Name: 间变性甲状腺癌和头颈部鳞状细胞癌患者来源异种移植模型的建立与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 学习建立间变性甲状腺癌和头颈部鳞状细胞癌患者来源异种移植模型。该技术操作简便、成功率高，可反映肿瘤异质性和分子多样性，适用于抗肿瘤药物敏感性筛选和个性化治疗研究。

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本工作得到了四川省科技支撑计划（项目编号：2019JDRC0019 和 2021ZYD0097）、四川大学华西医院“1.3.5”学科卓越发展计划（项目编号：ZYJC18026）、四川大学华西医院“1.3.5”学科卓越发展计划——临床研究孵化项目（项目编号：2020HXFH023）、中央高校基本科研业务费专项资金（SCU2022D025）、成都市科技局国际科技合作项目（项目编号：2022-GH02-00023-HZ）、四川大学创新火花项目（项目编号：2019SCUH0015）以及华西医院-电子科技大学医工融合人才培育基金（项目编号：HXDZ22012）的资助。

所有动物实验均按照实验室动物护理评估与认证协会的指南进行，并经四川大学华西医院机构动物护理和使用委员会批准的方案实施。本研究使用了4至6周龄的NOD-SCID免疫缺陷小鼠（雌雄均有）以及4至6周龄的雌性Balb/c裸鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。华西医院伦理委员会批准了涉及人类受试者的研究（方案编号2020353）。每位患者均签署了书面知情同意书。
1. 实验准备
<ol>
	<li>准备好用于肿瘤移植的一次性刀片、已灭菌的剪刀和镊子及其他所需器械，将其放置于超净工作台上，并提前用紫外线照射消毒。</li>
	<li>准备无菌生理盐水和培养皿，以供实验过程中使用。</li>
</ol>
2. 新鲜肿瘤组织的获取与转运
<ol>
	<li>从手术室获取新鲜肿瘤组织样本（通常体积大于 5 mm × 5 mm），并将其放入含有无菌 HTK 溶液（见材料表）或生理盐水的 15 mL 或 50 mL 离心管中。对离心管进行标记。 
	注意：新鲜肿瘤组织样本来自经手术切除或穿刺取得的未分化甲状腺癌（ATC）或头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者。</li>
	<li>将离心管置于预先准备好的冰盒中。 
	注意：在此期间，移植操作人员必须准备好移植所需的各项物品（见材料表）。</li>
	<li>确保从样本采集到运送至实验室用于建立PDX模型的时间不超过 2 小时。运输过程中，需用冰水混合物或冰袋包围装有组织的离心管，以维持组织活性。</li>
</ol>
3. 肿瘤移植
<ol>
	<li>肿瘤组织送达实验室后，记录并重新编号。 
	注意：本研究中，患者信息严格保密。后续操作步骤均在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。进入实验室时，建议在工作服或防护服外穿着实验服，佩戴帽子和口罩。肿瘤组织处理应在生物安全柜中进行。</li>
	<li>用75%酒精对装有肿瘤组织的离心管进行消毒，并放置于操作台。使用无菌眼科镊将肿瘤组织转移至盛有生理盐水的6 cm培养皿中。接着，用刀片将其切成约2 mm × 2 mm 和 3 mm × 3 mm 的小块。</li>
	<li>将肿瘤组织碎块转移至含有适量生理盐水的6 cm培养皿中，用封口膜包裹培养皿，放入冰盒中，并连同所需器械（剪刀、镊子和接种针）一并带入SPF级动物房。</li>
	<li>按以下步骤准备实验动物：
	<ol>
		<li>对4–6周龄雌性或雄性NOD-SCID免疫缺陷小鼠右侧胸侧部脱毛，并用75%酒精消毒皮肤。通过腹腔注射80 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪（见材料表）对小鼠进行麻醉，并在其眼睛上涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。通过足底反射消失确认麻醉深度。</li>
		<li>用剪刀在小鼠右侧胸侧部中段皮肤上剪开一个2 mm切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从培养皿中取出一块肿瘤组织，用镊子将其放入2.4 mm × 2.0 mm的套管针中（见材料表）。</li>
	<li>固定小鼠，绷紧穿刺部位皮肤，使用含有肿瘤组织的套管针经初始2 mm皮肤切口将肿瘤植入，推进至肩背部，然后推动套管针芯。</li>
	<li>确保肿瘤组织被推出并留置于套管针穿刺形成的过渡性窦道内，随后拔出套管针。</li>
	<li>若拔针时肿瘤随针移动，应使用套管针重新调整位置，并缝合切口。 
	注意：本研究中，每只小鼠在背部前肢和后肢区域分别接种。根据每位患者的肿瘤大小，每个肿瘤样本接种1至3只小鼠。</li>
</ol>
4. 肿瘤组织保存、固定及蛋白质冷冻
注意：剩余的肿瘤组织分别用于种子保存、固定以及DNA/RNA/蛋白质冻存。
<ol>
	<li>将肿瘤组织放入冻存管前，用无菌纱布去除肿瘤表面的生理盐水，以确保肿瘤表面不过于湿润。</li>
	<li>取4至6块大小为2 mm × 2 mm的肿瘤组织放入2 mL细胞冻存管中，加入1 mL冻存液（由90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）组成），将冻存管置于程序降温盒中，于−80 °C过夜冷冻，最后转移至液氮中保存。</li>
	<li>将3 mm × 3 mm的肿瘤组织块置于10%中性缓冲福尔马林溶液中，用于组织固定，以进行病理学检查。</li>
	<li>将3 mm × 3 mm的组织块放入2 mL细胞冻存管中，迅速在液氮中冷冻，随后转移至−80 °C冰箱中，用于DNA/RNA及蛋白质提取。</li>
	<li>收集患者的临床信息，包括吸烟史、肿瘤大小、分化程度、病理亚型、癌症分级、癌症分期、远处转移情况、肿瘤原发部位、既往病史、免疫组织化学结果、头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的人乳头瘤病毒（HPV）感染状况以及治疗用药情况。</li>
</ol>
5. PDX 模型肿瘤的传代、冷冻保存与复苏
<ol>
	<li>每周使用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的长度和宽度，根据公式计算肿瘤体积：肿瘤体积 = 0.5 × 长度 × 宽度2，并绘制肿瘤生长曲线。</li>
	<li>当PDX肿瘤体积达到2,000 mm3时，将其传代至下一代小鼠，并进行肿瘤再移植。仪器准备步骤参照第4步。</li>
	<li>使用80 mg/kg剂量的氯胺酮麻醉小鼠后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。</li>
	<li>用75%酒精对皮肤进行消毒，然后使用剪刀剪开肿瘤周围的皮肤，用镊子取出肿瘤并置于培养皿中。&#160;</li>
	<li>肿瘤移植操作参照第3步进行。</li>
	<li>PDX模型肿瘤的保存与冷冻保存操作参照第4步进行。</li>
	<li>肿瘤组织复苏时遵循“慢冻快融”原则。从液氮中取出冻存管后，迅速放入37 °C水浴中快速融化。</li>
	<li>轻轻摇动冻存管以加速水浴中的解冻过程。</li>
	<li>解冻后，将肿瘤组织转移至预先准备好的生理盐水中清洗，随后接种至下一代小鼠。具体操作请参见第3步中的组织移植流程。</li>
</ol>
6. 在未分化甲状腺癌PDX模型中确定仑伐替尼与顺铂的治疗疗效
注意：ATC PDX 模型用于测试酪氨酸激酶抑制剂仑伐替尼和化疗药物顺铂的治疗效果25,26,27。
<ol>
	<li>选取ATC患者来源的异种移植模型（THY-017）第5代肿瘤组织，切成2-4 mm3的组织块，并于10只4-6周龄雌性Balb/c裸鼠的右背部皮下接种（步骤3）。</li>
	<li>选择15只肿瘤体积在50-150 mm3之间的小鼠，随机分为三组。</li>
	<li>一组小鼠每日一次经口给予乐伐替尼（10 mg/kg），连续给药15天；另一组小鼠每3天一次腹腔注射顺铂（3 mg/kg），共给药六次；对照组小鼠给予等体积的生理盐水。</li>
	<li>每周两次测量小鼠的体重和肿瘤体积。</li>
	<li>实验结束时，处死小鼠（步骤5.3），并称量肿瘤重量。</li>
</ol>

未披露任何潜在的利益冲突。

本研究成功建立了甲状腺未分化癌（ATC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的皮下PDX模型。在构建PDX模型的过程中，有许多方面需要特别注意。当肿瘤组织从患者体内分离后，应立即放入冰盒中，并尽快送至实验室进行接种。肿瘤组织到达实验室后，操作人员必须注意维持无菌环境，并严格执行无菌操作。对于穿刺活检样本，由于肿瘤组织体积较小，将其与基质胶混合后再接种将更有利于模型的建立。原发性肿瘤组织也应尽可能保存、固定并冷冻，以供后续研究使用。接种过程中，在将肿瘤组织块装入套管针后、使用前，应尽可能排出套管针内的空气。肿瘤接种后，需在小鼠体内观察肿瘤生长情况，持续1至4个月；接种后超过6个月仍无肿瘤生长的小鼠可实施安乐死29。
免疫缺陷小鼠通常被选作PDX模型构建的宿主29,30从P0代到P2代，通常使用非肥胖型糖尿病-重度联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠或NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小...

PDX 模型是一种将人类肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，并在小鼠提供的环境中生长的动物模型1传统的肿瘤细胞系模型存在多种缺陷，例如缺乏异质性、无法维持肿瘤微环境、在长期传代过程中易发生遗传变异 体外 传代次数，以及临床应用效果不佳2,3基因工程动物模型的主要缺点包括可能导致人类肿瘤基因组特征的丢失、引入新的未知突变，以及难以确定小鼠肿瘤与人类肿瘤之间的同源程度4此外，制备基因工程动物模型成本高昂、耗时较长，且效率相对较低4.
相较于其他肿瘤模型，PDX模型在反映肿瘤异质性方面具有诸多优势。从组织病理学角度来看，尽管随着时间推移，小鼠宿主会逐渐替代人类来源的间质成分，但PDX模型仍能很好地保留原发肿瘤的形态结构。此外，PDX模型至少在连续传代四代内保持了原发肿瘤的代谢组学特征，并能更好地模拟肿瘤细胞与其微环境之间复杂的相互关系，因而在模拟人类肿瘤组织的生长、转移、血管生成及免疫抑制等方面具有独特优势5,6,7。在细胞与分子水平上，PDX模型能够准确反映人类肿瘤的瘤间和瘤内异质性，以及原始肿瘤的表型和分子特征，包括基因表达模式、突变状态、拷贝数变异、DNA甲基化及蛋白质组学特征8,9。不同传代次数的PDX模型对药物治疗的敏感性保持一致，表明其基因表达具有高度稳定性10,11。研究表明，PDX模型对药物的反应与患者临床用药反应之间存在良好的相关性12,13。因此，PDX模型已成为一种强大的临床前及转化研究模型，尤其适用于药物筛选和临床预后预测。
甲状腺癌是内分泌系统常见的恶性肿瘤，近年来其发病率在人类恶性肿瘤中迅速上升14。未分化型甲状腺癌（ATC）是恶性程度最高的甲状腺癌类型，患者中位生存期仅为4.8个月15。尽管每年在中国仅有少数甲状腺癌患者被诊断为ATC，但其死亡率接近100%16,17,18。ATC通常生长迅速，侵犯颈部邻近组织及颈淋巴结，约半数患者出现远处转移19,20。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见癌症，也是导致癌症死亡的主要原因之一，每年约有60万人罹患HNSCC21,22,23。HNSCC包含多种肿瘤，发生部位包括鼻腔、鼻窦、口腔、扁桃体、咽部和喉部24。ATC和HNSCC是头颈部主要的两种恶性肿瘤。为了促进新型治疗药物和个体化治疗方案的开发，有必要建立稳定且先进的临床前动物模型，例如ATC和HNSCC的PDX模型。
本文介绍了建立甲状腺未分化癌（ATC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）皮下PDX模型的详细方法，分析了模型构建过程中影响肿瘤成瘤率的关键因素，并比较了PDX模型与原发肿瘤之间的组织病理学特征。同时，在本研究中， 体内 使用成功构建的PDX模型进行药效动力学测试，以验证其临床相关性。

<table><tbody><tr><td>2.4 mm × 2.0 mm 套管针</td><td>深圳华阳生物技术有限公司</td><td>18-9065</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c 裸鼠</td><td>北京维通利华实验动物技术有限公司</td><td>401</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>苏州安泰</td><td>BSC-1300IIA2</td><td></td></tr><tr><td>刀片</td><td>深圳华阳生物技术有限公司</td><td>18-0823</td><td></td></tr><tr><td>离心管&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430791/430829</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>成都典瑞实验仪器有限公司</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK 溶液</td><td>Custodiol</td><td>2103417</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>D5879-500mL</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>METTLER</td><td>ME104</td><td></td></tr><tr><td>电子数显卡尺</td><td>成都成量工具有限公司</td><td>0-220</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics 26</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>江苏中牧倍康药业有限公司&amp;nbsp;</td><td>100761663</td><td></td></tr><tr><td>仑伐替尼</td><td>ApexBio</td><td>A2174</td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID 免疫缺陷小鼠</td><td>北京维通利华实验动物技术有限公司</td><td>406</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep Solution）</td><td>Biological Industries</td><td>03-03101BCS</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>WHB</td><td>WHB-60/WHB-100</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水&amp;nbsp;</td><td>四川科伦</td><td>W220051705</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>深圳华阳生物技术有限公司</td><td>18-0110</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>深圳华阳生物技术有限公司</td><td>18-1241</td><td></td></tr><tr><td>兽用软膏</td><td>辉瑞公司</td><td>P10015353</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>敦化市盛达动物药品有限公司</td><td>070031777</td><td></td></tr></tbody></table>

建立并表征间变性甲状腺癌和头颈部鳞状细胞癌的患者来源异种移植模型

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

患者来源的异种移植（PDX）模型能够高度保留原发肿瘤的组织学和遗传学特征，并维持其异质性。基于PDX模型获得的药效动力学结果与临床实践具有高度相关性。未分化甲状腺癌（ATC）是甲状腺癌中恶性程度最高的亚型，具有侵袭性强、预后差和治疗手段有限的特点。尽管ATC的发病率仅占甲状腺癌的2%–5%，但其死亡率高达15%–50%。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新增病例超过60万例。本文提供了建立ATC和HNSCC的PDX模型的详细实验方案。研究分析了影响模型构建成功率的关键因素，并比较了PDX模型与原发肿瘤之间的组织病理学特征。此外，通过评估模型的 体内 成功构建的PDX模型中代表性临床用药的治疗效果

共移植了18例甲状腺癌标本，成功构建了5个甲状腺癌患者来源的异种移植（PDX）模型（成瘤率为27.8%），其中包括4例未分化型甲状腺癌和1例间变性甲状腺癌。分析了模型构建成功率与患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分级及分化程度之间的相关性。尽管4级肿瘤样本的建模成功率高于低分级样本，且未分化肿瘤样本的建模成功率也高于高分化样本，但相关性分析结果显示，这些因素与PDX模型的构建成功率无显著关联（表1）。此外，接种了17例头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）样本，成功建立了4个HNSCC的PDX模型。对模型成瘤率与肿瘤样本临床参数的相关性分析表明，肿瘤分化程度与模型构建成功率相关，而年龄、性别、吸烟史、肿瘤直径、癌症分级、转移情况以及HPV感染状态对成瘤率无显著影响（表2）。
每个PDX模型的肿瘤生长曲线被绘制出来，以更好地理解来自不同患者的PDX模型的生长速率（图1、图2 和 表3</stro...

本方案建立并表征了间变性甲状腺癌（ATC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的患者来源异种移植（PDX）模型，因为PDX模型正迅速成为转化肿瘤学领域的标准模型。

患者来源的异种移植（PDX）模型能够真实保留原发肿瘤的组织学和遗传特征，并维持其……

本方案有助于建立更能反映肿瘤异质性、分子多样性并预测临床结果的甲状腺未分化癌（ATC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者来源的异种移植（PDX）模型。该技术操作简便，成功率高，也可适用于其他PDX模型的构建。该技术可进一步拓展用于抗癌药物敏感性筛选，以指导癌症患者的个体化治疗。从未操作过该技术的人员可能会遇到一些困难，因此建议仔细关注方案中的每一个细节。在获取甲状腺癌（ATC）和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）肿瘤样本后，将其置于含有无菌HTK溶液的50毫米离心管中，并用75%酒精进行消毒。使用无菌眼科镊子将肿瘤组织转移至盛有生理盐水的6厘米培养皿中，并用刀片将其切成小块。然后，将组织块转移至一个新的含有生理盐水的6厘米培养皿中，并用封口膜包裹。将包好的培养皿放入冰盒中，连同剪刀、镊子和接种针一起带入无病原体动物房。麻醉小鼠后，去除右侧胸侧的毛发，并用75%酒精对该区域进行消毒。使用剪刀在右侧胸侧壁中部做一个两毫米的切口。用镊子从培养皿中取出组织，并将其放入套管针中。固定小鼠，并在穿刺部位绷紧皮肤。将带有肿瘤组织的套管插入切口至皮下间隙，然后移动至肩部后方并推出套管芯。用无菌纱布保留剩余组织，去除肿瘤表面的生理盐水，确保组织不过于湿润。取4到6块组织放入2毫升细胞冻存管中，并向管内加入1毫升冻存液。然后，将试管放入梯度降温盒中，在零下80摄氏度条件下冷冻过夜。最后，转移至液氮中保存。复苏PDX模型肿瘤时，使用游标卡尺每周测量一次皮下肿瘤的长度和宽度。计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。然后用剪刀剪开已处死小鼠肿瘤周围的皮肤，用镊子取出肿瘤并置于培养皿中。按照先前已证实的方法，将肿瘤移植至第五代小鼠。选取第五代（P5）未分化甲状腺癌（ATC）患者来源的肿瘤异种移植（PDX）模型小鼠的肿瘤组织，将其切成2至4立方毫米大小的组织块。将这些组织块皮下接种至裸体雌性BALB/c小鼠右背部，接种方法如前所述。当肿瘤生长至50至150立方毫米时，将小鼠分为三组。每周两次分别给予乐伐替尼、顺铂及对照处理后，测量小鼠的体重。同时测量肿瘤体积。相关性分析显示，ATC患者来源的异种移植模型（PDX）构建成功率与年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤分级及分化程度无关。头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）PDX模型构建的成瘤率表明，分化程度与模型构建成功率相关，而其他参数对成瘤率无显著影响。每个PDX模型的肿瘤生长曲线显示，ATC样本稳定传代至P3代，而两例HNSCC样本在传至P1代后未能形成肿瘤。大多数PDX模型P0代的肿瘤生长速度相对较慢，可能与小鼠微环境的适应过程有关。组织病理学检查表明，PDX肿瘤保留了原发肿瘤的形态学特征。与对照组相比，使用乐伐替尼治疗显著抑制了未分化甲状腺癌PDX模型中的肿瘤生长，并表现出更低的肿瘤重量。此外，接受乐伐替尼治疗的小鼠总体体重未出现明显变化。顺铂剂量过高会导致显著的毒性反应，表现为体重下降甚至死亡。新鲜肿瘤必须用生理盐水反复清洗数次，然后切成小块。将活检获得的肿瘤组织混合后接种，可能导致肿瘤形成。该模型可用于肿瘤生物学研究、药物筛选和个体化治疗。

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癌症研究

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使用立体定位仪建立脑肿瘤患者来源异种移植原位模型

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高通量解离与原位移植乳腺癌患者来源的异种移植瘤

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