小鼠脉络丛的显微切割和全安装扫描电子显微镜可视化

为了更好地了解脉络丛的组成和结构，将脉络丛从脑室中分离出来的有效方法是宝贵的第一步。通过这种显微切割技术，可以将脉络丛从脑室中解剖出来，同时包含其功能、活力和结构，而不会用周围组织污染脉络丛。脉络丛分离的一个重大障碍是识别结构，因为它仍然漂浮在脑室中。

用溴酚蓝染色脉络丛有助于分离。演示该程序的将是我们的实验室经理Elien Van Wonterghem。首先准备终末麻醉液、经心灌注溶液、扫描电子显微镜所需的溶液（SEM）以及文中提到的其他溶液。

为了隔离小鼠大脑，将终末麻醉动物置于背褥位置，并通过将四肢固定在板上来固定小鼠。通过喷洒70%乙醇对胸部进行消毒，然后使用碳钢手术刀片在横膈膜下方切开约4厘米的切口。打开皮肤，用手术剪刀露出胸部。

将横膈膜完全切开并分开胸部，露出肺部和跳动的心脏。使用灌注泵经心以每分钟4.5毫升的速度向小鼠灌注10毫升灌注溶液。在左心室插入 26 号针头，将溶液泵入全身回路。

使用手术剪刀，切开右心房，使血液脱离循环。斩首后，通过从耳朵之间到眼睛上方的切口切开头皮。横向拉动皮肤以露出头骨。

然后沿着鳞状缝合线向鼻部切开颅骨。完成后，将大脑放入冰冷的培养皿中，并向脑组织中添加一毫升冰冷的PBS。为了隔离漂浮在第四脑室中的脉络丛，用手术刀轻轻地切断小脑与大脑的联系。

从小脑中取出剩余的脑干组织部分。旋转大脑，使切割线朝上，确保第四脑室腔在切片中间可见，脉络丛位于背侧。如有必要，用锋利的镊子拉动结缔组织来打开心室。

使用微小锋利的镊子轻轻地将脉络丛从心室壁上撕下。为了将脉络丛与侧脑室隔离开来，使用微小锋利的镊子将大脑切成两个半球。旋转一个大脑半球，使切割线向上。

为了露出侧脑室，轻轻地将皮层从丘脑中拉开。将海马体缩回矢状中部切割线。现在可以看到侧脑室，脉络丛位于心室底部。

如有必要，用锋利的镊子拉开结缔组织，稍微打开心室。使用微小锋利的镊子轻轻地将脉络丛从心室壁上撕下。为了进行SEM的样品制备，将新鲜分离的脉络丛转移到新鲜的固定溶液中，并在4摄氏度下孵育过夜。

完成后，使用三至五毫升0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液洗涤样品三次，每次洗涤五分钟。将样品固定在 3 至 5 毫升 2% 四氧化锇的 0.1 摩尔二甲胂酸钠缓冲液中 30 分钟。然后用三到五毫升的超纯水洗涤样品三次，每次五分钟。

接下来，以增加的冰冷乙醇浓度系列使样品脱水，每乙醇溶液15分钟。使用临界点干燥器正确干燥样品。用碳贴纸将样品小心地放在试样支架上，并使用 SEM 可视化脉络丛样品。

本协议有助于从小鼠脑侧脑室和第四脑室有效地分离脉络丛。溴酚蓝灌注导致脉络丛的可视化。当溴酚蓝不允许在进一步的处理步骤中用PBS-肝素灌注或不进行灌注进行处理时。

脉络丛上皮或CPE细胞表面的SEM形态学分析清楚地显示了第四脑室的两臂结构和与侧脑室隔离的外侧脉络丛的典型C形形式。较高的SEM放大率揭示了CPE细胞顶端侧和微绒毛的囊泡样结构，表明可以使用SEM研究CPE细胞在疾病条件下的形态变化。重要的是只接触和取出脉络丛组织，以免周围组织污染样品。

谨慎使用，以保持脉络丛的结构。各种下游技术可以应用于分离的脉络丛，以研究其结构和功能，从显微镜分析到转录组分析再到流式细胞术。将脉络丛从大脑中显微解剖，使我们能够更好地了解这种微小脑组织的结构和功能。

这些知识对于更好地了解其在神经系统疾病中的作用至关重要。