使用双光子显微镜对闭合颅骨创伤性脑损伤和颅窗小鼠荧光蛋白表达进行活体成像

这项研究表明，向小鼠提供重复性创伤性脑损伤，并同时植入颅窗，以便随后使用双光子显微镜对神经元表达的 EGFP 进行活体成像。

我们的协议提供了一种可视化活小鼠对机械应力的神经元反应的方法，这可以提供创伤性脑损伤如何影响大脑的直接证据。该技术可以监测同一动物相同大脑位置的靶蛋白，用于创伤性脑损伤后的急性期和慢性期。可以相应地改变目的基因和病毒启动子，以研究大脑中特定细胞类型中的其他蛋白质。

首先，将眼药膏涂抹在麻醉小鼠的眼睛上。用普通剪刀修剪，去除头顶的头发。在建立 12 至 15 毫米长的中线切口后，使用弯曲的尖端弹簧剪刀切除颅骨左右半球的皮肤。

颅骨暴露后，用无菌棉签轻轻擦拭，并用无菌生理盐水冲洗，去除骨膜。颅骨区域干燥后，在前囟后方 2.5 毫米处和右侧矢状缝线外侧 2 毫米处标记创伤性脑损伤 （TBI） 撞击部位。快速将鼠标从立体定位框架中取出，并将头部放在 TBI 设备下方的缓冲垫上。

将撞击器尖端与标记的撞击部位对齐。将系留的尼龙绳拉到鼠标头部上方 15 厘米处，抬起金属柱，然后松开，让重物自由落到换能杆上，换能杆与 TBI 部位的颅骨顶部接触。将麻醉小鼠的头部放在手术显微镜下的立体定位框架上。

使用FG4硬质合金钻头以低转子速度轻轻缓慢地钻头颅骨表面，以去除剩余的骨膜，并形成粗糙的颅骨表面，使牙胶与颅骨牢固结合。使用生理盐水冲洗并清除颅骨表面的骨灰。为了将侧肌与颅骨分开，在眼睛后方约5毫米处，连接顶骨和颞颅骨的缝合线所在的位置，轻轻插入细闭合的尖端，并轻轻地向后移动闭合的尖端，直到羊羔形缝合线。

分离将发生颅窗植入的一侧的侧肌。用生理盐水洗掉手术部位的碎屑，并用纱布擦干该区域。要植入头柱，请使用记号笔和手术卡尺在前囟后方 2.5 毫米处标记中心点，在右半球矢状缝合线处标记 1.5 毫米。

然后在干净干燥的头骨上描摹开颅手术的周长。松开耳杆并旋转头部，使开颅平面完全水平，然后再次拧紧耳杆。使用棉签涂抹器的木棒在头柱的前后边缘添加两小滴强力胶。

将钛头柱放在开颅手术的中心上方，并快速调整它以放置在将植入颅窗的同一平面内。轻轻按压直到强力胶干燥，通常需要大约 30 秒。通过充分混合 300 毫克水泥粉、六滴 QuickBase 液体和一滴催化剂，在预冷的陶瓷盘中制备牙科水泥。

快速将大量牙科水泥混合物涂抹在描摹的圆周的外周，并覆盖任何暴露的骨表面。但是，不要覆盖开颅手术的部位。松开耳杆并将头柱固定在金属框架上，以确保头稳定，以便沿着标记的开颅手术周进行精确钻孔。

要进行开颅手术，请使用手术卡尺验证标记圆圈的直径，如前所述，并根据需要进行调整，使颅窗紧贴开颅手术内。使用电动牙钻，首先使用 FG4 硬质合金钻头沿标记圆的外侧蚀刻和稀释颅骨，从而形成一条使颅骨变薄的轨道。用生理盐水冲洗该区域以洗去骨尘。

继续使用 FG 1/4 硬质合金钻头稀释头骨，直到头骨薄且透明。定期停止钻孔，并再次用无菌盐水冲洗整个区域，以减少钻头的热量并洗去骨灰。使用EF4硬质合金钻头完成颅骨变薄，然后继续变薄并沿着轨道钻穿颅骨的其余部分。

将 0.5 毫米细尖镊子插入破裂的地方，轻轻向上提起骨瓣，而不会压入下面的大脑。取出骨瓣后，用生理盐水冲洗开颅手术区域。使用弯曲的尖端手术镊子，轻轻去除可见的蛛网膜物质。

使用直尖手术镊子拿起无菌玻璃窗，三毫米玻璃盖玻片朝下。将玻璃窗放置在开颅部位上方并调整，以确保窗户可以紧贴开颅手术边缘。五毫米的玻璃盖玻片在顶部。

如前所述准备牙科水泥，并等待大约六分钟，直到水泥变得糊状和粘稠。在等待水泥变得糊状和厚实的同时，通过立体定位机械手对窗户施加足够的压力，以检查头骨是否可以牢固而紧密地接触玻璃窗。使用可调节的精密涂抹刷在窗边添加少量水泥，以将玻璃窗与头骨密封。

等待大约 10 分钟，让水泥完全干燥，然后轻轻松开，然后取下窗户上方的机械手。如果多余的水泥覆盖了窗户，则使用带有 FG4 硬质合金钻头的牙钻修剪牙科水泥。术后约4小时，进行双光子成像，在浅表水平血管系统呈黑色，在约400微米的深水平，EGFP蛋白表达弥漫分布于整个细胞体。

在 TBI 后 1 周零 4 个月，在第零天时间点观察到的脉管系统模式被用作定位相同成像区域的参考。脉管系统模式与第0天相似。同样，在整个细胞体中检测到EGFP表达。

第0天和第4个月的荧光强度在浅表和深层水平上相似。然而，一周的荧光强度低于第0天和第4个月的荧光强度，这可能是由于其他TBI模型报道的翻译抑制。在操作开颅手术步骤时要格外小心，以免损伤脑组织。

不要将钻头插入大脑。使用这种技术，研究人员可以在 TBI 后的不同阶段纵向可视化同一细胞中不同感兴趣的蛋白质，提供有关创伤后该蛋白质在哺乳动物大脑中的定位、表达和溶解度的信息。