一种用于液相色谱-串联质谱泪液蛋白质组学分析的蛋白质悬浮液捕获样品制备方法

本研究旨在展示一种基于蛋白质悬浮液捕获的样品制备方法（称为S-Trap）在质谱分析相关研究中的应用。该方案采用快速、可重复且标准化的方法制备人泪液样本，泪液通过Schirmer试纸采集，适用于眼科学领域的转化研究。人泪液是一种生物液体，可用于眼科无创性、个体化的分子检测。

目前缺乏标准化的泪液采集和样本制备方法，而这些步骤对于疾病和健康状况的临床研究至关重要。非标准化的方法在不同研究之间难以比较和解释，从而影响临床结果。本方案支持在室温条件下进行泪液生物流体的采样与保存。

这有助于更便捷地进行样本采集和运输。它可为质谱分析提供快速且稳定的肽段提取方法，从而提高肽段的回收率和鉴定率。该方案的样本制备步骤极少，可最大限度地减少误差和不确定性。

通过质谱法快速且高效地进行蛋白质鉴定与定量，将有助于临床医生和研究人员开发无创性分子检测方法。无论采用何种检测方法，优化的样品制备始终是关键步骤之一。人类泪液的临床价值仍有待深入研究。

所提出的样品制备方法有望为近期潜在的化学应用打开大门。操作开始前，请戴上手套并对手部进行消毒，以防止样品污染。检查泪液试纸条的内包装是否无菌、未过期且完好无损。

接下来，在靠近半圆形顶端的零毫米刻度处，将Schirmer试纸条的顶端略微向内弯曲。用手捏住试纸条末端将其取出，避免直接接触零至25毫米的样本采集区域。指导受试者将视线移开，然后轻轻下拉下眼睑。

将试纸条末端钩挂在靠近外眦区域的下穹窿处。对另一只眼睛重复此操作后，嘱受试者轻轻闭合眼睑，以尽量减少刺激。收集泪液约五分钟，直至获得15至20毫米的泪液样本。

指导受试者睁开眼睛。轻轻下拉下眼睑，取下试纸条。接着，检查试纸条上湿润部分的长度，并记录收集到的液体量，单位为毫米。

使用标准的洁净框式加热器干燥试纸条，直至液体蒸发。干燥后，立即将Schirmer试纸条放入已标记的冻存管中，并置于阴凉避光处以待后续处理。首先剪去并丢弃Schirmer试纸条前端超过零毫米刻度、含有干燥人泪液的部分。

然后将条带切成1毫米的片段，并将片段放入一个1.5毫升的微量离心管中。接着向微量离心管中加入100微升裂解缓冲液。在恒温混匀仪中，于室温下以1000转/分钟涡旋震荡1小时。

短暂离心后，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。使用洁净的镊子将条带移入200微升移液器吸头中。将吸头放回同一微量离心管中，然后离心以最大程度回收样品。

使用二辛可宁酸（bicinchoninic acid）或兼容的蛋白质检测方法测定蛋白质浓度。首先将人泪液蛋白质样品归一化至50微克蛋白质。然后加入200毫摩尔的二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），使其终浓度为20毫摩尔DTT。

在95摄氏度下孵育10分钟。将蛋白质溶液冷却至室温后，加入400毫摩尔的碘乙酰胺，使其终浓度为40毫摩尔。然后在室温下避光孵育10分钟。

接下来，按1比10的比例加入12%的磷酸水溶液，使终浓度为1.2%。短暂涡旋混合液以混匀溶液。再按1比6的比例加入蛋白结合缓冲液，随后再次涡旋。

打开悬浮捕获式微型离心柱的盖子，并将离心柱安装到一个2毫升微量离心管上以收集穿流液。向柱中加入最多200 µL酸化蛋白裂解液混合物。以4,000 ×g离心20秒。

接着，加入150微升蛋白结合缓冲液，按之前方法离心，以洗涤悬浮的蛋白。将悬浮物截留微柱组装到新的1.5毫升微量离心管上。小心地将20微升TEAB消化缓冲液加入离心柱内的滤膜上，避免产生气泡和气隙。

盖紧悬浮捕获型MicroSpin柱的盖子，防止蒸发。在47摄氏度的恒温混匀仪中孵育1小时，不振荡。用40微升50毫摩尔TEAB洗脱肽段。

然后以 4,000 G 离心 20 秒。加入 40 微升 0.2% 甲酸，再次以相同条件离心。最后，加入 35 微升 0.2% 甲酸和 50% 乙腈，再次离心。

将三种洗脱液收集并使用真空离心浓缩仪干燥。干燥后，将样品于-80摄氏度保存，以备后续分析。依赖数据采集搜索在悬浮捕获组中鉴定出共计1,183 ± 118种蛋白质，在溶液组中于1%FDR条件下鉴定出874 ± 70种蛋白质。

基因本体分析显示，这两种方法得到的蛋白质组具有相似性，主要功能为结合催化活性和分子功能调控。