利用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖评估小鼠肠道屏障完整性

该方法有助于回答某种条件是否改变肠道屏障完整性，或某种潜在治疗是否能够维持肠道屏障完整性的问题。该技术的主要优势在于，它提供了一种无创、低负担的技术，用于在活体中评估和量化肠道通透性。实验开始时，先将小鼠禁食4小时，然后使用38毫米长、22号规格的无菌弯曲灌胃针，通过口服灌胃方式向每只小鼠给予200 µL FITC-葡聚糖悬浮液。

在第一次灌胃后启动计时器，每次灌胃之间间隔5至10分钟，以便进行体内测量，并维持灌胃后一小时的时间点。保留剩余的FITC-葡聚糖悬浮液用于标准曲线制备。通过点击并按住启动按钮来开启仪器和软件，使系统预热。

单击设备状态，确保所有已配置的设备均显示正常后再继续操作。然后单击新建研究，并以所需名称保存文件。接下来，单击研究选项。

输入样本编号，并选择正确的激光器和实验。然后使用电动剃须刀去除腹部区域的毛发，并在眼睛上大量涂抹兽用软膏以防止干燥。打开成像室，将动物背侧朝下放置在扫描板上。

然后用胶带固定四肢和尾巴。接下来，使用绘制工具选择要扫描的区域。确保包含从肝脏上方至直肠的整个腹部宽度。

然后单击“修改”工具以调整已绘制的区域。将扫描分辨率设置为 2.0 毫米，然后单击“开始”以启动扫描。接下来，通过在选定的文件名下查找图像文件，并使用同步设置同时打开所有文件。

使用图像设置工具栏中的同步图像和同步比例按钮，同步图像设置以进行准确比较。然后保存调整比例后的图像。使用成像系统配套软件，在统一比例的图像上比较每只动物与对照小鼠的腹部荧光。

在灌胃后4小时，从每只小鼠收集粪便颗粒至无菌管中。然后将试管置于冰上并避光保存。接下来，在室温下以9,390 × g离心血液样本10分钟。

然后将血浆转移至新的无菌管中，置于冰上避光保存。将50毫克粪便样本溶于200微升PBS中，并按1:2的比例用PBS稀释血浆。取100微升样本和标准品，加入不透光的黑色96孔板中。

使用荧光酶标仪在激发波长485纳米、吸收波长530纳米的条件下读取荧光值。最后，通过将样品荧光值与标准曲线中已知浓度进行比较，确定每份样品中FITC-葡聚糖的浓度。体内荧光分析结果显示，仅接受对照饮食的小鼠与接受菊粉补充饮食的小鼠相比，其肝脏对FITC-葡聚糖的摄取量更高，腹腔内残留荧光水平也更高。

与仅接受对照饮食的小鼠相比，接受菊粉补充饮食的小鼠血浆中FITC-葡聚糖的水平显著降低。相应地，接受菊粉饮食的小鼠粪便中FITC-葡聚糖的水平显著高于仅接受对照饮食的小鼠。对照组小鼠粪便中较低的FITC-葡聚糖水平表明，该物质穿透了肠屏障进入血液循环，而非被正常排出体外。

血浆中高浓度的FITC-葡聚糖进一步证实了这一发现。在进行该操作时，时间点的把握至关重要。每只小鼠在灌胃后应尽可能在1小时和4小时的时间点进行荧光检测和样本采集。