体伦理委员会的批准，并遵循《赫尔辛基宣言》的原则。
1.&#160;使用Schirmer试纸采集人泪液
<ol>
	<li>佩戴手套并进行消毒，以避免样本污染。</li>
	<li>检查内包装是否完整、无菌且未过期。</li>
	<li>在试纸条顶端0 mm刻度处，沿半圆形尖端所示位置，将试纸条顶端略微向内弯曲（图1）。</li>
	<li>捏住试纸条末端将其从内包装中取出，避免直接接触0至25 mm的样本采集区域。</li>
	<li>请受试者将视线移开即将放置试纸条的位置。</li>
	<li>轻轻下拉下眼睑，将试纸条末端钩入靠近外眦区域的下穹窿部（图2）。另一只眼重复相同操作。</li>
	<li>请受试者轻轻闭合眼睑，以减少刺激。</li>
	<li>收集泪液约5分钟，或以收集到15–20 mm泪液样本为佳。</li>
	<li>请受试者睁开双眼，轻轻下拉下眼睑，并取出试纸条。</li>
	<li>观察Schirmer试纸条上湿润部分的长度，并以毫米（mm）为单位记录收集量。</li>
	<li>使用标准洁净的框架加热器将试纸条烘干，直至液体完全干燥。 
	&#8203;注意：应避免过度加热，以防滤纸炭化。</li>
	<li>将每条干燥后的Schirmer试纸条放入已标记的冻存管中，最好避光保存于阴凉干燥处，直至进一步处理。</li>
</ol>
2.&#160;化学试剂的配制
<ol>
	<li>裂解缓冲液（5% SDS，50 mM TEAB，pH 7.5），20 mL
	<ol>
		<li>移取 1 mL 1 M TEAB 和 80 µL 12% 磷酸，涡旋并短暂超声以去除气泡，用去离子水定容至 20 mL。</li>
		<li>称取 1 g SDS，加入溶液中，振荡至完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白沉淀缓冲液（90% 甲醇，100 mM TEAB，pH 7.1），10 mL
	<ol>
		<li>加入 893 µL 1 M TEAB 和 92 µL 去离子水。</li>
		<li>向溶液中加入 15 µL 85 wt. % 磷酸和 9 mL 甲醇，短暂涡旋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化缓冲液（50 mM TEAB），1 mL
	<ol>
		<li>加入 50 µL 1 M TEAB，用去离子水定容至 1 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>200 mM 二硫苏糖醇（DTT）溶液，500 µL
	<ol>
		<li>称取 15 mg DTT，溶于 500 µL 去离子水中，短暂涡旋。 
		注意：使用前配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>400 mM 碘乙酰胺（IAA）溶液，200 µL
	<ol>
		<li>称取 15 mg IAA，溶于 200 µL 去离子水中，短暂涡旋。注意：使用前配制，避光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.2% 甲酸，50% 乙腈，10 mL
	<ol>
		<li>用去离子水配制 10 mL 50% 乙腈溶液。</li>
		<li>加入 20 µL 甲酸，短暂涡旋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.2% 甲酸溶液，10 mL
	<ol>
		<li>将 20 µL 甲酸加入 10 mL 去离子水中，短暂涡旋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.1% 甲酸溶液，10 mL
	<ol>
		<li>将 10 µL 甲酸加入 10 mL 去离子水中，短暂涡旋。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.&#160;泪液试纸条中的蛋白质提取
<ol>
	<li>使用洁净的不锈钢剪刀剪除试纸条前端0 mm标记以外的部分并弃去，以去除因结膜组织与剪刀接触可能造成的污染。</li>
	<li>将试纸条按1 mm间隔剪切，放入1.5 mL微量离心管中（图3）。</li>
	<li>向微量离心管中加入100 µL裂解缓冲液，在恒温混匀仪中于室温、1,000 rpm条件下涡旋振荡1小时。</li>
	<li>短暂离心后，将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>使用洁净镊子将试纸条转移至200 µL移液器吸头中，将吸头放入步骤3.4中的同一离心管内，并用支架固定，在室温下以4,000 × g离心1分钟，以最大程度回收试纸条上残留的样品。</li>
	<li>使用二辛可宁酸（BCA）或其他兼容的蛋白质定量方法测定蛋白浓度。</li>
</ol>
4.&#160;悬浮捕获样品制备
<ol>
	<li>根据蛋白测定结果，将样品归一化至每份含 50 µg 蛋白质。</li>
	<li>按 1:10（v/v，DTT: 样品）的比例加入 200 mM DTT，使终浓度为 20 mM DTT，于 95 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>将蛋白溶液冷却至室温。</li>
	<li>按 1:10（v/v，IAA: 样品）的比例加入 400 mM IAA，使终浓度为 40 mM IAA，避光、室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>按 1:10（v/v，酸: 样品）的比例加入 12% 磷酸水溶液，使终浓度为 1.2% 磷酸，短暂涡旋混匀。</li>
	<li>按 1:6（v/v，样品: 缓冲液）的比例加入蛋白结合缓冲液，短暂涡旋混匀。 
	注意：此步骤中应形成胶体蛋白颗粒，若蛋白量充足，溶液将呈半透明状。</li>
	<li>打开悬浮捕获微型离心柱的盖子，并将离心柱组装到 2 mL 微量离心管上以收集穿流液。</li>
	<li>向柱中加入最多 200 µL 酸化蛋白裂解液混合物。</li>
	<li>在 4,000 × g 条件下离心 20 秒，蛋白颗粒被截留在柱中；重复此步骤直至所有样品完全上样。</li>
	<li>加入 150 µL 蛋白结合缓冲液，在 4,000 × g 条件下离心 20 秒以洗涤悬浮蛋白，重复 3 次。</li>
	<li>将悬浮捕获微型离心柱组装到新的 1.5 mL 微量离心管上。</li>
	<li>在离心柱内的滤膜上加入 20 µL 含蛋白酶的 50 mM TEAB 消化缓冲液（胰蛋白酶: 蛋白质量比为 1:25），避免产生气泡或滤膜与消化液之间形成气隙。</li>
	<li>盖上悬浮捕获微型离心柱盖子以防止蒸发，在 47 °C 恒温混匀仪中孵育 1 小时；消化过程中不得振荡或涡旋。</li>
	<li>用 40 µL 50 mM TEAB 通过 4,000 × g 离心力洗脱肽段，离心 20 秒。</li>
	<li>加入 40 µL 0.2% 甲酸，于 4,000 × g 离心 20 秒。</li>
	<li>加入 35 µL 0.2% 甲酸、50% 乙腈溶液，于 4,000 × g 离心 20 秒。</li>
	<li>合并三次洗脱液，并用真空离心浓缩仪干燥。</li>
	<li>储存于 -80 °C 超低温冰箱中，待后续分析。注意：本方案可在此处暂停。</li>
</ol>
5.&#160;为质谱分析重建多肽
<ol>
	<li>用 12 µL 的 0.1% 甲酸（FA）重悬样品，涡旋混匀，短暂离心。</li>
	<li>使用多肽检测试剂盒测定多肽浓度。</li>
	<li>用 0.1% 甲酸（FA）将多肽浓度调整至 0.5 µg/µL。</li>
	<li>将多肽混合物转移至自动进样瓶中，准备进行质谱分析。</li>
</ol>
6.&#160;采用液相色谱-串联质谱法进行样品采集
<ol>
	<li>以等度上样缓冲液（0.1% 甲酸，5% 乙腈）将 3 µg 肽段加载至捕获柱（C18，5 µm，100 µm，20 mm），流速为 2 µL/min，持续 15 分钟。</li>
	<li>使用反相纳米分析柱（C18，5 µm，100 µm，300 mm），在 155 分钟分离梯度中以 350 nL/min 的流速对肽段进行分级分离。流动相 A 为含 0.1% 甲酸（v/v）和 5% 乙腈（v/v）的水溶液，流动相 B 为含 0.1% 甲酸（v/v）和 98% 乙腈（v/v）的水溶液。采用以下梯度程序：0–0.5 分钟：5% B，0.5–90 分钟：10% B，90–120 分钟：20% B，120–130 分钟：28% B，130–135 分钟：45% B，135–141 分钟：80% B，141–155 分钟：5% B。</li>
	<li>进行数据依赖性采集（DDA），采用飞行时间质谱（TOF-MS），扫描范围为 350 至 1800 m/z，累积时间为 250 ms，动态排除时间为 18 s；随后以高灵敏度模式对每个循环中前 50 个母离子进行 MS/MS 扫描，扫描范围为 100 至 1,800 m/z，累积时间为 50 ms，MS/MS 信号强度阈值为 125 cps，电荷态范围为 +2 至 +4。</li>
	<li>使用引用的软件或其他兼容的搜索引擎，结合来自公共可访问 UniProt 数据库的 FASTA 格式参考数据库，对原始数据进行分析。</li>
</ol>

Non-Invasive Biomarker Discovery for Tear Proteomics Using LC-MS

<ol><li>Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+mass+spectrometry+proteomics+in+tear+biomarker+discovery+for+multifactorial+ocular+diseases+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83(2021).</li>
<li>Tse, J. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+clinical+data+and+tear+proteomics+to+assess+efficacy%2C+ocular+surface+status%2C+and+biomarker+response+after+orthokeratology+lens+wear%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear.</a> Translational Vision Science & Technology. 10 (11), 18(2021).</li>
<li>Cheung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tear+proteome+dataset+in+response+to+daily+wear+of+water+gradient+contact+lens+using+SWATH-MS+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach.</a> Data in Brief. 36, 107120(2021).</li>
<li>Tse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+on+assessment+of+safety+and+tear+proteome+change+in+response+to+orthokeratology+lens+-+Insight+from+integrating+clinical+data+and+next+generation+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics.</a> Data in Brief. 29, 105186(2020).</li>
<li>Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+human+tear+fluid+biomarkers+specific+for+ocular+and+systemic+diseases+in+the+context+of+3P+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22The+EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine.</a> The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).</li>
<li>Ponzini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+tear+proteomics+for+noninvasive+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).</li>
<li>HaileMariam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Trap%2C+an+ultrafast+sample-preparation+approach+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+proteomics%3A+evaluation+of+different+sample+preparation+workflows+for+quantitative%2C+reproducible%2C+and+improved+depth+of+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li>
<li>Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in-solution%2C+FASP%2C+and+S-Trap+based+digestion+methods+for+bottom-up+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).</li>
<li>Sze, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+fractionated+neural+retina+proteome+of+normal+growing+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse.</a> Scientific Data. 8 (1), 27(2021).</li>
<li>Marchione, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HYPERsol%3A+High-quality+data+from+archival+FFPE+tissue+for+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).</li>
<li>Chhuon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+S-Trap-based+approach+to+the+analysis+of+T+cell+lipid+raft+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome.</a> Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).</li>
<li>Hayoun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+fast+proteotyping+of+microorganisms+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1985(2019).</li>
<li>Templeton, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SPEED%2C+S-Trap%2C+and+in-solution-based+sample+preparation+methods+for+mass+spectrometry+in+kidney+tissue+and+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290(2023).</li>
<li>Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+technologies+for+cancer+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proteomics technologies for cancer liquid biopsies.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 53(2022).</li>
<li>Nättinen, J., Aapola, U., Jylhä, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+capillary+and+Schirmer+strip+tear+fluid+sampling+methods+using+SWATH-MS+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Vision+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach.</a> Translational Vision Science & Technology. 9 (3), 16(2020).</li>
<li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid%3A+from+sampling+to+preanalytical+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11 (1), 10064(2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

为确保本方法获得准确结果，在从泪液样本采集开始的所有操作步骤中，均应佩戴无粉一次性手套，以避免样本污染。每个步骤中，应使用微型离心柱，避免滤膜与样本溶液之间产生气泡或空气间隙。若样本体积超过离心柱的容量，建议重复操作过程。与传统的溶液内消化法相比，本方案在制备时间、蛋白质回收率以及总蛋白质鉴定数量方面均表现出更高效率。这主要是因为样本的大部分必要操作均在同一离心柱上完成，而溶液内消化法则涉及多次转移步骤，如丙酮沉淀、酶解和脱盐纯化等，从而增加了实验数据变异的可能性。
除了使用微毛细管法采集的泪液样本16,17外，这种结合悬浮捕获微型色谱柱的FASP工作流程提供了一种替代性的样本制备方法，可快速、稳健地处理采用Schirmer试纸采集的泪液样本，材料准备步骤极少且操作简便。该方法可实现大规模队列研究中多种眼部疾病或状态下泪液样本的可重复制备，相较于溶液内消化法，显著提高了质谱分析中的肽段回收率和蛋白质鉴定数量。这一可靠流程可常规用于科研及其他临床用途的泪液生物标志物样本制备。尤为重要的是，该方法对现场采集人员的培训要求极低，且无需将样本冷冻保存。样本可在采集现场直接干燥，以最大限度减少蛋白质自降解和降解。因此，样本可通过邮寄方式便捷转运，便于后续分析，而无需使用微毛细管。

泪液蛋白质组学已受到关注，可用于探索眼表疾病及相关状况的潜在生物标志物1,2,3,4,5,6，研究眼部及全身性疾病的发病机制，并利用Schirmer试纸无创采集泪液样本的优势。新一代质谱技术的进步使得在微升级泪液样本中进行准确且精确的蛋白质定量成为可能，这是以往无法实现的。然而，目前样本制备方法尚未标准化。建立稳健且标准化的样本制备流程，对于泪液蛋白质生物标志物研究在临床应用中的成功至关重要。悬浮捕获（S-Trap）样本制备流程最近被报道为一种高效且灵敏的方法，适用于广泛的下游蛋白质组学分析7,8。然而，该策略在人泪液蛋白质组分析中的应用尚鲜有报道。在酶解效率以及质谱分析中鉴定出的蛋白质数量方面，S-Trap方法已显示出优于滤膜辅助样本制备（FASP）和溶液内消化法的表现9。基于S-Trap的方法已被成功应用于视网膜组织10、甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织11、细胞12、微生物13以及液体活检样本14,15的制备。
本方案描述了一种从临床样本到酶解蛋白质的整合定量工作流程，旨在通过一种快速、可重复且稳健的技术策略，发现无创性泪液蛋白质生物标志物组合。简言之，采用标准的Schirmer试纸条采集泪液，并立即使用眼科框架加热器干燥，以防止蛋白质在室温下发生自降解。根据制造商建议，使用5%十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液提取试纸条中嵌入的总蛋白，随后进行蛋白定量检测。提取的裂解液随后经二硫苏糖醇（DTT）标准还原处理，并用碘乙酰胺（IAA）进行烷基化。
加入磷酸酸化后，向样品中加入含90%甲醇和100 mM三乙基铵碳酸氢盐（TEAB）的悬浮捕获柱蛋白沉淀缓冲液以沉淀蛋白质。随后将样品转移至新的悬浮捕获微柱中。在47 °C下，以1:25（w/w，胰蛋白酶:蛋白质）的比例加入测序级胰蛋白酶进行酶解消化，反应1小时。生成的肽段依次用50 mM TEAB、0.2%甲酸水溶液（FA）以及含0.2% FA的50%乙腈（ACN）通过离心洗脱。收集的肽段经真空干燥后，重新溶解于0.1% FA中。测定肽段浓度，并调整至0.5 µg/µL，用于质谱分析。

<table><tbody><tr><td>9 mm 塑料螺纹小瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4000-11</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，LCMS 级</td><td>Anaqua</td><td>AC-1026</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin plus 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5453000097</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT），BioUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，ACS 试剂，&amp;ge;96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMONSUN 电子加热架</td><td>Breitfeld &amp; Schliekert GmbH</td><td>1203166</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA），BioUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，HPLC 级</td><td>Anaqua</td><td>MA-1292</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 生物样本库和细胞培养冻存管，2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>磷酸，85 wt.% 水溶液 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>345245</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 定量比色多肽检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Rapid Gold BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>四极杆飞行时间质谱仪</td><td>Sciex</td><td>TripleTOF 6600</td><td></td></tr><tr><td>Schirmer 眼科试纸条</td><td>Entod Research Cell UK Ltd</td><td>I-DEW Tearstrips</td><td></td></tr><tr><td>S-Trap 微型色谱柱</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>SureSTART 9 mm 螺口盖</td><td>Thermo Scientific</td><td>CHSC9-40</td><td></td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵（TEAB），1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18597</td><td></td></tr><tr><td>超高效液相色谱</td><td>Eksigent</td><td>NanoLC 400&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15525017</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于液相色谱-串联质谱泪液蛋白质组学分析的蛋白质悬浮液捕获样品制备方法

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

泪液是一种易于获取的生物流体，可无创采集。泪液蛋白质组学有望发现多种眼部疾病和状态的生物标志物。已有研究报道，悬浮捕获柱是一种高效且操作简便的样品前处理流程，适用于下游蛋白质组学分析的广泛应用。然而，该策略在人泪液蛋白质组分析中的应用尚未得到充分研究。本方案描述了一种从临床人泪液样本到纯化肽段的整合式工作流程，用于基于质谱技术的无创泪液蛋白质生物标志物研究，结合生物信息学分析，可为疾病生物标志物的发现与监测提供重要线索。本研究应用并验证了蛋白质悬浮捕获样品制备方法，展现出快速、可重复且操作友好的特点，可作为人泪液分析的一种通用且优化的样品前处理方案。特别是，在肽段回收率、蛋白质鉴定数量以及样品制备时间方面，悬浮捕获法优于溶液内样品前处理法。

该方案允许使用Schirmer试纸采集泪液样本，样本可在室温下干燥保存，随后进行质谱分析前的样品制备。采用滤膜辅助样品制备（FASP）流程结合悬浮捕获微型色谱柱，可在数小时内完成快速样品处理，相较于常规溶液内消化方法通常需要数天且需过夜孵育，显著缩短了处理时间。肽段回收率显著提高（p < 0.05），且批间重复性良好（CV < 15%）。该方法适用于低丰度蛋白质的检测，为泪液蛋白质组学研究提供了高效、稳定的样品前处理策略。

关键词：泪液，Schirmer试纸，质谱分析，滤膜辅助样品制备，FASP，悬浮捕获微型色谱柱，肽段回收率，蛋白质组学 &lt; 0.001）低于标准的溶液内消化方法，且具有良好的重复性，变异系数（%CV）较低 &lt; 7%。泪液样本池在技术重复六次的实验中，采用溶液内处理方法制备的样本肽段回收率分别为74.2 ± 5.0%和52.8 ± 1.6%。一个蛋白含量为 36.3 µg 被加入至Schirmer试纸条并按先前所述方法提取，蛋白质的提取效率为81%（29.5 ± 6.8 µg，均值 ± 标准差。
两种工作流程均上样 3 µg 肽段至质谱仪，DDA 搜索在悬浮捕获组和溶液内消化组中分别鉴定出 1,183 ± 118 种蛋白质（5,757 ± 537 条独特肽段）和 874 ± 70 种蛋白质（4,400 ± 328 条肽段），错误发现率（FDR）为 1%。利用 PANTHER 分类系统进行基因本体（GO）分析显示，两种方法获得的蛋白质组高度相似，其主要分子功能均为结合、催化活性以及分子功能调控（图 4）。
<img alt="量筒体积测量过程、液面标记、实验室实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：在使用前，将Schirmer试纸条顶端在0 mm刻度处弯折。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用泪液试纸进行泪液测量，眼科实验中采用Schirmer试纸诊断干眼症。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：Schirmer试纸在泪液采集过程中的放置位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="泪液测量试纸条示意图，显示眼科研究中进行Schirmer试验时的丢弃区域。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：蛋白提取前Schirmer试纸条操作示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="溶液法与悬滴捕获法分组中活性分布的基因本体饼状图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：采用 PANTHER 分类系统对通过溶液法和悬滴捕获法工作流程鉴定出的蛋白质组进行基因本体分析的饼状图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种使用Schirmer试纸采集泪液样本的方法，以及用于发现无创性泪液蛋白质生物标志物的整合定量工作流程。采用悬浮液捕获（suspension trapping）样品制备流程可实现快速且稳健的泪液样品制备和质谱分析，相较于标准的溶液内消化方法，能够获得更高的肽段回收率和蛋白质鉴定数量。

泪液是一种易于获取的生物流体，可无创采集。泪液蛋白质组学有望发现用于……的生物标志物

本研究旨在展示一种基于蛋白质悬浮液捕获的样品制备方法（称为S-Trap）在质谱分析相关研究中的应用。该方案采用快速、可重复且标准化的方法制备人泪液样本，泪液通过Schirmer试纸采集，适用于眼科学领域的转化研究。人泪液是一种生物液体，可用于眼科无创性、个体化的分子检测。目前缺乏标准化的泪液采集和样本制备方法，而这些步骤对于疾病和健康状况的临床研究至关重要。非标准化的方法在不同研究之间难以比较和解释，从而影响临床结果。本方案支持在室温条件下进行泪液生物流体的采样与保存。这有助于更便捷地进行样本采集和运输。它可为质谱分析提供快速且稳定的肽段提取方法，从而提高肽段的回收率和鉴定率。该方案的样本制备步骤极少，可最大限度地减少误差和不确定性。通过质谱法快速且高效地进行蛋白质鉴定与定量，将有助于临床医生和研究人员开发无创性分子检测方法。无论采用何种检测方法，优化的样品制备始终是关键步骤之一。人类泪液的临床价值仍有待深入研究。所提出的样品制备方法有望为近期潜在的化学应用打开大门。操作开始前，请戴上手套并对手部进行消毒，以防止样品污染。检查泪液试纸条的内包装是否无菌、未过期且完好无损。接下来，在靠近半圆形顶端的零毫米刻度处，将Schirmer试纸条的顶端略微向内弯曲。用手捏住试纸条末端将其取出，避免直接接触零至25毫米的样本采集区域。指导受试者将视线移开，然后轻轻下拉下眼睑。将试纸条末端钩挂在靠近外眦区域的下穹窿处。对另一只眼睛重复此操作后，嘱受试者轻轻闭合眼睑，以尽量减少刺激。收集泪液约五分钟，直至获得15至20毫米的泪液样本。指导受试者睁开眼睛。轻轻下拉下眼睑，取下试纸条。接着，检查试纸条上湿润部分的长度，并记录收集到的液体量，单位为毫米。使用标准的洁净框式加热器干燥试纸条，直至液体蒸发。干燥后，立即将Schirmer试纸条放入已标记的冻存管中，并置于阴凉避光处以待后续处理。首先剪去并丢弃Schirmer试纸条前端超过零毫米刻度、含有干燥人泪液的部分。然后将条带切成1毫米的片段，并将片段放入一个1.5毫升的微量离心管中。接着向微量离心管中加入100微升裂解缓冲液。在恒温混匀仪中，于室温下以1000转/分钟涡旋震荡1小时。短暂离心后，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。使用洁净的镊子将条带移入200微升移液器吸头中。将吸头放回同一微量离心管中，然后离心以最大程度回收样品。使用二辛可宁酸（bicinchoninic acid）或兼容的蛋白质检测方法测定蛋白质浓度。首先将人泪液蛋白质样品归一化至50微克蛋白质。然后加入200毫摩尔的二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），使其终浓度为20毫摩尔DTT。在95摄氏度下孵育10分钟。将蛋白质溶液冷却至室温后，加入400毫摩尔的碘乙酰胺，使其终浓度为40毫摩尔。然后在室温下避光孵育10分钟。接下来，按1比10的比例加入12%的磷酸水溶液，使终浓度为1.2%。短暂涡旋混合液以混匀溶液。再按1比6的比例加入蛋白结合缓冲液，随后再次涡旋。打开悬浮捕获式微型离心柱的盖子，并将离心柱安装到一个2毫升微量离心管上以收集穿流液。向柱中加入最多200 µL酸化蛋白裂解液混合物。以4,000 ×g离心20秒。接着，加入150微升蛋白结合缓冲液，按之前方法离心，以洗涤悬浮的蛋白。将悬浮物截留微柱组装到新的1.5毫升微量离心管上。小心地将20微升TEAB消化缓冲液加入离心柱内的滤膜上，避免产生气泡和气隙。盖紧悬浮捕获型MicroSpin柱的盖子，防止蒸发。在47摄氏度的恒温混匀仪中孵育1小时，不振荡。用40微升50毫摩尔TEAB洗脱肽段。然后以 4,000 G 离心 20 秒。加入 40 微升 0.2% 甲酸，再次以相同条件离心。最后，加入 35 微升 0.2% 甲酸和 50% 乙腈，再次离心。将三种洗脱液收集并使用真空离心浓缩仪干燥。干燥后，将样品于-80摄氏度保存，以备后续分析。依赖数据采集搜索在悬浮捕获组中鉴定出共计1,183 ± 118种蛋白质，在溶液组中于1%FDR条件下鉴定出874 ± 70种蛋白质。基因本体分析显示，这两种方法得到的蛋白质组具有相似性，主要功能为结合催化活性和分子功能调控。

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