Name: 微血管碎片血管化产热脂肪组织的三维培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学习利用微血管片段构建三维血管化产热脂肪组织的方法。该技术通过单一细胞来源实现脂肪组织血管化，为肥胖及代谢疾病研究提供新途径。

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Acosta 博士获得美国国立卫生研究院资助 CA148724 和 TL1TR002647 的支持。Gonzalez Porras 博士获得美国国立卫生研究院下属国家糖尿病与消化及肾脏疾病研究所资助，资助编号为 F32-0DK122754。本研究部分得到美国国立卫生研究院（5SC1DK122578）以及德克萨斯大学圣安东尼奥分校生物医学工程系的支持。本内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。部分图片使用 Biorender.com 制作。

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作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

棕色/米色脂肪组织工程领域目前尚处于不成熟阶段22,23,24,25,26,27,28，大多数脂肪组织模型均针对白色脂肪组织开发8,22,31。工程化的棕色/米色微组织通常需要多种细胞来源或基因改造，以获得天然棕色脂肪组织的部分表型特征8,11,<sup ...

本实验方案的目的是描述一种从单一且可能为自体来源的微血管片段（MVF）构建具有血管化的米色脂肪组织的方法。已有研究表明，棕色和米色脂肪组织在代谢调控方面具有有益作用；然而，成人体内这些脂肪组织库的体积较小，限制了其对全身代谢的影响，尤其是在肥胖或2型糖尿病等疾病状态下1,2,3,4,5,6,7。棕色/米色脂肪作为治疗靶点，对于预防与肥胖及其共病相关的有害代谢效应具有重要意义，正受到广泛关注8,9,10,11,12。
微血管片段（MVFs）是从脂肪组织中直接分离、培养并以三维构型长期维持的血管结构13,14,15。我们课题组及其他研究团队此前已开始利用MVFs的多细胞性和多向分化潜能，特别是在脂肪组织形成方面的应用16,17,18。在此基础上，我们近期证明，来源于健康及2型糖尿病啮齿类模型19以及高龄（50岁以上）人类受试者20的MVFs中，含有可被诱导形成产热型（即米色）脂肪组织的细胞。
本文介绍了一种创新方法，利用单一来源的多能血管基质细胞（MVF），不仅能够生成米色脂肪组织，还能同时形成其相关且关键的血管组分21。该技术的应用对于寻求简便组织工程策略以生成产热性脂肪组织的研究具有重要价值。与其他致力于构建米色脂肪组织的方法22,23,24,25,26,27,28不同，本研究所描述的方法无需使用多种细胞类型或复杂的诱导方案。可利用来源于啮齿类动物和人类的MVF构建带血管化的米色脂肪和白色脂肪模型，展现出良好的转化潜力。本实验方案的最终产物是一种结构和代谢功能与棕色脂肪组织相当的工程化米色产热脂肪组织。总体而言，本方案提出了一种易于获取且可能实现自体移植的MVF来源，或可成为研究代谢性疾病的一种有价值的治疗干预手段和研究工具。

<table><tbody><tr><td>氨基己酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>在DMEM中以1 mg/mL的浓度添加</td></tr><tr><td>钝头剪刀</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-172</td><td>高压灭菌器中灭菌</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Millipore</td><td>126575-10GM</td><td>在 PBS 中稀释至 4 mg/mL 和 1 mg/mL</td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9633623</td><td>用含4 mg/mL BSA的溶液稀释至6 mg/mL，用于消化切碎的脂肪</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AC230302500</td><td>以乙醇稀释至2 mg/ml的储存浓度</td></tr><tr><td>一次性护理垫</td><td>Fisher scientific</td><td>23-666-062</td><td>手术期间用于液体吸收</td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>Fisher scientific</td><td>08-951-5</td><td>高压灭菌器中灭菌</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;prime;s 改良伊格尔&amp;prime;s 培养基（DMEM）</td><td>Fisher scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;prime;s 改良伊格尔&amp;prime;DMEM/F12 培养基（Ham's F-12 营养混合物）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>16140089</td><td>在DMEM中添加至20%（v/v）。</td></tr><tr><td>纤维蛋白原&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-25G</td><td>在 DMEM 中以 20 mg/mL 浓度溶解，存在于血浆中的蛋白质，水凝胶的主要成分</td></tr><tr><td>250 mL 锥形瓶</td><td>Fisher scientific</td><td>FB500250</td><td>利用较大的表面积实现脂肪的消化</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher scientific</td><td>50-264-21</td><td>高压灭菌，用于组织和滤膜的处理</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>以乙醇稀释至10 mM的储存浓度</td></tr><tr><td>人源MVF</td><td>Advanced Solutions Life Sciences, LLC</td><td>https://www.advancedsolutions.com/microvessels</td><td>本研究使用了从三位不同患者（52岁、54岁和56岁女性）分离的人源微血管片段（hMVFs）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吲哚美辛&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>以乙醇稀释至12.5 mM的储备浓度</td></tr><tr><td>猪胰岛素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5523</td><td>用 0.01 N HCl 稀释至 5 mg/ml 的储备浓度</td></tr><tr><td>MycoZap</td><td>Fisher scientific</td><td>NC9023832</td><td>添加至DMEM中至0.2% w/v，支原体预防剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Fisher scientific</td><td>15140122</td><td>在DMEM中添加至1% v/v。</td></tr><tr><td>培养皿，聚苯乙烯（100 mm × 15 mm）</td><td>Fisher scientific</td><td>351029</td><td>3 用于去除血管和剪碎组织，8（盖）用于筛网预浸泡 &amp;amp; 8（培养皿），用于500或37过滤时 &amp;micro;M 筛选</td></tr><tr><td>培养皿，聚苯乙烯（35 mm × 10 mm）</td><td>Fisher scientific</td><td>50-202-036</td><td>用于计数微血管片段</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher scientific</td><td>14-190-250</td><td>用无菌去离子水稀释至1倍浓度。</td></tr><tr><td>大鼠剪毛器（Andwin Mini Arco 宠物修剪器）</td><td>Fisher scientific</td><td>NC0854141</td><td></td></tr><tr><td>罗格列酮</td><td>Fisher scientific</td><td>R0106200MG</td><td>用DMSO稀释至10 mM的储备浓度</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>1 把用于初始切口，1 把用于附睾切口，1 把用于尖端剪切</td></tr><tr><td>屏幕&amp;nbsp; 37 &amp;micro;M&amp;nbsp;</td><td>卡罗来纳生物供应公司</td><td>652222R</td><td>切成3段&quot; 圆形方块，经环氧乙烷灭菌，用于微血管片段的截留及去除极小片段、单细胞和碎片</td></tr><tr><td>筛选 500 &amp;micro;M&amp;nbsp;</td><td>卡罗来纳生物供应公司</td><td>652222F</td><td>切成3段&quot; 圆形方块，经环氧乙烷灭菌，去除较大碎片/碎屑</td></tr><tr><td>锯齿止血钳</td><td>Fisher scientific</td><td>12-000-171</td><td>在高压灭菌器中灭菌，用于切口前夹紧皮肤</td></tr><tr><td>Steriflip 滤器 0.22 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Fisher scientific</td><td>6051601KU</td><td>用去离子水稀释至 10 U/mL，用作凝血剂，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白</td></tr><tr><td>甲状腺激素（T3）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2877</td><td>用1N NaOH稀释至0.02 mM的储备浓度</td></tr><tr><td>Zucker 糖尿病肥胖（ZDF）大鼠——肥胖型（FA/FA）或瘦型（FA/+）雄性&amp;nbsp;</td><td>查尔斯河</td><td>https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611&lt;br/&gt; https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611</td><td>购自查尔斯河实验室（Wilmington, MA）。大鼠在4周龄时获取，并饲喂Purina 5008饲料至安乐死（15–19周龄）。本研究中使用的所有FA/FA大鼠的葡萄糖水平（取自外侧隐静脉的血液）均高于300 mg/dL。所有动物均饲养于温度受控的环境中，采用12小时光照-黑暗循环，自由进食。</td></tr></tbody></table>

由微血管片段构建血管化产热脂肪组织的三维培养

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

产热型脂肪组织（例如米色或棕色脂肪组织）的构建已被研究作为代谢性疾病的一种潜在疗法，或用于设计个性化的微组织以进行健康筛查和药物测试。目前的策略通常较为复杂，且难以准确、全面地再现产热型脂肪组织的多细胞结构和功能特性。微血管片段是从脂肪组织中分离出的微小完整微血管，包含小动脉、小静脉和毛细血管，可作为自体细胞的单一来源，支持血管化及脂肪组织的形成。本文介绍了优化培养条件的方法，以实现从微血管片段生成三维、具有血管化且功能性的产热型脂肪组织，包括从脂肪组织中分离微血管片段的方案以及相应的培养条件。此外，还讨论了最佳操作实践、工程化组织的表征技术，并提供了来自啮齿类动物和人类微血管片段的示例结果。该方法有望用于促进对肥胖症和代谢性疾病的理解及其治疗手段的开发。

米色/棕色脂肪组织具有几个关键的表型形态学特征：其为多房性/含有较小的脂滴，含有大量线粒体（因此呈现特征性的“棕褐色”外观） 体内），相应地具有较高的耗氧率/线粒体生物能量活性，高度血管化，脂解作用增强且胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加，最显著的特征是高表达解偶联蛋白1（UCP1），这是一种参与产热性呼吸的线粒体蛋白19,30.
因此，在表征 MVF 分化为米色脂肪组织的能力时，我们进行了一系列分析，以可视化 MVF 的转化过程（图 7、图 8），从基因水平上加以确认（图 9、图 10），并进行功能性测定（图 11）。
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本文介绍了一种详细方案，阐述如何利用从啮齿类动物或人类脂肪组织中分离出的微血管片段，作为一种简便的方法来构建具有功能性的血管化米色脂肪组织。

工程化产热型脂肪组织（如米色或棕色脂肪组织）已被研究作为治疗代谢性疾病或……的一种潜在疗法

本方案描述了利用微血管片段（MVF）生成三维血管化且具有功能性的产热脂肪组织的方法。目前用于构建产热型脂肪组织的策略较为复杂，且无法充分再现其多细胞组成和功能特性。MVF是一种单细胞来源，能够同时支持血管生成和脂肪组织的形成。作为一种简单的单源性方法，微血管片段（MVFs）在创建米色脂肪的生物学模拟物方面具有重要意义，有望促进人们对肥胖症和代谢性疾病的理解或治疗手段的开发。将经过适当剃毛并使用70%乙醇处理后处死的动物置于仰卧位，开始分离腹股沟脂肪。用剪刀提起阴茎下方的皮肤，从中央开始向两侧做切口，形成V形，随后环绕至动物背部，以充分暴露整个脂肪组织。切割时，需切断连接皮肤与脂肪的筋膜组织，确保皮肤与脂肪分离。筋膜适当切开后，应使来自两侧腹股沟的脂肪组织（从腹股沟向背部延伸）清晰可见。随后，将两侧脂肪组织分别移入含有10毫升PBS缓冲液的圆锥管中，PBS中牛血清白蛋白（BSA）浓度为1毫克/毫升。为获取附睾脂肪，先剪开腹部皮肤，随后小心剪开包裹睾丸的薄层组织。用镊子轻轻拉出脂肪组织，并用剪刀将其剪下，注意避免解剖到任何明显可见的主要血管。随后，将取出的脂肪组织放入一个50毫升的锥形管中，管内含有10毫升含1毫克/毫升BSA的PBS溶液。为分离后部皮下脂肪，将大鼠腹侧向下放置，使用大剪刀从背部一直剪至头皮处的厚皮肤，注意不要剪得太深而伤及皮下组织。剪开皮肤与组织相连的筋膜。在分离之前，区分位于肩胛骨间的皮下脂肪与靠近脊柱的棕色脂肪，并将皮下脂肪置于含有10毫升PBS缓冲液（其中含1毫克/毫升BSA）的50毫升锥形管中。在生物安全柜内操作时，使用镊子将切除的脂肪组织放入一个标准的100毫升培养皿中，培养皿内含有0.5毫升浓度为1毫克/毫升的PBS配制BSA溶液。去除脂肪组织上可见的血管、肌肉或其他多余组织。使用剪刀剪切脂肪组织约10分钟，并通过加入少量BSA检查是否存在团块。如有必要，继续切碎，然后用10毫升移液管将切碎的脂肪悬液转移至无菌的250毫升烧瓶中。加入含BSA的PBS缓冲液，使烧瓶内液体总体积达到20毫升。随后将含BSA的PBS缓冲液加入胶原酶中，并轻轻振荡混匀，再通过0.22微米尼龙网滤器进行无菌过滤。立即向剪碎的脂肪悬液中加入所需量的胶原酶溶液，并在37摄氏度水浴中以环形振荡方式振荡适当时间以消化脂肪。将消化后的脂肪转移至已标记为“消化脂肪”或“剪碎脂肪”的50毫升锥形管中。以400 ×g离心4分钟，使微血管片段（MVFs）沉淀形成红色沉淀物。轻轻将上清液倒入已标记为废弃物的50毫升锥形管中，注意不要扰动沉淀。接着，向含有沉淀的管中加入10毫升含1毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS），通过轻柔地上下吹打两次使沉淀重悬，避免破坏组织碎片。然后，取预先浸泡在无菌培养皿（内含5毫升含1毫克/毫升BSA的PBS）中的500微米筛网，将其置于放置于新培养皿上的塑料筛网架上。用移液器将10毫升悬浮液从消化后的沉淀管中以同心圆方式滴加到筛网上。用额外的5毫升含1毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗滤膜，随后弃去滤膜，保留培养皿内的滤液。然后将预先浸泡过的37微米筛网置于新培养皿上的塑料筛网支架上方。使用新的移液管，将第一次过滤所得的滤液以同心圆方式转移至筛网上。如前所述，用含BSA的PBS洗涤筛网，此次弃去滤液，保留37微米筛网。将37微米筛网转移至一个新的培养皿中，该培养皿内含有5毫升浓度为1毫克/毫升的BSA PBS溶液。轻轻敲击培养皿底部，使其在锥形支架上松动碎片，注意不要洒出任何液体。用额外的5毫升PBS中的BSA冲洗滤膜。接着，将培养皿中的液体转移至无菌的50毫升锥形管中。用剪刀剪去20微升移液器吸头的末端。再用37微米筛网冲洗数次，将洗涤液加入锥形管中，直至收集的总体积达到15至20毫升。最后一次冲洗后丢弃筛网。使用剪去尖端的移液枪头吸取两份20微升的液体前，轻轻震荡含有液体的离心管，将每份样品分别加入洁净的35毫米培养皿中。使用标准光学显微镜计数每个培养皿样品中的片段数量，并根据文中所述公式计算获得分离得到的微血管片段总数。将50毫升锥形管中剩余液体在400 × g条件下离心4分钟，以收集微血管片段（MVF）。离心后，从锥形管中倾倒掉大部分上清液，并用移液器移除管口边缘残留的少量液体。接下来，将凝血酶加入指定用于制备凝胶的孔中。剪去一个200微升移液器吸头的末端，用其轻轻重悬纤维蛋白原中的微血管片段（MVF），以获得所需的最终密度。用移液器将悬浮液加入孔中的凝血酶溶液中，并通过上下吹打迅速混匀。所有凝胶注模完成后，立即将孔板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育约15分钟，以使凝胶发生交联。使用BODIPY作为脂质染料，通过共聚焦显微镜观察水凝胶中的脂质和已分化的脂肪细胞。使用白色脂肪生成培养基或米色脂肪生成培养基培养无血管化的脂肪组织，可分别由瘦型及糖尿病啮齿类动物来源的MVFs形成无血管化的白色或米色脂肪组织。类似地，使用白色脂肪生成培养基或米色脂肪生成培养基培养有血管化的脂肪组织，也可分别由啮齿类动物来源的MVFs形成有血管化的白色或米色脂肪组织。通过共聚焦显微镜也观察到由人源MVFs获得的无血管化白色和米色脂肪组织。通过RT-qPCR从基因水平证实了MVF分化为米色脂肪组织的能力。将瘦型和糖尿病啮齿类动物的MVF暴露于直接的白色脂肪生成培养基或米色脂肪生成培养基中，评估其脂肪生成、产热和血管生成能力。与预期一致，解偶联蛋白1在米色脂肪生成组织中的表达显著升高。在暴露于间接白色脂肪生成或米色脂肪生成培养基的啮齿类动物MVFs中，以及在暴露于直接白色脂肪生成或米色脂肪生成培养基的人源MVFs中，也观察到类似的趋势。最后，从线粒体生物能量学分析可见，在所有情况下，米色脂肪组织在功能上均表现出特征性的较高氧消耗率（OCR）水平。脂肪组织的酶消化步骤应进行优化，以稳定地获得大小和质量相似的MVFs。消化后，应轻柔处理微血管片段（MVF），特别注意避免进一步破碎组织片段。该技术有助于进一步平衡血管生成与脂肪细胞分化，已证实此平衡依赖于所引入的因子。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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