利用荧光 原位 杂交探索卵巢细胞中的X染色体畸变

对患有X染色体畸变的女性卵巢细胞进行FISH分析是一种独特的技术，可以深入了解该特定组中卵巢细胞的X染色体含量。这些技术可能有助于更多地了解X染色体畸变女性的生殖潜力。值得一提的是，这两种方法都是为了促进未来的研究，而不是为了在临床实践中用作诊断工具而设计的。

演示该程序的将是，我们生育实验室的高级研究员Ronald Peek和我们病理部门的分析师Milad Intezar。首先，使用手术刀将冷冻保存或解冻的卵巢皮层组织切成一毫米一毫米的小块。在37摄氏度下酶消化四升预热L15中的组织碎片75分钟。

每 15 分钟上下移取一次消化混合物。通过添加四毫升补充有10%胎牛血清或FBS的冷L15来停止酶消化。用8毫升冷L15培养基以500g离心洗涤解离的组织一次，然后重新悬浮在500微升L15培养基中。

将含有大部分单个基质细胞和小卵泡的细胞悬液转移到塑料培养皿中，并在体视显微镜下检查悬浮液。使用75微米的塑料移液管手动挑选小于50微米的卵泡，并将它们转移到补充有10%FBS的L15培养基的液滴中，温度为4摄氏度。然后将纯化的卵泡转移到0.06%胰蛋白酶，每毫升EDTA1毫克和每毫升葡萄糖1毫克的溶液中，并在37摄氏度下孵育20分钟。

孵育后，使用75微米塑料移液管从皮质细胞悬液中获得卵巢基质细胞。对于单个卵巢细胞的荧光原位杂交或FISH分析，将处理过的带有胰蛋白酶/ EDTA /葡萄糖或基质细胞的卵巢卵泡转移到5微升0.15毫摩尔氯化钾和15微升DPBS的液滴上载玻片，并在37摄氏度下孵育20分钟。干燥并将载玻片预先固定在 300 微升 0.05 毫摩尔氯化钾、7.5% 乙酸和 22.5% 甲醇中两分钟。

用三比一甲醇乙酸覆盖载玻片两分钟以完成固定。固定后，在73摄氏度下在新制备的SSC中洗涤样品两次。用100微升2%蛋白酶K盖住，并用盖玻片密封。

将载玻片在37摄氏度下在杂交站中孵育10分钟。孵育后，取下盖玻片，并在室温下振荡下在DPBS中洗涤载玻片5分钟。用1%甲醛固定样品五分钟。

然后在DPBS中洗涤载玻片，并以增加的乙醇浓度连续脱水两分钟。在与荧光标记的探针杂交之前，风干样品。接下来，向样品中加入1微升CEPX，1微升CEP18和18微升杂交缓冲液，并用粘在载玻片上的盖玻片密封。

将载玻片转移到杂交站，在73摄氏度下变性三分钟，然后在37摄氏度下孵育过夜。杂交后，从载玻片上取下盖玻片和任何剩余的胶水。在 0.4X SSC、0.3% 吐温-20 在 72 摄氏度下洗涤载玻片两分钟，然后在 2X SSC 和 0.1% 吐温-20 中孵育一分钟。

如图所示使载玻片脱水，并在黑暗中风干，然后用含有DAPI的封片剂覆盖。将载玻片置于零下20摄氏度下10分钟，然后通过荧光显微镜进行分析。要杂交石蜡切片，请在包含石蜡碳带卵泡的切片之前或之后选择新切片。

将一部分安装在载玻片上，然后在 45 摄氏度的炉子上干燥 56 分钟。将切片在二甲苯中脱蜡10分钟，然后将载玻片浸入99.5%乙醇中，并在自来水中冲洗5分钟。用目标检索溶液在96摄氏度下预处理载玻片10分钟。

冷却后，用蒸馏水冲洗载玻片。用0.01摩尔盐酸处理载玻片5分钟，然后在37摄氏度下消化胃蛋白酶15分钟。再次用盐酸冲洗载玻片，随后在PBS中冲洗载玻片。

将载玻片固定在 1% 甲醛 PBS 中五分钟。然后在PBS中短暂冲洗载玻片，然后在99.5%乙醇中脱水之前再次在软化水中冲洗载玻片。在预处理的载玻片上涂抹五微升探针CEP18和CEPX。

然后涂上盖玻片并用照片胶密封该区域。将载玻片放入杂交器中，在80摄氏度下变性10分钟，在37摄氏度下杂交过夜。第二天，在 42 摄氏度的 SSC 中冲洗载玻片两次，每次五分钟，然后在 0.3% Nonidet P-40 中以 73 摄氏度冲洗两分钟和一分钟。

再次，在2X SSC中冲洗载玻片，然后在蒸馏水中冲洗，然后用99.5%乙醇脱水。风干载玻片，并将其安装在含DAPI的安装介质中。患者A的冷冻保存卵巢皮层组织显示50%的淋巴细胞，具有45，X核型，50%具有46，XX.In 患者B，38%的淋巴细胞为45，X，28%为46，XX和34%为47，XXX。

还分析了周围的基质细胞的X染色体含量。卵巢皮层组织的酶消化导致大部分解离细胞的悬浮液，但留下原始卵泡，由被单层肉芽细胞包围的完整卵母细胞组成。由于颗粒细胞的聚集，小卵泡在FISH后解释信号提供了困难。

在FISH之前用胰蛋白酶对卵泡进行额外消化导致单个颗粒病细胞在卵泡表面收缩成球形形态。苏木精伊红染色显示异种移植5个月后卵巢皮层组织中的二级和窦卵泡形态正常。通过FISH分析测定这些卵泡的颗粒病细胞的X染色体含量。

将移植的卵巢皮层组织固定在Bouin溶液中，由于绿色雾霾，滤泡细胞中的荧光信号模糊且在很大程度上模糊。相比之下，固定在甲醛中的卵巢皮层组织提供了极好的荧光信号。该方案的主要挑战在于卵巢细胞的分离和组织的酶消化。

在此过程中，偏离此协议会导致卵巢细胞大量损失，对于已经卵巢储备较低的女性，应特别避免这种情况。额外的基因表达谱可能有助于更多地了解非整倍体卵巢细胞对卵泡生成的影响，从而了解X染色体畸变女性卵巢早衰的过程。