小鼠卵巢表观基因组与转录组的细胞特异性成对解析

该方法提供了一种无需细胞分选即可从同一只小鼠的特定卵巢细胞群体中分离核酸的技术。该技术有助于识别特定细胞群体在多种条件下如何发生变化，例如在衰老过程中。

该技术的主要优势在于，无需进行细胞分选，即可对特定的卵巢细胞类型进行配对的表观基因组和转录组分析。这显著提高了通量，降低了成本，并在对卵巢组织进行细胞类型特异性分析时，消除了对专用设备的需求。本研究的目标是鉴定在生殖衰老发生之前，伴随卵巢老化而出现的细胞类型特异性变化，这些发现对于治疗女性不孕症具有重要意义。

该方法可应用于体内各种细胞类型，前提是存在针对该细胞类型的特异性Cre驱动工具。该技术中最困难的部分是为感兴趣的细胞类型选择合适的Cre品系。建议对细胞特异性进行充分验证。

首先，将安乐死小鼠的一个卵巢放入含有 500 微升细胞核裂解缓冲液的容器中，并使用自开式显微剪刀在缓冲液内将卵巢切成八部分。将剪碎的卵巢和裂解缓冲液转移至冰上预冷的玻璃Dounce匀浆器中，先用松头研杵A匀浆10至20次。向Dounce匀浆器中加入400微升裂解缓冲液以冲洗研杵A，随后使用紧头研杵B再匀浆10至20次。将匀浆液转移至一个2毫升圆底离心管中，在4摄氏度下以200 ×g离心1.5分钟，以去除未解离的组织和血管。

用 100 微升裂解缓冲液预润湿 30 微米细胞滤筛后，将上清液通过滤筛过滤至 15 毫升锥形管中。将含有细胞核的混合物转移至 2 毫升圆底管中。在 4 摄氏度下以 500 ×g 离心 5 分钟，弃去上清液。

将细胞核沉淀物重悬于250微升预冷的裂解缓冲液中，通过涡旋振荡短暂混匀，速度为中等至高速。加入1.5毫升裂解缓冲液，使总体积达到1.75毫升。轻轻混匀后，将细胞核悬液置于冰上静置5分钟。

在4°C条件下，以500 × g离心5分钟，使细胞核沉淀。小心弃去上清液，注意不要扰动细胞核沉淀。加入200 µL预冷的储存缓冲液重悬沉淀，并短暂涡旋，以充分重悬细胞核沉淀。

将重悬后沉淀物的10%保留作为输入核样，用于后续分析。取重悬的细胞核沉淀，用预冷的细胞核纯化缓冲液（NPB）定容至2毫升。将每个样本30微升的重悬磁珠加入2毫升圆底离心管中。

然后加入1 mL NPB，用移液器充分重悬。将离心管置于磁力架上1分钟，使磁珠分离。弃去上清液，并将离心管从磁力架上取下。

将洗涤后的磁珠重悬于1毫升NPB中。重复洗涤步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于初始体积的NPB中。

将30微升洗涤后的磁珠加入2毫升核悬液中，通过移液和轻轻倒置离心管充分重悬磁珠与核的混合物。将离心管置于冷室或冰箱中的旋转混合仪上，以低速旋转30分钟；同时，在相同条件下孵育未加磁珠的输入样品。将含有核悬液和磁珠的离心管置于磁力架上3分钟，以分离与链霉亲和素磁珠结合的生物素标记核与阴性核组分。

弃去上清液。将阴性组分转移至新的2毫升离心管中，并置于冰上保存。对于每个阳性组分管，从磁铁上取下离心管，加入1毫升NPB重悬沉淀物。

将离心管置于磁力架上静置一分钟，弃去上清液。将阳性组分磁珠与细胞核的混合物重悬于30微升NPB中。将卵巢组织和100微升匀浆缓冲液转移至玻璃Dounce匀浆器中，使用松散的A型研杵匀浆10至20次。向洗涤用A型研杵中加入400微升TRAP匀浆缓冲液，并将匀浆液转移至2毫升圆底离心管中。

用额外的一毫升TRAP裂解缓冲液冲洗匀浆器，并将冲洗液转移至2毫升圆底离心管中。在4°C条件下，以12,000 g离心10分钟，然后将澄清的上清液转移至新的2毫升圆底离心管中。

弃去沉淀后，将100微升澄清裂解液转移至新的2毫升圆底离心管中，置于冰上作为输入样品保留。将剩余的澄清裂解液与5微克/毫升抗GFP抗体在4摄氏度下旋转孵育1小时（使用翻转混匀仪）。输入样品在相同条件下孵育。

每个样品取50微升蛋白G磁珠，转移至一个2毫升圆底离心管中。向磁珠中加入500微升低盐洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀。将离心管放入磁力架中静置1分钟，使磁珠吸附至管壁一侧。

弃去上清液后，将离心管从磁力架上取下，并向管中加入一毫升低盐洗涤缓冲液。轻轻吹打混匀。再次将离心管放入磁力架中，重复此步骤，共洗涤三次。

最后一次洗涤后，将磁珠重悬于初始体积的低盐洗涤缓冲液中。将重悬后的洗涤磁珠转移至抗原样品与抗体的混合物中，在4°C条件下于翻转混合仪中旋转孵育过夜。同时，将输入样品在相同条件下孵育过夜。

随后，将样品置于磁力架上 2.5 至 3 分钟，分离带有目标核糖体 RNA 的阳性组分或磁珠与阴性组分（即上清液）。吸除阴性组分，将其转移至一个新的 2 毫升圆底离心管中，并置于冰上备用。

向含有阳性组分的离心管中加入 500 微升高盐洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀。将离心管置于冰上预冷的磁力架上静置 1 分钟，使磁珠充分分离。弃去上清液后，将离心管从磁力架上取下，重复该步骤，共洗涤三次。

最后一次洗涤后，将磁珠重悬于 350 微升 RNA 裂解缓冲液中，该缓冲液中已添加 3.5 微升 2-巯基乙醇。将离心管置于数字摇床中，在室温下以 900 RPM 混合孵育 10 分钟。使用磁力架在室温下静置 1 分钟，使磁珠与含有目标核糖体 RNA 的溶液分离。

将洗脱的阳性组分收集到一个新的1.5毫升离心管中。对Cyp17-Cre阳性NuTRAP flox和Cyp17-Cre阴性NuTRAP flox小鼠的石蜡包埋卵巢组织进行免疫荧光成像。EGFP蛋白使用山羊抗GFP一抗和Alexa 488标记的驴抗山羊二抗进行染色，细胞核用DAPI染色。

在荧光显微镜下以 20 倍放大倍数拍摄图像。从 Cyp17-Cre 阳性的 NuTRAP flox 小鼠卵巢中分离出输入样本和 TRAP 阳性组分的 RNA，并进行双端测序。对所有表达基因进行的主成分分析显示，TRAP 输入组分与阳性组分在第一主成分上明显分离。

此处展示了输入组与阳性组之间差异表达基因的火山图。将TRAP阳性组分与输入组进行比较，结果显示TRAP阳性组分中基质/卵泡膜细胞标志基因整体富集，而卵母细胞、颗粒细胞、免疫细胞及平滑肌细胞的标志基因则减少。在对核悬液进行第一次离心以去除未解离的血管后，细胞核存在于上清液中。

此时务必保留上清液，弃去沉淀。采用完整细胞核方法后，可进行多种表观基因组学技术，包括染色质可及性检测或DNA修饰分析等。采用TRAP方法后，可进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）或RNA测序，以评估翻译组。

这是首次在小鼠卵巢中应用NuTRAP方法。该方法能够对特定的卵巢细胞类型进行高通量的表观基因组和转录组分析，可用于研究卵巢衰老或癌症。