利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

本方案提供了一种在活体小鼠中可视化神经元对机械应力反应的方法，可为创伤性脑损伤如何影响大脑提供直接证据。该技术可在同一动物的同一脑区，对创伤性脑损伤后的急性期和慢性期目标蛋白进行持续监测。通过更换目的基因和病毒启动子，可针对脑内特定细胞类型中的其他蛋白开展研究。

首先，将眼用软膏涂抹于已麻醉的小鼠眼部。使用普通剪刀修剪头部顶部的毛发。沿中线做一长度为12至15毫米的切口后，用弯头弹簧剪剪除覆盖在颅骨左右半球的皮肤。

暴露颅骨后，用无菌棉签轻轻擦拭去除骨膜，并用无菌生理盐水冲洗。待颅骨区域干燥后，在冠状缝后方2.5毫米、矢状缝右侧2毫米处标记创伤性脑损伤（TBI）的撞击位点。迅速将小鼠从立体定位仪上取下，将其头部置于TBI装置下方的缓冲垫上。

将撞击器尖端与标记的撞击位置对齐。通过拉动系留的尼龙绳，将金属柱提升至小鼠头部上方15厘米处，然后释放，使重物自由下落至与颅脑损伤部位颅骨顶部接触的换能器杆上。将麻醉后小鼠的头部放置在手术显微镜下的立体定位仪框架上。

使用 FG4 碳化钨钻头，在低转子转速下轻柔缓慢地钻磨颅骨表面，以去除残留的骨膜，并使颅骨表面变得粗糙，便于牙科水泥与颅骨牢固结合。用生理盐水冲洗颅骨表面，清除骨屑。为将侧部肌肉与颅骨分离，在眼球后方约五毫米处（即顶骨与颞骨连接缝所在位置），轻轻插入精细的闭合尖端，并将闭合尖端缓慢向后移动，直至到达人字缝。

分离将要植入颅窗一侧的侧部肌肉。使用生理盐水冲洗手术区域的碎屑，并用纱布擦干该区域。植入头固定基座时，用记号笔和手术卡尺在右侧半球标记中心点，该点位于前囟后方 2.5 毫米、矢状缝外侧 1.5 毫米处。

然后在干净且干燥的颅骨上描记颅骨开窗的周长。松开耳杆并旋转头部，使颅骨开窗平面完全水平，然后再次拧紧耳杆。使用棉签的木柄在头固定柱的前缘和后缘各添加两小滴超级胶水。

将钛制头固定装置置于颅骨开窗的中心位置，并迅速调整使其位于即将植入颅骨窗的同一平面内。施加轻微压力，直至速干胶完全干燥，通常需要约 30 秒。在预冷的陶瓷皿中配制牙科水泥，充分混合 300 毫克水泥粉、六滴 QuickBase 液体和一滴催化剂。

将足量的牙科水泥混合物迅速涂抹于已描记的圆周外缘，并覆盖所有暴露的骨面，但切勿覆盖颅骨开窗部位。松开耳杆，将头固定柱连接至金属框架，以确保头部稳定，便于沿标记的颅骨开窗圆周进行精确钻孔。

进行开颅手术时，使用外科卡尺再次确认所标记圆圈的直径，必要时进行调整，以确保颅窗能够紧密地嵌入开颅部位。使用电动牙科钻，先用FG4碳化钨钻头沿标记圆圈的外缘刻划并磨薄颅骨，形成一条用于进一步减薄颅骨的轨迹。用生理盐水冲洗该区域，以清除骨屑。

继续使用 FG 1/4 碳化钨钻头磨薄颅骨，直至颅骨变得如纸般纤薄且呈透明状。操作过程中应定期停止钻磨，再次用无菌生理盐水冲洗整个区域，以降低钻头产生的热量并清除骨屑。随后使用 EF4 碳化钨钻头完成颅骨的进一步减薄，并沿预定路径继续对剩余颅骨进行减薄和钻磨。

将0.5毫米尖头镊子从裂口处插入，轻轻向上抬起颅骨瓣，避免压陷下方脑组织。移除颅骨瓣后，用生理盐水冲洗开颅区域。使用弯头手术镊子，轻柔地去除可见的蛛网膜组织。

使用尖端平直的外科镊子夹取无菌玻璃窗，使三毫米的玻璃盖片朝下。将玻璃窗置于颅骨开窗部位上方并进行调整，确保玻璃窗能够紧密贴合颅骨开窗边缘。五毫米的玻璃盖片位于上方。

按照之前演示的方法制备牙科水泥，并等待约六分钟，直至水泥变得呈糊状且粘稠。在等待水泥变稠的过程中，通过立体定位操纵器对窗口施加适当压力，以确认颅骨能够与玻璃窗口牢固且紧密地贴合。使用可调节的精密涂抹刷，沿窗口边缘涂抹少量水泥，以将玻璃窗口与颅骨密封。

等待约10分钟，使牙科水泥完全干燥，然后轻轻松开并移除窗口上方的操作装置。若有多余的水泥覆盖窗口，使用配有FG4碳化钨钻头的牙科钻头修剪牙科水泥。术后约4小时进行双光子成像，在浅层水平，血管呈现黑色；在约400微米的深层水平，EGFP蛋白在整个细胞体中呈弥散性分布。

在创伤性脑损伤后一周和四个月，以第0天时间点观察到的血管模式作为参考，用于定位相同的成像区域。该血管模式与第0天相似。同样，EGFP表达在整个细胞体中均被检测到。

在浅层和深层，第零天与四个月时的荧光强度相似。然而，一周时的荧光强度低于第零天和四个月时，这可能与先前在其他创伤性脑损伤模型中报道的翻译抑制有关。在进行开颅手术步骤时，必须格外小心，以避免损伤脑组织。

切勿将钻头插入脑组织。利用该技术，研究人员可以在创伤性脑损伤（TBI）后的不同阶段，对同一细胞中感兴趣的多种蛋白质进行纵向可视化观察，从而获取有关该蛋白质在哺乳动物脑组织受损后定位、表达水平及溶解性的信息。