Name: 流式细胞术 检测 接种乙型脑炎疫苗的儿童多功能T细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 了解如何使用流式细胞术分析接种乙型脑炎疫苗儿童的多功能T细胞反应。本方案通过体外刺激PBMCs结合多色流式技术，评估CD4+和CD8+T细胞的免疫应答特征，为疫苗免疫效果研究提供可靠方法。

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R.W. 受到国家自然科学基金（82002130）和北京市自然科学基金的资助&#160;中国（7222059）。ZD.X. 获得了中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2019-I2M-5-026）的支持。

本研究获得了首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会的伦理批准（批准号：2020-k-85）。志愿者招募自首都医科大学附属北京儿童医院。外周静脉血样本采集自临床表现健康的儿童：一组为接种过减毒活乙型脑炎SA14-14-2疫苗且加强免疫不足半年的儿童（乙脑疫苗接种组，2岁，n = 5）；另一组为未接种疫苗的儿童（6个月大，n = 5）。由于本研究仅使用临床检测后剩余的样本，因此豁免了受试者的知情同意。为保护志愿者隐私，所有数据均进行了完全匿名化和去标识化处理。
1. 从外周静脉血中分离外周血单个核细胞
<ol>
	<li>采用标准静脉穿刺技术，从接种过乙型脑炎疫苗和未接种疫苗的儿童中采集外周静脉血样本（2 mL），置于含EDTA-K2抗凝剂的采血管中（参见材料表）18。</li>
	<li>加入2 mL磷酸盐缓冲液（1× PBS）稀释外周血。 
	注意：应尽快操作，以最大限度保持细胞存活率。</li>
	<li>向15 mL离心管中加入4 mL密度梯度介质（参见材料表），然后缓慢将稀释后的血液加至分离介质的上层。 
	注意：切勿使血液与分离介质混合，或破坏两种液体之间形成的界面，否则将影响分离效果。</li>
	<li>在室温下以800 × g 离心20分钟，离心后观察明显的分层现象。</li>
	<li>将外周血单个核细胞（PBMCs，中间层）转移至另一支15 mL离心管中，用含10%胎牛血清（FBS，参见材料表）的10 mL RPMI-1640培养基洗涤PBMCs。</li>
	<li>在室温下以800 × g 离心10分钟，小心用移液器弃去上清液。</li>
	<li>用含10% FBS的1 mL RPMI-1640培养基重悬PBMCs，并使用基于台盼蓝染色的自动细胞计数仪进行细胞计数（参见材料表）。</li>
</ol>
2. 利用灭活的日本脑炎病毒颗粒刺激外周血单个核细胞以诱导细胞因子表达
<ol>
	<li>分别在接种过和未接种日本脑炎疫苗的样本中，设置JEV刺激组和对照组的两个亚组。</li>
	<li>用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基将PBMCs细胞数量调整至2 × 106 个细胞/mL，并接种于24孔板中（每孔1 mL培养基含2 × 106 个细胞）；每组接种三个孔。</li>
	<li>在37 °C条件下，使用浓缩的灭活JEV颗粒5（2 × 105 PFU）刺激JEV刺激组的PBMCs细胞16小时，同时加入单克隆抗体CD28（1 µg/mL，1:1,000）和CD49d（1 µg/mL，1:1,000）、GolgiPlug（1 µg/mL，1:1,000）以及莫能菌素（monensin，1 µg/mL，1:1,000）。用于表面染色时，使用BV605-anti-CD107a（1 µg/mL，1:1,000）（见材料表）。 
	注意：JEV通过紫外线照射灭活，方法如前所述19。</li>
	<li>对照组的PBMCs细胞在不含浓缩病毒颗粒的条件下，于37 °C孵育16小时，同时加入单克隆抗体CD28（1 µg/mL，1:1,000）和CD49d（1 µg/mL，1:1,000）、GolgiPlug（1 µg/mL，1:1,000）以及莫能菌素（monensin，1 µg/mL，1:1,000）。使用BV605-anti-CD107a（1 µg/mL，1:1,000）进行表面染色。</li>
</ol>
3. 离体 细胞内染色
<ol>
	<li>将每组的细胞悬液收集至1.5 mL微量离心管中，在室温下以500 × g 离心5分钟，并用移液器吸除上清液。</li>
	<li>用1 mL 1× PBS重悬细胞，向细胞悬液中加入可固定活力染料（1 µL/mL，1:1,000，参见材料表），在室温避光条件下孵育10分钟。在室温下以500 × g 离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用1 mL 1× PBS重悬细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，小心弃去上清液。</li>
	<li>进行细胞表面标志物染色。
	<ol>
		<li>将细胞重悬于100 µL 1× PBS中，向每管细胞悬液中加入各表面标志物抗体2 µL（BV650-抗CD3、BUV395-抗CD4、BV421-抗CD8、BUV737-抗CD27和BV480-抗CD45RO，稀释倍数：1:50，参见材料表）。 
		注：荧光抗体染色方案见表1。</li>
		<li>将试管（步骤3.4.1）在室温避光条件下孵育30分钟，以500 × g 离心5分钟，吸除上清液。 
		注：BUV737-抗CD27和BV480-抗CD45RO抗体可用BUV737-抗CCR7和BV480-抗CD45RA替代，用于记忆T细胞的标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1 mL 1× PBS重悬细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，小心弃去上清液。</li>
	<li>进行固定和破膜处理。
	<ol>
		<li>用500 µL破膜固定液（参见材料表）重悬细胞，在室温避光条件下固定20分钟。以500 × g 离心5分钟，吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1 mL 1× PBS重悬细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，小心吸除上清液。</li>
	<li>进行细胞内细胞因子染色。
	<ol>
		<li>将细胞重悬于100 µL 1× PBS中，向每管细胞悬液中加入各细胞因子抗体2 µL（FITC-抗IFN-γ、PE-抗TNF-α、BV785-抗IL-2和APC-抗MIP-1α，稀释倍数：1:50，参见材料表）。 
		注：荧光素偶联抗体的体积和相关信息见表1。</li>
		<li>将试管（步骤3.8.1）在室温避光条件下孵育30分钟，以500 × g 离心5分钟，吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用1 mL 1× PBS重悬细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，小心吸除上清液，加入500 µL 1× PBS重悬细胞。</li>
</ol>
4. 流式细胞术设置
<ol>
	<li>按照步骤1所述方法单独分离PBMC样本作为对照样本。将细胞悬液均分为12份，每份100 µL，分装至1.5 mL微量离心管中，如下所述。
	<ol>
		<li>分别设置未染色样本、APC-Cy7-活死染料可固定染色样本、BV650-抗CD3单染样本、BUV395-抗CD4单染样本、BV421-抗CD8单染样本、BUV737-抗CD27单染样本、BV480-抗CD45RO染色样本、BV605-抗CD107a染色样本、FITC-抗IFN-γ染色样本、PE-抗TNF-α单染样本、BV785-抗IL-2单染样本以及APC-抗MIP-1α单染样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤3所述方法进行细胞表面标志物和细胞内细胞因子染色。对于每个单染样本，仅加入染色步骤中的一种荧光染料。加入500 µL 1x PBS重悬细胞，并以低速涡旋振荡混匀。</li>
	<li>使用未染色样本调节前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）以及不同荧光染料的电压。 
	注：本研究中设置的电压如下：FSC：440 V，SSC：233 V，BV650：575 V，APC-Cy7：449 V，BUV395：500 V，BV421：402 V，BUV737：585 V，BV480：444 V，BV605：457 V，FITC：475 V，PE：469 V，APC：623 V，BV785：725 V。</li>
	<li>使用各单染样本调节流式细胞术补偿，以消除不同荧光染料之间的信号串扰。 
	&#8203;注：补偿参数见表2。</li>
</ol>
5. 门控策略与数据分析
注意：在本研究中，用于此分析的中央记忆T细胞（CD8+或CD4+ T细胞中的TCM）定义为CD27+CD45RO+或CCR7+CD45RA-，效应记忆T细胞（CD8+或CD4+ T细胞中的TEM）定义为CD27-CD45RO+或CCR7-CD45RA-16。
<ol>
	<li>在FSC-面积（FSC-A）/SSC-面积（SSC-A）散点图上绘制多边形门，以选择完整的淋巴细胞群体，同时排除碎片（图1A）。</li>
	<li>在FSC-A/FSC-宽度（FSC-W）散点图上绘制矩形门，以选择单个细胞（图1B）。</li>
	<li>在活/死细胞/SSC-A散点图上绘制矩形门，以选择活细胞（图1C）。</li>
	<li>在CD3/SSC-A散点图上绘制矩形门，以鉴定CD3+ T细胞（图1D）。</li>
	<li>在CD4/CD8散点图上绘制四象限门，以鉴定CD4+或CD8+ T细胞（图1E）。</li>
	<li>在CD45RO/CD27散点图上绘制四象限门，将CD4+或CD8+ T细胞进一步划分为TCM（CD27+ CD45RO+）和TEM（CD27- CD45RO+）（图1F-I）。</li>
	<li>从CD8+或CD4+ T细胞的TCM或TEM群体中，分别绘制CD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2和MIP-1α的门，以确定不同反应模式的频率。</li>
	<li>依次将样本上机进行流式细胞术检测。使用停止门20采集1 × 106个淋巴细胞。 
	注意：用户可根据需要采集超过1 × 106个细胞。该数量是在采集时间与获得足够细胞以确保结果具有统计学意义之间的一种权衡。</li>
</ol>

<ol><li>Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+encephalitis+virus+interaction+with+mosquitoes%3A+A+review+of+vector+competence%2C+vector+capacity+and+mosquito+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity.</a> Pathogens. 11 (3), 317(2022).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+and+disease+burden+of+children+hospitalized+for+viral+infections+within+the+family+Flaviviridae+in+China%3A+A+national+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562(2022).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreases+in+both+the+seroprevalence+of+serum+antibodies+and+seroprotection+against+Japanese+encephalitis+virus+among+vaccinated+children%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children.</a> Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+rather+than+cellular+immune+response+is+maintained+for+nearly+20+years+among+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccinees+in+an+endemic+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476(2020).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+immunity+rather+than+antibody+mediates+cross-protection+against+Zika+virus+infection+conferred+by+a+live+attenuated+Japanese+encephalitis+SA14-14-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).</li>
<li>Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+encephalitis+virus+persistence+in+porcine+tonsils+is+associated+with+a+weak+induction+of+the+innate+immune+response%2C+an+absence+of+IFNgamma+mRNA+expression%2C+and+a+decreased+frequency+of+CD4%28%2B%29CD8%28%2B%29+double-positive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888(2022).</li>
<li>Jain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cells+protect+adult+naive+mice+from+JEV-induced+morbidity+via+lytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329(2017).</li>
<li>Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+antibody+and+polyfunctional+T+cells+generated+by+respiratory+immunization+with+protective+Burkholderia+DeltatonB+Deltahcp1+live+attenuated+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 72(2021).</li>
<li>Weaver, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+IFNgamma%28-%29IL-2%28%2B%29+cells+in+recent+human+CD4+T+cell+responses+to+2009+pandemic+H1N1+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza.</a> PloS One. 8 (-), 57275(2013).</li>
<li>Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+HIV-1+Gag-specific+IFN-gamma%2BIL-2%2B+and+CD28%2BIL-2%2B+CD4+T+cell+responses+is+associated+with+nonprogression+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection.</a> Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).</li>
<li>Gui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2%2C+IL-4%2C+IFN-gamma+or+TNF-alpha+enhances+BAFF-stimulated+cell+viability+and+survival+by+activating+Erk1%2F2+and+S6K1+pathways+in+neoplastic+B-lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells.</a> Cytokine. 84, 37-46 (2016).</li>
<li>Terahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine-induced+CD107a%2B+CD4%2B+T+cells+are+resistant+to+depletion+following+AIDS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).</li>
<li>Tanyi, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+cancer+vaccine+strategy+elicits+polyfunctional+T+cells+and+demonstrates+clinical+benefits+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer.</a> NPJ Vaccines. 6 (1), 36(2021).</li>
<li>Ammirati, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+memory+T+cells+are+associated+with+atherosclerosis+in+humans+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models.</a> Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).</li>
<li>Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunophenotyping+changes+of+peripheral+CD4%2B+T+lymphocytes+and+inflammatory+markers+of+class+III+obesity+subjects+after+laparoscopic+gastric+sleeve+surgery+-+A+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study.</a> Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterizations+of+CD8%28%2B%29+T+cell+populations+in+malignant+pleural+effusion%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion.</a> Experimental Cell Research. 417 (1), 113212(2022).</li>
<li>Shin, H., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident memory T cells.</a> Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).</li>
<li>Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+interventions+for+needle-related+procedural+pain+and+distress+in+children+and+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).</li>
<li>Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-incompetent+virions+of+Japanese+encephalitis+virus+trigger+neuronal+cell+death+by+oxidative+stress+in+a+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system.</a> Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).</li>
<li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+%28cTfh%29+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431(2019).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+and+protective+effects+against+Japanese+encephalitis+induced+by+a+DNA+vaccine+encoding+the+prM%2FE+proteins+of+the+attenuated+SA14-14-2+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain.</a> Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443(2020).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+protection+for+mice+conferred+by+a+DNA+vaccine+based+on+the+Japanese+encephalitis+virus+P3+strain+used+to+prepare+the+inactivated+vaccine+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China.</a> Virology Journal. 17 (1), 126(2020).</li>
<li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+CD4%2B+and+CD8%2B+polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 416(2018).</li>
<li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+regulatory+and+cytotoxic+SARS-CoV-2-reactive+CD4%28%2B%29+T+cells+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19.</a> Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).</li>
<li>Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+carriers+generate+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-specific+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+polyfunctional+T-cell+responses+which+show+immunodominance+hierarchies+of+EBV+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins.</a> Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了一种基于流式细胞术的可行方法，用于检测接种SA14-14-2型日本脑炎疫苗儿童外周血单个核细胞（PBMC）中的TPF谱型。本研究以接种与未接种疫苗儿童的静脉血PBMC为研究材料，在日本脑炎病毒抗原刺激下，通过多色流式细胞术抗体染色对扩增的抗原特异性TPF细胞进行表征。与传统的酶联免疫斑点法相比，流式细胞术的显著优势在于能够在单细胞水平尽可能全面地呈现PBMC的功能特征，同时减少检测所需的PBMC数量，特别适用于儿童样本。
明确的疫苗接种史、维持细胞活力、刺激物的T细胞免疫原性以及兼容的颜色匹配策略是本方案中的关键步骤。中国自2008年起已将乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗纳入国家扩大免疫规划，并将疫苗接种史纳入统一管理，从而实现了疫苗接种信息的可及性3。本方案中检测的外周血单个核细胞（PBMCs）在实验过程中始终保持在冰上，以最大限度维持细胞活力。使用特异性刺激物的有效性此前已有广泛报道4,<sup clas...

日本脑炎病毒（JEV）是一种重要的蚊媒病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）&#160;1。由于日本脑炎（JE）造成的巨大疾病负担，许多亚太国家长期以来面临严峻的公共卫生挑战，但随着多种疫苗的日益普及，这一状况已显著改善2。自然感染或疫苗接种所诱导的适应性保护性免疫反应在预防疾病和抗病毒调控中发挥重要作用。体液免疫和细胞介导的免疫均属于适应性免疫，其中前者诱导一直被视为疫苗设计的关键策略，尽管过去对其理解相对有限3。然而，T细胞介导的免疫在限制黄病毒感染扩散及清除病毒方面的作用正受到越来越多的关注，并被广泛研究4。此外，T细胞免疫不仅在JEV特异性抗病毒反应中不可或缺，还在对异源黄病毒二次感染的交叉保护中发挥重要作用，这一点已在先前的研究中得到证实5。据推测，这种效应可能绕过感染中潜在的抗体依赖性增强作用5。值得注意的是，此类交叉反应性T细胞免疫尤为重要，特别是在缺乏针对黄病毒的疫苗和抗病毒药物的情况下。尽管已有大量研究探讨CD4+和CD8+ T细胞在JEV感染中的作用6,7，但分泌细胞因子的不同T细胞谱系及其功能分化仍不明确，这意味着辅助性T细胞和杀伤性T细胞的确切功能尚未被阐明。
其抗病毒防御的规模决定了T细胞应答的质量。CD4+ 或 CD8+ 能够相容地发挥两种或以上功能（包括细胞因子分泌和脱颗粒）的T细胞被称为多功能T细胞&#160;（TPFs)&#160;在单细胞水平上受到特定刺激后8CD4+ 产生单一或多种细胞因子的T细胞可能具有不同的效应功能和免疫记忆。例如，IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T细胞比IL-2更有可能形成长期有效的保护性反应+ CD4+ T细胞9，可作为评估疫苗接种效果的重要参数。IL-2的频率+ IFN-γ+ CD4+ 艾滋病（AIDS）长期非进展患者的T细胞水平升高，而CD4+ 艾滋病进展期患者的T细胞更倾向于单独产生IFN-γ，这是由于IL-2对T细胞增殖具有促进作用10此外，一部分IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ 被证明可长期存活 体内 并协同促进杀伤功能11尽管CD8+ T细胞更有可能表现出细胞毒性活性，某些CD4+ T细胞也具有细胞毒性活性，这可通过表面CD107a分子的间接检测来反映12此外，某些T细胞亚群表达趋化因子MIP-1α，后者通常由单核细胞分泌，参与T细胞介导的中性粒细胞募集13同样，CD8+ TPF也可用于表征上述标志物的多功能性。研究表明，初免-加强免疫策略可有效诱导T细胞长期持续的反应PF 保护作用13，这可以增强疫苗接种所诱导的保护效果。研究免疫系统的一个核心特征是记忆T细胞相较于初始T细胞能够对再次病毒攻击产生更强、更快且更有效的免疫应答。效应记忆T细胞（T电子显微镜) 和中央记忆T细胞（TCM是重要的T细胞亚群，通常通过CD27/CD45RO或CCR7/CD45RA的共表达模式进行区分14. TCM (CD27+ CD45RO+ 或 CCR7+ CD45RA-）倾向于定位于次级淋巴组织，而T电子显微镜 (CD27- CD45RO+ 或 CCR7- CD45RA-在淋巴组织和外周组织中定位15,16. T电子显微镜 提供即时但非持续的防御，而TCM 在次级淋巴器官中增殖并产生新的效应细胞以维持免疫应答17因此，鉴于记忆细胞能够介导针对病毒的特异而高效的再次应答，关于这一多能性细胞亚群所起作用的问题便随之产生。
随着流式细胞术技术的发展，同时检测超过10种细胞簇、表型及分化抗原标志物已成为常态，这有助于更充分地注释单个T细胞的功能性免疫特征，从而减少对T细胞表型的误读和理解困难。本研究采用离体（ex vivo）刺激结合流式细胞术，分析日本脑炎病毒（JEV）疫苗接种儿童外周血单个核细胞（PBMCs）中的TPF 特征谱。通过该方法，将有助于深入理解疫苗诱导的JEV特异性以及跨反应性T细胞免疫在短期和长期的应答特征。

<table><tbody><tr><td>抗人 CD28</td><td>Biolegend</td><td>302934</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗人 CD49d</td><td>Biolegend</td><td>304339</td><td>抗体</td></tr><tr><td>APC 抗人 MIP-1&amp;alpha;</td><td>BD</td><td>551533</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>BIO RAD</td><td>TC20</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5</td><td>BD</td><td>A5</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>BUV395 抗人 CD4</td><td>BD</td><td>563550</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BUV737 抗人 CCR7</td><td>BD</td><td>741786</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BUV737 抗人 CD27</td><td>BD</td><td>612829</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BV421 抗人 CD8</td><td>Biolegend</td><td>344748</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BV480 抗人 CD45RA</td><td>BD</td><td>566114</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BV480 抗人 CD45RO</td><td>BD</td><td>566143</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BV605 抗人 CD107a</td><td>Biolegend</td><td>328634</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BV650 抗人 CD3</td><td>BD</td><td>563999</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BV785 抗人 IL-2</td><td>Biolegend</td><td>500348</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心管</td><td>BD Falcon</td><td>BD-35209715</td><td>15 mL 离心管</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm 固定/透化溶液试剂盒</td><td>BD</td><td>554714</td><td>细胞固定与透化</td></tr><tr><td>密度梯度介质</td><td>Dakewe</td><td>DKW-KLSH-0100</td><td>Ficoll-Paque，人淋巴细胞分离介质</td></tr><tr><td>FITC 抗人 IFN-&amp;gamma;</td><td>Biolegend</td><td>502506</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco 胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>Gibco RPMI-1640 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22400089</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>高速&amp;nbsp;离心机</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;3K15</td><td>用于 15 mL 离心管的细胞离心</td></tr><tr><td>高速&amp;nbsp;离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>用于 1.5 mL Eppendorf (EP) 管的细胞离心</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL 微量离心管</td></tr><tr><td>PE 抗人 TNF-&amp;alpha;</td><td>Biolegend</td><td>502909</td><td>荧光抗体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>BI</td><td>02-024-1ACS</td><td>PBS</td></tr><tr><td>蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素 A，GolgiPlug）</td><td>BD</td><td>555029</td><td>阻断细胞内蛋白转运过程</td></tr><tr><td>蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）</td><td>BD</td><td>554724</td><td>阻断细胞内蛋白转运过程</td></tr><tr><td>圆底试管</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td>5 mL 试管</td></tr><tr><td>台盼蓝染色细胞活力检测试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>C0011</td><td>台盼蓝染色</td></tr><tr><td>Zombie NIR 可固定活力染料</td><td>Biolegend</td><td>423106</td><td>死细胞染色</td></tr></tbody></table>

检测接种日本脑炎疫苗儿童中的多功能t细胞 通过 流式细胞术

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T细胞介导的免疫在控制黄病毒属病毒感染中发挥重要作用，无论是在接种疫苗后还是自然感染后均如此。评估T细胞的“质量”需以其功能为依据，功能越强，免疫保护作用也越强。在单细胞水平上能够同时产生两种或多种细胞因子或趋化因子的T细胞被称为多功能T细胞（TPFs），这类细胞通过多种分子机制介导免疫反应，表达脱颗粒标志物（CD107a），并分泌干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-2或巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α。越来越多的证据表明，TPFs与长期免疫记忆的维持及免疫保护密切相关，其比例升高是保护性免疫的重要标志，在有效控制病毒感染及再激活过程中具有重要意义。该评估不仅适用于特异性免疫反应，也适用于交叉反应性免疫反应的评估。本文以日本脑炎病毒（JEV）为例，检测了接种日本脑炎疫苗的儿童外周血单个核细胞产生的JEV特异性TPFs的检测方法及流式细胞术染色方案，为类似研究提供参考。

图1展示了用于分析乙型脑炎疫苗接种儿童中代表性JEV刺激组的CD8+或CD4+ T细胞中TCM或TEM亚群的设门策略。使用FSC-A/SSC-A散点图鉴定淋巴细胞，FSC-A/FSC-W散点图用于鉴定单细胞。在活/死细胞/SSC-A散点图上选择活细胞。使用CD3/SSC-A散点图鉴定CD3+ T细胞。通过CD4/CD8散点图分别鉴定CD3+ CD4+和CD3+ CD8+ T细胞。在CD45RO/CD27散点图上分别圈选CD8+或CD4+ T细胞中的TCM（CD27+ CD45RO+）和TEM（CD27- CD45RO+）亚群。通过绘制相应的矩形门，分别圈选来自CD8+ TCM</...

本实验方案结合 离体 刺激与流式细胞术分析多功能T细胞（TPF)&#160;日本乙型脑炎病毒（JEV）疫苗接种儿童外周血单个核细胞（PBMCs）中JEV特异性T细胞谱的检测方法及流式细胞术配色方案，旨在为类似研究提供参考。

检测接种日本脑炎疫苗儿童中的多功能T细胞 通过 流式细胞术

T细胞介导的免疫在控制黄病毒属病毒感染中发挥重要作用，无论是在接种疫苗后还是自然感染后。这种“质量”……

检测日本脑炎病毒特异性TPFS的方法及流式细胞术配色方案已进行测试，以期为类似研究提供参考。本实验操作将由本实验室的两名学生张林林和张萌演示。首先，在37摄氏度条件下，用浓缩的灭活日本脑炎病毒颗粒刺激JEV刺激组的外周血单个核细胞（PBMCs），同时加入单克隆抗体CD28和CD49d、CD107a、GolgiPlug以及莫能菌素，共同孵育16小时。然后，在37摄氏度条件下，用单克隆抗体CD28、CD49d、CD107a、GolgiPlug和莫能菌素刺激对照组的PBMCs细胞16小时。将每组的细胞悬液收集至1.5毫升微量离心管中。在室温下以500 × g离心5分钟，并用移液器吸除上清液。将细胞重悬于1毫升PBS中。向细胞悬液中加入可固定活力染料，在室温避光孵育10分钟。在室温下以500 ×g离心5分钟，弃去上清液。将细胞在1毫升PBS中重悬后，再次于室温下以500 ×g离心5分钟，并弃去上清液，操作如前所述。进行细胞表面标志物染色时，将细胞重悬于100微升PBS中，然后向每根试管的细胞悬液中加入2微升每种表面标志物抗体。将试管在室温下避光孵育30分钟。以500 ×g离心5分钟，并如前所述去除上清液。再次将细胞重悬于1 mL PBS中。在室温下以500 ×g离心5分钟，小心弃去上清液。进行固定和破膜操作时，用500微升破膜固定液重悬细胞，在室温避光条件下固定20分钟。随后以500 ×g离心5分钟，弃去上清液。用1毫升PBS重悬细胞后，于室温下以500 ×g离心5分钟，小心弃去上清液，操作如前所述。然后，将细胞重悬于 100 µL PBS 中，并向每根试管的细胞悬液中加入 2 µL 每种细胞因子抗体，用于细胞内细胞因子染色。室温避光孵育 30 分钟。再次于 500 ×g 离心 5 分钟，并按先前所示方法弃去上清液。再次将细胞重悬于1毫升PBS中。在室温下以500 ×g离心5分钟，并参照之前的操作小心移除上清液。随后，加入500微升PBS重悬细胞。在按照前述方法单独分离PBMC样本后，将细胞悬液等分为12份，分别置于文中所述的1.5毫升微量离心管中。同样，按照前述方法加入细胞表面标记物和细胞内细胞因子抗体后，加入500微升PBS重悬细胞，并以低速涡旋振荡。使用未染色样本调节前向散射光、侧向散射光及不同荧光染料的电压，同时利用单染样本调节流式细胞术的补偿，以消除不同荧光染料之间的信号串扰。在前向散射面积与侧向散射面积的散点图上绘制多边形门，以选择完整的淋巴细胞群体，同时排除碎片；在前向散射面积与前向散射宽度的散点图上绘制矩形门，以选择单细胞。接下来，在活细胞与死细胞的侧向散射面积散点图上绘制矩形门，以选择活细胞；在CD3与侧向散射面积的散点图上绘制矩形门，以鉴定CD3阳性的T细胞。然后，在CD4与CD8的散点图上绘制四分门，以鉴定CD4阳性或CD8阳性的T细胞；在CD45RO与CD27的散点图上绘制四分门，将CD4阳性或CD8阳性的T细胞进一步划分为中央记忆性T细胞（TCM）和效应记忆性T细胞（TEM）。通过绘制 CD8 阳性或 CD4 阳性 T 细胞的中央记忆性 T 细胞（TCM）或效应记忆性 T 细胞（TEM）中 CD107a、干扰素 γ、肿瘤坏死因子 α、白细胞介素 2 和巨噬细胞炎症蛋白 1α 的门控，分别确定不同应答模式的频率。随后将样本依次上机进行流式细胞术检测。采用门控策略，利用前向散射面积与宽度以及侧向散射面积点图，鉴定 CD8 阳性或 CD4 阳性 T 细胞中的 TCM 或 TEM 及其亚群。对CD4阳性与CD8阳性T细胞对日本脑炎病毒（JEV）反应的多功能性特征分析表明，在接种疫苗的儿童中，经JEV刺激后，其CD8阳性中央记忆性T细胞（TCM细胞）中CD107a、γ-干扰素、肿瘤坏死因子α和白细胞介素2的水平较未接种疫苗儿童显著升高。然而，两组之间单核细胞趋化蛋白-1α（MIP-1α）的水平无显著差异。在JEV刺激下，接种组的CD8阳性效应记忆性T细胞（TEM细胞）中CD107a和γ-干扰素的水平亦高于未接种组。而肿瘤坏死因子α、白细胞介素2和巨噬细胞炎症蛋白1α在这些阳性细胞中未见显著升高。与未接种疫苗组相比，接种组的CD4阳性中央记忆性T细胞在乙型脑炎病毒抗原刺激下，CD107a、干扰素γ、肿瘤坏死因子α和巨噬细胞炎症蛋白1α的表达水平显著升高。然而，在乙型脑炎病毒抗原刺激下，两组之间白细胞介素2阳性细胞的比例差异无统计学意义。在存在日本脑炎病毒（JEV）的情况下，接种组中CD107a阳性、干扰素γ阳性以及肿瘤坏死因子α阳性的亚群，以及亚群中CD4阳性效应记忆T细胞的比例高于未接种组。刺激物的T细胞免疫原性及匹配的颜色组合策略是本方案中的关键步骤。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

流式细胞术 检测 接种乙型脑炎疫苗的儿童多功能T细胞

来源：Xu, C., et al. 建立慢性活动性EB病毒感患者NK细胞和T细胞系的高效简便方法。J. Vis. Exp.

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纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

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我们介绍一种简单易行的实验方案，利用登革病毒报告病毒颗粒，通过寨卡病毒感染恢复期血清来检测抗体依赖性增强感染效应。...

一种基于流式细胞术的简易检测方法 体外 利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒的抗体依赖性感染

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通过MHC I类四聚体染色法在病毒载体疫苗接种后同时定量抗载体和抗转基因特异性CD8+ T细胞

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

我们介绍一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选的方法，用于分离和分析外周血单个核细胞中的特定免疫细胞亚群（单核细胞、CD4+ T细胞、CD8+...

儿童传染性单核细胞增多症外周血样本中免疫细胞亚群的分离

该方案详细介绍了评估纳米乳剂麦冬皂苷D佐剂是否能够促进有效细胞免疫反应的方法。...

体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

本研究建立了一种方法，用于在两个实验室的两台流式细胞仪之间转移实验设置和分析模板，以检测日本脑炎疫苗接种儿童中的淋巴细胞。该流式细胞仪实验的标准化方法将有助于在多个研究中心有效地开展科研项目。...

日本脑炎疫苗接种儿童中淋巴细胞检测的流式细胞仪跨实验室标准化

了解如何使用流式细胞术分析接种乙型脑炎疫苗儿童的多功能T细胞反应。本方案通过体外刺激PBMCs结合多色流式技术，评估CD4+和CD8+T细胞的免疫应答特征，为疫苗免疫效果研究提供可靠方法。

检测接种日本脑炎疫苗儿童中的多功能T细胞通过流式细胞术

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