小鼠脉络丛的显微切割和全安装扫描电子显微镜可视化
December 16th, 2022
脉络丛（CP）是神经科学中研究不足的组织，在中枢神经系统的健康和疾病中起着关键作用。该协议描述了用于分离CP的显微切割技术，并使用扫描电子显微镜来获得其细胞结构的整体视图。
为了更好地了解脉络丛的组成和结构，将脉络丛从脑室中分离出来的有效方法是宝贵的第一步。通过这种显微切割技术，可以将脉络丛从脑室中解剖出来，同时包含其功能、活力和结构，而不会用周围组织污染脉络丛。脉络丛分离的一个重大障碍是识别结构，因为它仍然漂浮在脑室中。
用溴酚蓝染色脉络丛有助于分离。演示该程序的将是我们的实验室经理Elien Van Wonterghem。首先准备终末麻醉液、经心灌注溶液、扫描电子显微镜所需的溶液（SEM）以及文中提到的其他溶液。
为了隔离小鼠大脑，将终末麻醉动物置于背褥位置，并通过将四肢固定在板上来固定小鼠。通过喷洒70%乙醇对胸部进行消毒，然后使用碳钢手术刀片在横膈膜下方切开约4厘米的切口。打开皮肤，用手术剪刀露出胸部。
将横膈膜完全切开并分开胸部，露出肺部和跳动的心脏。使用灌注泵经心以每分钟4.5毫升的速度向小鼠灌注10毫升灌注溶液。在左心室插入 26 号针头，将溶液泵入全身回路。
使用手术剪刀，切开右心房，使血液脱离循环。斩首后，通过从耳朵之间到眼睛上方的切口切开头皮。横向拉动皮肤以露出头骨。
然后沿着鳞状缝合线向鼻部切开颅骨。完成后，将大脑放入冰冷的培养皿中，并向脑组织中添加一毫升冰冷的PBS。为了隔离漂浮在第四脑室中的脉络丛，用手术刀轻轻地切断小脑与大脑的联系。
从小脑中取出剩余的脑干组织部分。旋转大脑，使切割线朝上，确保第四脑室腔在切片中间可见，脉络丛位于背侧。如有必要，用锋利的镊子拉动结缔组织来打开心室。
使用微小锋利的镊子轻轻地将脉络丛从心室壁上撕下。为了将脉络丛与侧脑室隔离开来，使用微小锋利的镊子将大脑切成两个半球。旋转一个大脑半球，使切割线向上。
为了露出侧脑室，轻轻地将皮层从丘脑中拉开。将海马体缩回矢状中部切割线。现在可以看到侧脑室，脉络丛位于心室底部。
如有必要，用锋利的镊子拉开结缔组织，稍微打开心室。使用微小锋利的镊子轻轻地将脉络丛从心室壁上撕下。为了进行SEM的样品制备，将新鲜分离的脉络丛转移到新鲜的固定溶液中，并在4摄氏度下孵育过夜。
完成后，使用三至五毫升0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液洗涤样品三次，每次洗涤五分钟。将样品固定在 3 至 5 毫升 2% 四氧化锇的 0.1 摩尔二甲胂酸钠缓冲液中 30 分钟。然后用三到五毫升的超纯水洗涤样品三次，每次五分钟。
接下来，以增加的冰冷乙醇浓度系列使样品脱水，每乙醇溶液15分钟。使用临界点干燥器正确干燥样品。用碳贴纸将样品小心地放在试样支架上，并使用 SEM 可视化脉络丛样品。
本协议有助于从小鼠脑侧脑室和第四脑室有效地分离脉络丛。溴酚蓝灌注导致脉络丛的可视化。当溴酚蓝不允许在进一步的处理步骤中用PBS-肝素灌注或不进行灌注进行处理时。
脉络丛上皮或CPE细胞表面的SEM形态学分析清楚地显示了第四脑室的两臂结构和与侧脑室隔离的外侧脉络丛的典型C形形式。较高的SEM放大率揭示了CPE细胞顶端侧和微绒毛的囊泡样结构，表明可以使用SEM研究CPE细胞在疾病条件下的形态变化。重要的是只接触和取出脉络丛组织，以免周围组织污染样品。
谨慎使用，以保持脉络丛的结构。各种下游技术可以应用于分离的脉络丛，以研究其结构和功能，从显微镜分析到转录组分析再到流式细胞术。将脉络丛从大脑中显微解剖，使我们能够更好地了解这种微小脑组织的结构和功能。
这些知识对于更好地了解其在神经系统疾病中的作用至关重要。
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概述
本文详细介绍了一种从小鼠脑室中分离脉络丛（CP）的显微解剖技术，以及利用扫描电子显微镜（SEM）来检查其细胞结构。了解CP的结构和功能对神经科学至关重要，特别是关于其在中枢神经系统健康和疾病中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经解剖学
- 细胞生物学
背景
- 脉络丛是一个重要但研究不足的组织。
- 它在中枢神经系统的健康和病理中起着关键作用。
- 有效分离和表征CP对于理解神经系统疾病具有重要意义。
研究目的
- 开发一种可靠的方法从小鼠脑室中分离脉络丛。
- 通过扫描电子显微镜检查脉络丛的细胞结构。
- 在分离过程中保持脉络丛的活力和完整性。
使用的方法
- 研究采用显微解剖技术来分离脉络丛。
- 在分离过程中使用小鼠模型，特别关注第四脑室和侧脑室。
- 该方法包括终末麻醉、手术程序和SEM分析的固定。
- 关键步骤包括使用溴酚蓝染色以增强可视化，以及细致的处理以避免污染。
主要结果
- 该协议有效地分离了脉络丛，使通过SEM进行形态分析成为可能。
- 观察结果揭示了脉络丛上皮细胞的明确结构特征，包括微绒毛和囊泡样结构。
- 这些发现为随后在细胞水平上研究与疾病相关的改变提供了基础。
结论
- 本研究展示了一种用于分离脉络丛进行详细结构分析的简化方法。
- 获得的见解可以增强对CP在神经健康和疾病中的作用的理解。
- 总体而言，该方法使研究这个至关重要但常被忽视的脑部组成部分取得了重大进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient microdissection and SEM visualization of the mouse choroid plexus (CP) enable high-fidelity structural and functional analysis of this critical CNS interface. This workflow supports early discovery efforts by providing uncontaminated, viable CP tissue for downstream molecular and morphological studies, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in neurobiological research. Reliable CP isolation underpins translational continuity for CNS disease models and biomarker exploration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of CP structure and function for target validation in CNS research.
- Supports mechanistic de-risking by preserving tissue viability and minimizing contamination.
- Facilitates predictive confidence in early-stage neurobiological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated CP tissue for quantitative downstream assays, including transcriptomics and proteomics.
- Ensures reproducibility and standardization by maintaining structural integrity during isolation.
- Prepares samples suitable for high-resolution imaging and scalable analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables investigation of disease-relevant morphological changes in CP epithelial cells using SEM.
- Supports alignment of preclinical models with human CNS disease mechanisms.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural findings to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This microdissection and SEM protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing foundational tissue samples for molecular, cellular, and imaging analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating uncontaminated CP tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples for reproducible quantitative measurements.
- Analytics: Enables high-resolution morphological readouts and comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling disease-relevant structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, standardization, and scalability in tissue preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and SEM sample preparation.
- Needs access to perfusion equipment, fixation reagents, and electron microscopy infrastructure.
- Demands strict cross-team standardization to avoid tissue contamination.
- Adaptable to other species with protocol modifications as needed.
- Careful handling is essential to preserve CP structure and downstream analytical quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Microdissection of the Choroid Plexus Out of the Lateral and Fourth Ventricle
3:47
Morphological Analysis of Choroid Plexus Tissue Using Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:48
Results: Isolation of Choroid Plexus and Analysis of Cellular Structure
5:49
Conclusion
