Name: 使用双光子显微镜对闭合颅骨创伤性脑损伤和颅窗小鼠荧光蛋白表达进行活体成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学习使用双光子显微镜对闭合颅骨创伤性脑损伤小鼠进行活体成像，通过植入颅窗观察EGFP表达神经元的动态反应。该技术可在急性和慢性期持续监测同一脑区的目标蛋白变化。

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感谢马萨诸塞大学陈医学院的 Miguel Sena-Esteves 博士惠赠 AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP 病毒，以及马萨诸塞大学陈医学院的 Debra Cameron 绘制小鼠颅骨示意图。我们还感谢 Bosco、Schafer 和 Henninger 实验室的现任及前任成员所提出的建议与支持。本研究由美国国防部（W81XWH202071/PRARP）资助，受资助者为 DAB、DS 和 NH。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

在本研究中，通过结合腺相关病毒（AAV）注射、创伤性脑损伤（TBI）建模以及颅窗与头固定装置的植入，对小鼠脑皮层（IV层和V层）中EGFP标记的神经元进行纵向成像分析，以观察TBI对皮层神经元的影响。本研究指出，所选择的TBI作用部位位于海马体上方，该区域颅骨相对平坦且宽阔，有利于颅窗的植入。相反，该位置前方的颅骨较窄，因此难以确保头固定装置与颅骨表面有效贴合。而仅针对TDP-43Q331K/Q331K 本研究采用了小鼠模型，考虑到实验室的研究重点是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTD）19，本方案应适用于大多数其他小鼠品系。除了如本文所述标记神经元外，还可采用多种策略对其他细胞类型进行标记，以实现活体成像。其中一种方法是在基因修饰小鼠中利用Cre-Lox重组系统，以细胞特异性方式表达遗传编码的荧光蛋白21另一种方法是利用特定的病毒血清型，实现细胞特异性转导遗传编码的荧光蛋白。通过在脑内目标位置进行颅内注射，可实现定点递送。该方法在表达细胞特异性蛋白方面的效率和操作便捷性 通过 活体成像中，病...

创伤性脑损伤（TBI）可由运动损伤、交通事故和军事冲突引起，是全球关注的健康问题。TBI 可导致生理、认知和行为功能障碍&#160;以及终身残疾或死亡1,2。TBI 的严重程度可分为轻度、中度和重度，其中绝大多数为轻度 TBI（占 75%–90%）3。目前人们日益认识到，TBI 特别是反复发生的 TBI，可能促进神经元退行性变，并成为多种神经退行性疾病的风险因素，包括阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）和慢性创伤性脑病（CTE）4,5,6。然而，TBI 引发神经退行性变的分子机制尚不明确，因此仍是当前研究的热点领域。本文介绍了一种在小鼠 TBI 后通过纵向活体成像监测特定神经元内荧光标记的目标蛋白的方法，以深入了解神经元对 TBI 的响应与恢复过程。
为此，本研究展示了如何将一种类似于先前报道的闭颅创伤性脑损伤（TBI）手术操作7,8与Goldey等人9所述的颅窗植入手术相结合，用于后续的活体成像。值得注意的是，无法先植入颅窗再在同一区域实施TBI，因为用于诱导TBI的落锤冲击很可能损坏颅窗并对小鼠造成不可逆的损伤。因此，本方案设计为在同一台手术过程中先实施TBI，随后直接在撞击部位植入颅窗。将TBI与颅窗植入合并于一次手术中的优势在于减少了小鼠接受手术的次数。此外，该方法可实现对TBI后即刻反应（即数小时时间尺度内）的监测，而非在后续单独的手术中植入颅窗（即初始成像始于TBI后数天的时间尺度）。与通过免疫染色固定组织等传统方法监测神经元蛋白相比，颅窗结合活体成像平台还具有多项优势。例如，活体成像所需小鼠数量更少，因为同一只小鼠可在多个时间点被重复观察，而无需为每个时间点准备独立的小鼠群体。此外，可对同一神经元进行长期追踪，从而能够在单个细胞内监测特定的生物学或病理学事件。
作为概念验证，本文展示了在突触素（synapsin）启动子驱动下增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在神经元中的特异性表达。10该方法可通过使用其他细胞类型特异性启动子扩展至1）不同的脑细胞类型，例如少突胶质细胞可使用髓鞘碱性蛋白（MBP）启动子，星形胶质细胞可使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子11 ，2）通过将目的蛋白的基因与EGFP基因融合，表达不同的目标蛋白，以及3）共表达与不同荧光蛋白融合的多种蛋白。此处，EGFP被包装并表达 通过 通过颅内注射递送腺相关病毒（AAV）。使用落锤装置实施闭合性颅脑损伤，随后植入颅窗。通过颅窗利用双光子显微镜检测EGFP荧光，实现对神经元EGFP的可视化。 体内利用双光子激光，可以在光损伤最小的情况下更深入地穿透皮层组织，从而实现对同一只小鼠的相同皮层区域进行数天乃至数月的重复纵向成像12,13,14,15总之，将创伤性脑损伤手术与活体成像相结合的方法旨在增进对导致创伤性脑损伤相关疾病病理的分子事件的理解16,17.

<table><tbody><tr><td>可调节精密涂布刷</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td></td></tr><tr><td>BD胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>NDC/HRI#08290-3284-38</td><td>5/16&quot; x 31G</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Purdue</td><td>NDC67618-151-17</td><td>含7.5%聚维酮碘</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>PAR Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林</td><td>HIKMA Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷混合皿</td><td>Parkell</td><td>SKU: S387</td><td>用于牙科水泥配制</td></tr><tr><td>棉签涂药棒</td><td>ZORO</td><td>目录号: G9531702</td><td></td></tr><tr><td>催化剂</td><td>Parkell</td><td>S371</td><td>全称：&quot;C&quot; Universal TBB Catalyst</td></tr><tr><td>牙科水泥粉末</td><td>Parkell</td><td>S396</td><td>用于C&amp;B Metabond的X线阻射L型粉末</td></tr><tr><td>牙科钻头</td><td>Foredom</td><td>H.MH-130</td><td></td></tr><tr><td>牙科钻头控制器</td><td>Foredom</td><td>HP4-310</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-519-05</td><td></td></tr><tr><td>EF4碳化钨钻头</td><td>Microcopy</td><td>批号 C150113</td><td>头部直径/长度/mm 1.0/4.2</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>04355223EA</td><td>75%</td></tr><tr><td>FG1/4碳化钨钻头</td><td>Microcopy</td><td>批号 C150413</td><td>头部直径/长度/mm 0.5/0.4</td></tr><tr><td>FG4碳化钨钻头</td><td>Microcopy</td><td>批号 C150309</td><td>头部直径/长度/mm 1.4/1.1</td></tr><tr><td>头固定柱</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>定制生产</td></tr><tr><td>加热装置</td><td>CWE</td><td>TC-1000 Mouse</td><td>与立体定位仪配套使用，手术过程中使用</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>CVS pharmacy</td><td>E12107</td><td>额外加热设备，术后使用</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-03</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷诱导室</td><td>Vetequip</td><td>89012-688</td><td>简称诱导室</td></tr><tr><td>异氟烷挥发器</td><td>Vetequip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发器支架</td><td>Vetequip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>Leica手术显微镜</td><td>Leica</td><td>LEICA 10450243</td><td></td></tr><tr><td>润滑性眼用软膏</td><td>Picetal</td><td>NDC 46066-753-55</td><td></td></tr><tr><td>标记笔</td><td>Delasco</td><td>SMP-BK</td><td></td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Norbrook</td><td>NDC 55529-040-10</td><td></td></tr><tr><td>微量注射泵及其控制器</td><td>World Precision Instruments</td><td>micro4 和 UMP3</td><td></td></tr><tr><td>微升注射器</td><td>Hamilton</td><td>Hamilton 80014</td><td>1701 RN，注射器规格10 &amp;mu;L，针头规格32G，长度2英寸，尖端类型3</td></tr><tr><td>蚊式止血钳</td><td>CAROLINA</td><td>货号: 625314</td><td>不锈钢，弯型，5英寸</td></tr><tr><td>脱毛剂</td><td>McKesson Corporation</td><td>N/A</td><td>Nair Aloe &amp; Lanolin脱毛乳液</td></tr><tr><td>显微镜1</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>用于颅窗制备的尼康显微镜</td></tr><tr><td>显微镜2</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7 MP</td><td>双光子显微镜</td></tr><tr><td>多光子激光器</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Ultra II, 型号: MRU X1, VERDI 18W</td><td>用于双光子显微成像的激光器</td></tr><tr><td>不可吸收外科缝线</td><td>Harvard Apparatus</td><td>目录号 59-6860</td><td>6-0，带圆针</td></tr><tr><td>Norland光学胶81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>防钩针持</td><td>CAROLINA</td><td>货号: 567912</td><td></td></tr><tr><td>快速基底液</td><td>Parkell</td><td>S398</td><td>&quot;B&quot; Quick Base For C&amp;B Metabond</td></tr><tr><td>普通剪刀1</td><td>Eurostat</td><td>eurostat es5-300</td><td></td></tr><tr><td>普通剪刀2</td><td>World Precision Instruments</td><td>货号: 501759-G</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片1</td><td>Warner instruments</td><td>CS-5R 目录号 64-0700</td><td>适用于直径5 mm</td></tr><tr><td>圆形盖玻片2</td><td>Warner instruments</td><td>CS-3R 目录号 64-0720</td><td>适用于直径3 mm</td></tr><tr><td>橡胶环</td><td>Orings-Online</td><td>货号 OO-014-70-50</td><td>O型圈</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Bioworld</td><td>L19102411PR</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀1</td><td>World Precision Instruments</td><td>货号: 91500-09</td><td>尖端直型</td></tr><tr><td>弹簧剪刀2</td><td>World Precision Instruments</td><td>货号: 91501-09</td><td>尖端弯型</td></tr><tr><td>立体定位平台</td><td>KOPF</td><td>型号 900LS</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Henkel</td><td>货号: 1647358</td><td></td></tr><tr><td>外科卡尺</td><td>World Precision Instruments</td><td>货号: 501200</td><td></td></tr><tr><td>外科镊1</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>目录号 0508-5/45-PO</td><td>型号5/45，弯型</td></tr><tr><td>外科镊2</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>目录号 0103-5-PO</td><td>型号5，直型</td></tr><tr><td>外科镊3</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>目录号 72912</td><td></td></tr><tr><td>外科镊4</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>目录号 0508-5/45-PO</td><td>型号5/45，弯型</td></tr><tr><td>外科纱布</td><td>ZORO</td><td>目录号: G0593801</td><td></td></tr><tr><td>手术灯</td><td>Leica</td><td>Leica KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>Spectrolinker</td><td>XL-1000</td><td>又称紫外交联器</td></tr><tr><td>麻醉气体防护罩</td><td>Vetequip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond组织粘合剂</td><td>3M Animal Care</td><td>部件号: 014006</td><td></td></tr></tbody></table>

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope

本实验方案的目的是展示如何在动物大脑特定细胞类型中，于外源性刺激暴露后，对目标蛋白的表达和定位进行长期可视化观察。本文展示了在小鼠中实施闭合性颅脑创伤（TBI）的同时植入颅窗，以便后续进行长期活体成像的操作方法。通过颅内注射腺相关病毒（AAV），该病毒在神经元特异性启动子驱动下表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。注射后2至4周，利用落锤装置在AAV注射部位施加重复性TBI。在同一手术过程中，小鼠被植入金属头固定基座，随后在TBI作用区域植入玻璃颅窗。在数月时间内，利用双光子显微镜对经历创伤的同一脑区中EGFP的表达及其细胞定位进行观察。

作为本方案的概念验证，将表达 AAV-Syn1-EGFP 的病毒颗粒注射至雄性 TDP-43 小鼠的大脑皮层Q331K/Q331K 小鼠（C57BL/6J 背景）19 在3个月龄时。需要注意的是，也可使用野生型C57BL/6J动物，但本研究是在TDP-43模型中进行的Q331K/Q331K 小鼠，因为该实验室专注于神经退行性疾病研究。在腺相关病毒注射后4周进行创伤性脑损伤（TBI）手术。在同一手术过程中，植入头固定基座和颅窗。使用双光子显微镜对小鼠在TBI手术后第0天、第1周和第4个月进行连续成像（图1）。一般来说，注射手术每只小鼠耗时约30分钟，而创伤性脑损伤（TBI）手术每只小鼠耗时约1小时。在TBI手术过程中，与初始撞击相比，小鼠在后续撞击后从仰卧位恢复至俯卧位所需的时间通常更长。例如，某只小鼠在第一次撞击后可能需要2分钟恢复体位，但在第10次撞击后恢复体位可能需要10分钟th 影响。对于颅窗植入手术，通常需要约3小时完成所有步骤，但如果出现持续性出血，则耗时...

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。

本实验方案的目的是展示如何在活体动物中对特定细胞内目标蛋白的表达与定位进行长期纵向可视化观察……

本方案提供了一种在活体小鼠中可视化神经元对机械应力反应的方法，可为创伤性脑损伤如何影响大脑提供直接证据。该技术可在同一动物的同一脑区，对创伤性脑损伤后的急性期和慢性期目标蛋白进行持续监测。通过更换目的基因和病毒启动子，可针对脑内特定细胞类型中的其他蛋白开展研究。首先，将眼用软膏涂抹于已麻醉的小鼠眼部。使用普通剪刀修剪头部顶部的毛发。沿中线做一长度为12至15毫米的切口后，用弯头弹簧剪剪除覆盖在颅骨左右半球的皮肤。暴露颅骨后，用无菌棉签轻轻擦拭去除骨膜，并用无菌生理盐水冲洗。待颅骨区域干燥后，在冠状缝后方2.5毫米、矢状缝右侧2毫米处标记创伤性脑损伤（TBI）的撞击位点。迅速将小鼠从立体定位仪上取下，将其头部置于TBI装置下方的缓冲垫上。将撞击器尖端与标记的撞击位置对齐。通过拉动系留的尼龙绳，将金属柱提升至小鼠头部上方15厘米处，然后释放，使重物自由下落至与颅脑损伤部位颅骨顶部接触的换能器杆上。将麻醉后小鼠的头部放置在手术显微镜下的立体定位仪框架上。使用 FG4 碳化钨钻头，在低转子转速下轻柔缓慢地钻磨颅骨表面，以去除残留的骨膜，并使颅骨表面变得粗糙，便于牙科水泥与颅骨牢固结合。用生理盐水冲洗颅骨表面，清除骨屑。为将侧部肌肉与颅骨分离，在眼球后方约五毫米处（即顶骨与颞骨连接缝所在位置），轻轻插入精细的闭合尖端，并将闭合尖端缓慢向后移动，直至到达人字缝。分离将要植入颅窗一侧的侧部肌肉。使用生理盐水冲洗手术区域的碎屑，并用纱布擦干该区域。植入头固定基座时，用记号笔和手术卡尺在右侧半球标记中心点，该点位于前囟后方 2.5 毫米、矢状缝外侧 1.5 毫米处。然后在干净且干燥的颅骨上描记颅骨开窗的周长。松开耳杆并旋转头部，使颅骨开窗平面完全水平，然后再次拧紧耳杆。使用棉签的木柄在头固定柱的前缘和后缘各添加两小滴超级胶水。将钛制头固定装置置于颅骨开窗的中心位置，并迅速调整使其位于即将植入颅骨窗的同一平面内。施加轻微压力，直至速干胶完全干燥，通常需要约 30 秒。在预冷的陶瓷皿中配制牙科水泥，充分混合 300 毫克水泥粉、六滴 QuickBase 液体和一滴催化剂。将足量的牙科水泥混合物迅速涂抹于已描记的圆周外缘，并覆盖所有暴露的骨面，但切勿覆盖颅骨开窗部位。松开耳杆，将头固定柱连接至金属框架，以确保头部稳定，便于沿标记的颅骨开窗圆周进行精确钻孔。进行开颅手术时，使用外科卡尺再次确认所标记圆圈的直径，必要时进行调整，以确保颅窗能够紧密地嵌入开颅部位。使用电动牙科钻，先用FG4碳化钨钻头沿标记圆圈的外缘刻划并磨薄颅骨，形成一条用于进一步减薄颅骨的轨迹。用生理盐水冲洗该区域，以清除骨屑。继续使用 FG 1/4 碳化钨钻头磨薄颅骨，直至颅骨变得如纸般纤薄且呈透明状。操作过程中应定期停止钻磨，再次用无菌生理盐水冲洗整个区域，以降低钻头产生的热量并清除骨屑。随后使用 EF4 碳化钨钻头完成颅骨的进一步减薄，并沿预定路径继续对剩余颅骨进行减薄和钻磨。将0.5毫米尖头镊子从裂口处插入，轻轻向上抬起颅骨瓣，避免压陷下方脑组织。移除颅骨瓣后，用生理盐水冲洗开颅区域。使用弯头手术镊子，轻柔地去除可见的蛛网膜组织。使用尖端平直的外科镊子夹取无菌玻璃窗，使三毫米的玻璃盖片朝下。将玻璃窗置于颅骨开窗部位上方并进行调整，确保玻璃窗能够紧密贴合颅骨开窗边缘。五毫米的玻璃盖片位于上方。按照之前演示的方法制备牙科水泥，并等待约六分钟，直至水泥变得呈糊状且粘稠。在等待水泥变稠的过程中，通过立体定位操纵器对窗口施加适当压力，以确认颅骨能够与玻璃窗口牢固且紧密地贴合。使用可调节的精密涂抹刷，沿窗口边缘涂抹少量水泥，以将玻璃窗口与颅骨密封。等待约10分钟，使牙科水泥完全干燥，然后轻轻松开并移除窗口上方的操作装置。若有多余的水泥覆盖窗口，使用配有FG4碳化钨钻头的牙科钻头修剪牙科水泥。术后约4小时进行双光子成像，在浅层水平，血管呈现黑色；在约400微米的深层水平，EGFP蛋白在整个细胞体中呈弥散性分布。在创伤性脑损伤后一周和四个月，以第0天时间点观察到的血管模式作为参考，用于定位相同的成像区域。该血管模式与第0天相似。同样，EGFP表达在整个细胞体中均被检测到。在浅层和深层，第零天与四个月时的荧光强度相似。然而，一周时的荧光强度低于第零天和四个月时，这可能与先前在其他创伤性脑损伤模型中报道的翻译抑制有关。在进行开颅手术步骤时，必须格外小心，以避免损伤脑组织。切勿将钻头插入脑组织。利用该技术，研究人员可以在创伤性脑损伤（TBI）后的不同阶段，对同一细胞中感兴趣的多种蛋白质进行纵向可视化观察，从而获取有关该蛋白质在哺乳动物脑组织受损后定位、表达水平及溶解性的信息。

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使用双光子显微镜对闭合颅骨创伤性脑损伤和颅窗小鼠荧光蛋白表达进行活体成像

本视频展示了在小鼠中实施创伤性脑损伤（TBI）的方法。暴露颅骨后，标记TBI作用部位。将小鼠置于TBI装置下方，通过提起金属杆并使其自由下落撞击与颅骨接触的冲击头，从而产生冲击损伤。...

对小鼠脑部实施创伤性脑损伤

来源：Bisht, K.，等．通过精确脑图谱实现小鼠神经-免疫动态的重复活体成像．J. Vis. Exp.

利用颅骨植入物进行神经-免疫动态的荧光成像

来源： Nishimura, C. 等 利用双光子显微镜在HIV诱导的神经炎症小鼠模型中定量分析脑血管结构。 J. Vis. Exp. (2016)。...

双光子显微成像技术用于小鼠脑微血管的活体成像

神经元中依赖于经验的分子变化对于大脑应对行为挑战时的适应能力至关重要。 体内...

体内 双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化

在活体动物中进行延时成像可为完整大脑内的结构重组提供重要信息。本文介绍一种颅骨减薄制备方法，该方法可通过双光子显微镜对活体小鼠大脑皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。...

双光子 体内 使用颅骨变薄制备法对小鼠皮层树突棘进行成像

急性脑损伤是一种目前尚无有效治疗方法的严重创伤。多光子显微镜技术可实现对急性脑损伤在啮齿类动物中发展过程的纵向研究，并用于探索治疗策略。通过多光子显微镜研究的两种急性脑损伤模型包括 体内...

小鼠急性脑损伤后纵向双光子成像

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry...

双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

经颅光学成像技术能够通过完整颅骨对活体小鼠大脑皮层中的脑脊液运输进行宽场成像。...

利用荧光大体显微镜通过完整小鼠颅骨在体成像脑脊液运输

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。...

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

本文介绍了一种用于在清醒且头部固定的活体小鼠中对脑细胞进行长期成像的慢性颅窗植入实验方案。...

植入颅窗以实现重复观察 在体实验 清醒小鼠成像

学习使用双光子显微镜对闭合颅骨创伤性脑损伤小鼠进行活体成像，通过植入颅窗观察EGFP表达神经元的动态反应。该技术可在急性和慢性期持续监测同一脑区的目标蛋白变化。

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

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