Name: 小鼠卵巢表观基因组和转录组的细胞特异性配对询问 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: 了解优化TRAP和INTACT方法用于小鼠卵巢细胞特异性表观基因组与转录组配对分析的技术。该方法无需细胞分选即可从同一小鼠获取特定卵巢细胞群体的核酸，有助于研究卵巢衰老相关的细胞类型特异性变化，为女性生殖健康研究提供重要工具。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）（R01AG070035、R01AG069742、T32AG052363）、BrightFocus基金会（M2020207）以及长老会健康基金会的资助。部分研究还得到了美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与发展服务的MERIT奖（I01BX003906）和共享设备评估计划（ShEEP）奖（ISIBX004797）的支持。作者还要感谢临床基因组中心（OMRF）和影像核心设施（OMRF）在技术协助和仪器使用方面提供的支持。

所有动物实验程序均获得俄克拉荷马医学研究基金会（OMRF）机构动物护理和使用委员会的批准。亲代小鼠购自杰克逊实验室（缅因州巴尔港），并在OMRF的高效微粒空气（HEPA）屏障环境中，于14小时光照/10小时黑暗循环（光照开启时间为早上6:00）的无特定病原体（SPF）条件下饲养和繁殖。
注意：在本实验中，我们使用雄性 Cyp17iCre+/−（品系编号 #028547，杰克逊实验室）与雌性 NuTRAP 小鼠（品系编号 #029899，杰克逊实验室）进行配对。目标子代 Cyp17-NuTRAP 小鼠（Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT）将在卵巢间质细胞中，在Cyp17a1&#160;启动子的调控下表达 NuTRAP 等位基因。本研究使用 4 月龄的雌性 Cyp17-NuTRAP 小鼠（n = 4）。从小鼠耳组织样本中提取 DNA 进行基因型鉴定，以确认 Cyp17iCre 和 NuTRAP 转基因的遗传，并通过 PCR 检测：1）通用 Cre，2）Cyp17iCre，以及 3）NuTRAP floxed 等位基因，所用引物列于材料表中，方法如前所述7,8。
1. 小鼠卵巢解剖
<ol>
	<li>根据机构的动物护理指南和批准程序实施小鼠安乐死，随后收集卵巢。</li>
	<li>解剖卵巢，去除可能附着在卵巢组织上的脂肪组织或输卵管部分，然后将卵巢放入含有缓冲液的离心管中。立即进行TRAP或INTACT实验操作。 
	注意：本方案尚未针对冷冻组织进行优化。建议同一小鼠的两个卵巢分别用于两种不同技术，以便后续进行统计学分析。</li>
</ol>
2. 从特定卵巢细胞类型中分离细胞核
<ol>
	<li>缓冲液配制
	<ol>
		<li>核纯化缓冲液（NPB）：配制100 mL NPB，需混合2 mL 1 M HEPES（终浓度：20 mM HEPES）、0.8 mL 5 M NaCl（40 mM NaCl）、4.5 mL 2 M KCl（90 mM KCl）、0.4 mL 0.5 M EDTA（2 mM EDTA）、0.1 mL 0.5 M EGTA（0.5 mM EGTA）以及92.2 mL无核酸酶水。在核分离当天加入1×蛋白酶抑制剂。
		 
		注意：NPB可提前配制（不含蛋白酶抑制剂），于4 °C保存，最长可稳定3周。</li>
		<li>核裂解缓冲液（完全型）：在核分离当天向核裂解缓冲液中加入1×蛋白酶抑制剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备核悬液 
	注意：除非另有说明，样品应始终置于冰上。
	<ol>
		<li>取一只Cyp17-NuTRAP小鼠（或其他相关Cre-NuTRAP小鼠）的卵巢，置于500 µL完全型核裂解缓冲液中。使用自开式显微剪刀在缓冲液中将卵巢剪成八份。</li>
		<li>使用宽口移液吸头将剪碎的卵巢组织及500 µL裂解缓冲液转移至冰上的玻璃Dounce匀浆器中。用松散研杵A匀浆10–20次。向Dounce匀浆器中加入400 µL裂解缓冲液，冲洗研杵A。</li>
		<li>用紧密研杵B匀浆10–20次。加入1,000 µL裂解缓冲液，冲洗研杵B。将匀浆液（共1.9 mL）转移至2 mL圆底离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以200 × g离心1.5分钟，以去除未解离的组织和血管14。上清液中含有细胞核；弃去未解离组织的沉淀。</li>
		<li>用100 µL裂解缓冲液预润湿30 µm细胞筛网，将上清液过滤至15 mL锥形管中。随后将含核混合物转移至2 mL圆底离心管中。</li>
		<li>在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。沉淀即为细胞核。</li>
		<li>通过涡旋振荡（中高速，短时间）将核沉淀重悬于250 µL冰冻裂解缓冲液中。再加入1.5 mL裂解缓冲液，使总体积达到1.75 mL。轻轻混匀，将核悬液置于冰上静置5分钟。</li>
		<li>在4 °C下以500 × g离心5分钟使核沉淀。小心弃去上清液，避免扰动核沉淀。将沉淀重悬于200 µL冰冻保存缓冲液中，并短暂涡旋振荡，确保核沉淀完全重悬。</li>
		<li>保留重悬后沉淀的10%（20 µL）作为输入核样品，用于后续分析。</li>
		<li>取重悬的核沉淀，用冰冻NPB定容至2.0 mL。随后采用INTACT亲和纯化法分离标记的细胞核。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>特定细胞类型中标记核的分离（INTACT）
	<ol>
		<li>将链霉亲和素磁珠在原瓶中以中速涡旋振荡30秒，确保充分重悬。每份样品取30 µL重悬磁珠加入2 mL圆底离心管中（最多10份样品的磁珠可在同一管中洗涤），加入1 mL NPB，通过移液充分重悬。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上1分钟，使磁珠分离。弃去上清液，将离心管从磁力架上取下。用1 mL NPB重悬洗涤后的磁珠。</li>
		<li>重复洗涤步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于初始体积的NPB中（每份样品30 µL）。</li>
		<li>将30 µL洗涤后的磁珠加入第2.2.10步所得的2 mL核悬液中。通过移液和轻柔倒置离心管，充分重悬磁珠-核混合物。</li>
		<li>将离心管置于冷室或冰箱中的旋转混合仪上，低速旋转孵育30分钟。同时将输入样品（不含磁珠）在相同条件下孵育。</li>
		<li>将含核悬液和磁珠的离心管置于磁力架上，使与链霉亲和素磁珠结合的生物素化核（阳性组分）与未结合的核（阴性组分）分离。在磁力架上静置3分钟，使磁珠充分分离。</li>
		<li>弃去上清液，将阴性组分转移至新的2.0 mL离心管中，置于冰上保存。对于每管阳性组分，将离心管从磁力架上取下，用1 mL NPB重悬其中内容物。</li>
		<li>将离心管置于磁力架上1分钟，弃去上清液。将离心管从磁力架上取下，用1 mL NPB重悬洗涤后的磁珠-核混合物。</li>
		<li>重复第2.3.8步，共洗涤三次。完成三次洗涤后，将阳性组分的磁珠-核混合物重悬于30 µL NPB中。</li>
		<li>对于每管阴性组分，将第2.3.7步所得的核悬液在4 °C下以500 × g离心7分钟。小心吸除并弃去上清液。将阴性组分的核沉淀重悬于30 µL NPB中。</li>
		<li>将输入样品（第2.2.9步）、阴性组分（第2.3.10步）和阳性组分（第2.3.9步）的核样品置于−80 °C冰箱中保存，直至进行核DNA或RNA提取。 
		注意：若后续实验需使用完整细胞核作为起始材料（如转座酶可及染色质检测、染色质免疫沉淀实验），则不应冷冻保存细胞核。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从特定卵巢细胞类型中分离 mRNA
<ol>
	<li>缓冲液的制备
	<ol>
		<li>TRAP缓冲液基础液：通过混合78.8 mL无RNase水、5 mL 1 M Tris-HCl（终浓度：50 mM Tris [pH 7.5]）、5 mL 2 M KCl（100 mM KCl）、1.2 mL 1 M MgCl2 （12 mM MgCl2）和10 mL 10% NP-40（1% NP-40），配制100 mL TRAP缓冲液基础液。4 °C保存，可保存最多1个月。</li>
		<li>高盐缓冲液基础液：通过混合68.8 mL无RNase水、5 mL 1 M Tris-HCl（终浓度：50 mM Tris [pH 7.5]）、15 mL 2 M KCl（300 mM KCl）、1.2 mL 1 M MgCl2 （12 mM MgCl2）和10 mL 10% NP-40（1% NP-40），配制100 mL高盐缓冲液基础液。4 °C保存，可保存最多1个月。</li>
		<li>TRAP匀浆缓冲液（完全）：在组织采集当天，每份样品配制1.5 mL。通过将10 mL TRAP缓冲液基础液（来自步骤3.1.1）与10 µL 100 mg/mL环己酰亚胺（终浓度：100 µg/mL环己酰亚胺）、10 mg肝素钠（1 mg/mL肝素钠）、20 µL 0.5 M DTT（1 mM DTT）、50 µL 40 U/µL RNase抑制剂（200 U/mL RNase抑制剂）、200 µL 0.1 M亚精胺（2 mM亚精胺）以及一片无EDTA蛋白酶抑制剂片剂（1×）混合，配制10 mL TRAP匀浆缓冲液。</li>
		<li>低盐洗涤缓冲液（完全）：在组织采集当天，每份样品配制1.5 mL。通过将10 mL TRAP缓冲液基础液（来自步骤3.1.1）与10 µL 100 mg/mL环己酰亚胺（100 µg/mL环己酰亚胺）和20 µL 0.5 M DTT（1 mM DTT）混合，配制10 mL低盐洗涤缓冲液。</li>
		<li>高盐洗涤缓冲液（完全）：在TRAP分离的第二天，每份样品配制1.5 mL。通过将10 mL高盐缓冲液基础液（来自步骤3.1.2）与10 µL 100 mg/mL环己酰亚胺和20 µL 0.5 M DTT混合，配制10 mL高盐洗涤缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行翻译核糖体亲和纯化（TRAP）
	<ol>
		<li>从Cyp17-NuTRAP小鼠（或其他相应的Cre-NuTRAP小鼠）中取出另一侧卵巢，放入含有100 µL冰上预冷的TRAP匀浆缓冲液（来自步骤3.1.3）的1.5 mL无RNase管中。在缓冲液内使用自开式显微剪刀将卵巢切成八部分。</li>
		<li>使用宽口吸头将卵巢和100 µL匀浆缓冲液转移至玻璃Dounce匀浆器中。用松散的杵A匀浆10–20次。加入400 µL TRAP匀浆缓冲液，冲洗杵A。</li>
		<li>将匀浆液转移至2 mL圆底管中。用额外1 mL TRAP匀浆缓冲液冲洗Dounce匀浆器，并将冲洗液转移至2 mL圆底管中。</li>
		<li>在4 °C下以12,000 × g离心匀浆液10分钟。将澄清的上清液转移至新的2 mL圆底管中。弃去沉淀。</li>
		<li>将100 µL澄清匀浆液转移至新的2 mL圆底管中，作为输入样品置于冰上保留。</li>
		<li>将剩余的澄清匀浆液（来自步骤3.2.4）与抗GFP抗体（5 µg/mL）在4 °C下旋转孵育1小时（端对端旋转）。输入样品在相同条件下孵育。</li>
		<li>在孵育的最后15分钟内，使用以下步骤（3.2.8–3.2.11）用低盐洗涤缓冲液洗涤蛋白G磁珠。</li>
		<li>将蛋白G磁珠小瓶涡旋振荡30秒，使其完全重悬。每份样品取50 µL蛋白G磁珠（最多10份样品可在同一管中洗涤），转移至2 mL圆底管中。</li>
		<li>向磁珠中加入500 µL低盐洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀。将管子放入磁力架中1分钟，使磁珠吸附至管壁。吸弃上清液。</li>
		<li>将管子从磁力架中取出，向管中加入1 mL低盐洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀。将管子放入磁力架中1分钟，使磁珠吸附至管壁。吸弃上清液。</li>
		<li>重复步骤3.2.10，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将管子从磁力架中取出，用初始体积的低盐洗涤缓冲液（每份样品50 µL）重悬磁珠。</li>
		<li>将重悬后的洗涤磁珠（50 µL）转移至抗原样品/抗体混合物中，在4 °C下过夜孵育，同时在端对端旋转混合器中旋转。输入样品同样在4 °C下端对端旋转过夜，以保持条件一致。</li>
		<li>过夜孵育后，将管子从旋转器中取出，使用磁力架静置2.5–3分钟，分离结合目标核糖体/RNA的磁珠（阳性组分）与上清液（阴性组分）。吸弃阴性组分，将其转移至新的2 mL圆底管中，置于冰上备用，同时处理阳性组分。</li>
		<li>向含有阳性组分的管中加入500 µL高盐洗涤缓冲液（来自步骤3.1.5），轻轻吹打混匀。将管子置于冰上的磁力架中1分钟，使磁珠分离。弃去上清液，将管子从磁铁上取下。</li>
		<li>重复步骤3.2.14，共洗涤三次。最后一次洗涤后，用350 µL RNA裂解缓冲液（补充3.5 µL 2-巯基乙醇（BME））重悬磁珠。在室温下以900 rpm在数字摇床中混匀10分钟。</li>
		<li>在室温下使用磁力架静置1分钟，将磁珠与含有目标核糖体/RNA的溶液分离。将洗脱的阳性组分（上清液）收集至新的1.5 mL离心管中，加入350 µL 100%乙醇。颠倒混匀。进行RNA提取。</li>
		<li>可选：为从输入样品（步骤3.2.5）和阴性组分（步骤3.2.13）中提取RNA，将100 µL输入样品和阴性组分分别转移至新的1.5 mL离心管中。向每个样品中加入350 µL RNA裂解缓冲液（补充3.5 µL BME），颠倒混匀。向每管中加入250 µL 100%乙醇，颠倒混匀。进行RNA提取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA提取
	<ol>
		<li>将700 µL阳性组分以及可选的输入组分和/或阴性组分转移至RNA离心柱中。按照制造商说明书操作，从离心柱中提取RNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

NuTRAP 小鼠模型6&#160;是一种强大的转基因标记方法，可用于成对分析特定细胞类型的转录组和表观基因组，该方法可适应用于任何具有可用 Cre 驱动器的细胞类型。本文中，我们展示了 Cyp17-NuTRAP 小鼠模型在靶向卵巢鞘细胞和间质细胞方面的特异性。Cyp17-NuTRAP 模型可用于进一步阐明与卵巢衰老、癌症及疾病相关的鞘细胞和间质细胞特异性表观遗传机制。
在选择Cre驱动小鼠品系时，建议采用多种正交方法验证Cre介导的NuTRAP表达的细胞特异性。Cyp17a1-Cre为组成型表达。NuTRAP模型也可与可诱导型Cre品系杂交，以避免发育过程中非靶细胞内基因的瞬时表达。由于大多数卵巢细胞对激素波动高度敏感，还应考虑动情周期的分期17。
与传统细胞分选技术相比，NuTRAP 方法具有多种优势。首先，细胞分选技术依赖于单细胞悬液的制备，这可能导致细胞应激反应的诱导 离体 激活伪影<sup class="...

卵巢在体细胞衰老过程中起着关键作用1，其中特定细胞群体具有各自独特的贡献。由于卵巢具有高度的细胞异质性，因此难以解释来自整体卵巢组织批量检测的分子结果。明确特定细胞群体在卵巢衰老中的作用，是识别导致老年女性生育力下降及健康状况恶化的分子驱动因素的关键。传统上，对特定卵巢细胞类型的多组学评估依赖于激光显微切割2、单细胞技术3或细胞分选4等方法。然而，显微切割成本较高且操作困难，而细胞分选可能改变细胞的表型特征5。
一种评估卵巢细胞类型特异性表观基因组和转录组谱的新方法利用了核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）小鼠模型。NuTRAP模型能够在无需细胞分选的情况下，通过亲和纯化技术——翻译核糖体亲和纯化（TRAP）和特定细胞类型中标记细胞核的分离（INTACT）6，实现细胞类型特异性核酸的分离。NuTRAP等位基因的表达受一个两侧带有loxP位点的终止盒（floxed STOP cassette）调控，并可通过启动子特异性的Cre小鼠品系靶向特定的卵巢细胞类型。通过将NuTRAP小鼠与特定细胞类型的Cre小鼠杂交，可在Cre依赖的方式下移除STOP盒，从而使核糖体复合物被eGFP标记，细胞核被生物素/ mCherry标记6。随后可利用TRAP和INTACT技术从目标细胞类型中分离mRNA和核DNA，并进一步进行转录组和表观基因组分析。
NuTRAP 模型已应用于多种组织，如脂肪组织6、脑组织7,8,9和视网膜10，以揭示在全组织匀浆样本中可能无法检测到的细胞类型特异性表观基因组和转录组变化。与传统细胞分选技术相比，NuTRAP 方法具有以下优势：1）避免了离体（ex vivo）操作引起的激活假象8；2）减少了对专用设备（如细胞分选仪）的需求；3）提高了细胞类型特异性分析的通量并降低了成本。此外，从单只小鼠中分离出细胞类型特异性的 DNA 和 RNA，可实现配对分析，从而增强统计效能。鉴于近期研究提示卵巢间质细胞在驱动早衰表型中发挥重要作用11,12,13，我们利用 Cyp17a1-Cre 驱动系统将 NuTRAP 表达系统靶向定位于间质细胞和膜细胞。本文证明，NuTRAP 构建体的诱导表达特异性地发生在卵巢间质细胞和膜细胞中，并且从单侧卵巢即可获得足够用于测序研究的 DNA 和 RNA。本文所展示的 NuTRAP 模型及方法可与任何现有的 Cre 工具小鼠品系联用，以研究任意类型的卵巢细胞。
为了构建细胞类型特异性的卵巢 NuTRAP 小鼠品系，核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）等位基因包含一个两侧带有 loxP 位点的终止密码子（floxed STOP codon），用于调控 BirA、生物素连接酶识别肽（BLRP）标记的 mCherry/mRANGAP1 以及 eGFP/L10a 的表达。当该品系与特定细胞类型的 Cre 小鼠品系杂交后，NuTRAP 表达盒将以 Cre 依赖的方式，用生物素和 mCherry 标记核蛋白 mRANGAP1，同时用 eGFP 标记核糖体蛋白 L10a。这种方法使得无需细胞分选即可从特定细胞类型中分离出细胞核和 mRNA。通过将 NuTRAPflox/flox 与适用于卵巢细胞类型的细胞特异性 Cre 品系配对，可实现对这类细胞的特异性分析。

<table><tbody><tr><td>0.1 M 亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05292-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10% NP-40</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>100 mg/mL 放线菌酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;micro;m细胞滤器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab290</td><td>用于TRAP和免疫组化（兔多克隆抗GFP）</td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>方案中的RNA裂解缓冲液</td></tr><tr><td>cOmplete，mini，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td>TRAP 匀浆缓冲液</td></tr><tr><td>Cyp17iCre 小鼠模型</td><td>杰克逊实验室</td><td>28547</td><td>B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>基因分型引物</td><td>IDT</td><td>自定义</td><td>通用 Cre - 杰克逊实验室方案 22392，引物：oIMR1084、oIMR1085、oIMR7338、oIMR7339</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Cyp17iCre - 杰克逊实验室方案 30847，引物：21218、31704、31705、35663</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>NuTRAP - 杰克逊实验室方案 21509，引物：21306、24493、32625、32626</td></tr><tr><td>Halt蛋白酶抑制剂混合物（100X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1861278</td><td>NPB缓冲液</td></tr><tr><td>M-280 链霉亲和素 Dynabeads&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td>2.8 &amp;micro;m 微珠直径</td></tr><tr><td>MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>细胞核分离试剂盒：Nuclei EZ Prep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nuc101</td><td>包含细胞核裂解缓冲液和细胞核储存缓冲液</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>NuTRAP 小鼠模型</td><td>杰克逊实验室</td><td>29899</td><td>B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J</td></tr><tr><td>Pierce DTT 无需称量格式</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A39255</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabeads</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10004D</td><td>用于TRAP</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>钠肝素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2425</td><td></td></tr><tr><td>超纯 1 M Tris-HCl，pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>VWR 试管旋转仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9854190</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠卵巢表观基因组与转录组的细胞特异性成对解析

Cell-Specific Paired Interrogation of the Mouse Ovarian Epigenome and Transcriptome

评估细胞类型特异性的表观基因组和转录组变化对于理解卵巢衰老至关重要。为此，本研究优化了核糖体亲和纯化（TRAP）方法和特定细胞类型标记核分离（INTACT）方法，并利用一种新型的转基因NuTRAP小鼠模型，对卵巢中特定细胞的转录组和表观基因组进行配对分析。NuTRAP等位基因的表达受一个两侧带有loxP位点的STOP盒调控，可通过启动子特异性的Cre小鼠品系靶向特定的卵巢细胞类型。由于近期研究提示卵巢间质细胞在驱动早衰表型中发挥重要作用，本研究采用Cyp17a1-Cre驱动子将NuTRAP表达系统靶向至间质细胞。结果表明，NuTRAP构建体的诱导表达特异性地局限于卵巢间质成纤维细胞，并且从单个卵巢中即可获得足够量的DNA和RNA用于测序分析。本文所描述的NuTRAP模型及方法可与任何已有Cre品系的卵巢细胞类型联用，以开展相关研究。

TRAP 和 INTACT 方案的示意图见图1。此处通过 TRAP 分离 RNA 的免疫荧光成像和 RNA-Seq 结果，展示了 Cyp17-NuTRAP 小鼠模型对卵巢间质/膜细胞的特异性。首先，对卵巢中的 eGFP 信号进行免疫荧光成像，并确定 eGFP 信号定位于膜细胞和间质细胞。简言之，将 5 µm 厚的组织切片用二甲苯和乙醇梯度脱蜡。为了获得更强的 eGFP 信号，使用山羊抗 GFP 一抗和 Alexa 488 标记的驴抗山羊二抗对 eGFP 蛋白进行染色，细胞核则用 DAPI 染色15。在荧光显微镜下以 20 倍放大倍数采集图像（图2A）。接下来，对 4 月龄 Cyp17-NuTRAP 小鼠的卵巢进行 TRAP 操作，以特异性分离来自膜细胞/间质细胞的核糖体结合 RNA。将 TRAP 分离得到的 RNA（阳性组分）和全组织 RNA（输入样本）用于构建链特异性 RNA 测序文库，并在新一代测序仪上进行测序。RNA-Seq 数据的修剪、比对和标准化（DESeq2）...

在本实验方案中，利用 Cyp17a1-Cre 小鼠品系与 NuTRAP 小鼠模型杂交，优化了翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法和特定细胞类型标记核分离（INTACT）方法，以实现对细胞特异性卵巢转录组和表观基因组的联合分析。

评估细胞类型特异性的表观基因组和转录组变化对于理解卵巢衰老至关重要。为此，需优化……

该方法提供了一种无需细胞分选即可从同一只小鼠的特定卵巢细胞群体中分离核酸的技术。该技术有助于识别特定细胞群体在多种条件下如何发生变化，例如在衰老过程中。该技术的主要优势在于，无需进行细胞分选，即可对特定的卵巢细胞类型进行配对的表观基因组和转录组分析。这显著提高了通量，降低了成本，并在对卵巢组织进行细胞类型特异性分析时，消除了对专用设备的需求。本研究的目标是鉴定在生殖衰老发生之前，伴随卵巢老化而出现的细胞类型特异性变化，这些发现对于治疗女性不孕症具有重要意义。该方法可应用于体内各种细胞类型，前提是存在针对该细胞类型的特异性Cre驱动工具。该技术中最困难的部分是为感兴趣的细胞类型选择合适的Cre品系。建议对细胞特异性进行充分验证。首先，将安乐死小鼠的一个卵巢放入含有 500 微升细胞核裂解缓冲液的容器中，并使用自开式显微剪刀在缓冲液内将卵巢切成八部分。将剪碎的卵巢和裂解缓冲液转移至冰上预冷的玻璃Dounce匀浆器中，先用松头研杵A匀浆10至20次。向Dounce匀浆器中加入400微升裂解缓冲液以冲洗研杵A，随后使用紧头研杵B再匀浆10至20次。将匀浆液转移至一个2毫升圆底离心管中，在4摄氏度下以200 ×g离心1.5分钟，以去除未解离的组织和血管。用 100 微升裂解缓冲液预润湿 30 微米细胞滤筛后，将上清液通过滤筛过滤至 15 毫升锥形管中。将含有细胞核的混合物转移至 2 毫升圆底管中。在 4 摄氏度下以 500 ×g 离心 5 分钟，弃去上清液。将细胞核沉淀物重悬于250微升预冷的裂解缓冲液中，通过涡旋振荡短暂混匀，速度为中等至高速。加入1.5毫升裂解缓冲液，使总体积达到1.75毫升。轻轻混匀后，将细胞核悬液置于冰上静置5分钟。在4°C条件下，以500 × g离心5分钟，使细胞核沉淀。小心弃去上清液，注意不要扰动细胞核沉淀。加入200 µL预冷的储存缓冲液重悬沉淀，并短暂涡旋，以充分重悬细胞核沉淀。将重悬后沉淀物的10%保留作为输入核样，用于后续分析。取重悬的细胞核沉淀，用预冷的细胞核纯化缓冲液（NPB）定容至2毫升。将每个样本30微升的重悬磁珠加入2毫升圆底离心管中。然后加入1 mL NPB，用移液器充分重悬。将离心管置于磁力架上1分钟，使磁珠分离。弃去上清液，并将离心管从磁力架上取下。将洗涤后的磁珠重悬于1毫升NPB中。重复洗涤步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于初始体积的NPB中。将30微升洗涤后的磁珠加入2毫升核悬液中，通过移液和轻轻倒置离心管充分重悬磁珠与核的混合物。将离心管置于冷室或冰箱中的旋转混合仪上，以低速旋转30分钟；同时，在相同条件下孵育未加磁珠的输入样品。将含有核悬液和磁珠的离心管置于磁力架上3分钟，以分离与链霉亲和素磁珠结合的生物素标记核与阴性核组分。弃去上清液。将阴性组分转移至新的2毫升离心管中，并置于冰上保存。对于每个阳性组分管，从磁铁上取下离心管，加入1毫升NPB重悬沉淀物。将离心管置于磁力架上静置一分钟，弃去上清液。将阳性组分磁珠与细胞核的混合物重悬于30微升NPB中。将卵巢组织和100微升匀浆缓冲液转移至玻璃Dounce匀浆器中，使用松散的A型研杵匀浆10至20次。向洗涤用A型研杵中加入400微升TRAP匀浆缓冲液，并将匀浆液转移至2毫升圆底离心管中。用额外的一毫升TRAP裂解缓冲液冲洗匀浆器，并将冲洗液转移至2毫升圆底离心管中。在4°C条件下，以12,000 g离心10分钟，然后将澄清的上清液转移至新的2毫升圆底离心管中。弃去沉淀后，将100微升澄清裂解液转移至新的2毫升圆底离心管中，置于冰上作为输入样品保留。将剩余的澄清裂解液与5微克/毫升抗GFP抗体在4摄氏度下旋转孵育1小时（使用翻转混匀仪）。输入样品在相同条件下孵育。每个样品取50微升蛋白G磁珠，转移至一个2毫升圆底离心管中。向磁珠中加入500微升低盐洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀。将离心管放入磁力架中静置1分钟，使磁珠吸附至管壁一侧。弃去上清液后，将离心管从磁力架上取下，并向管中加入一毫升低盐洗涤缓冲液。轻轻吹打混匀。再次将离心管放入磁力架中，重复此步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于初始体积的低盐洗涤缓冲液中。将重悬后的洗涤磁珠转移至抗原样品与抗体的混合物中，在4°C条件下于翻转混合仪中旋转孵育过夜。同时，将输入样品在相同条件下孵育过夜。随后，将样品置于磁力架上 2.5 至 3 分钟，分离带有目标核糖体 RNA 的阳性组分或磁珠与阴性组分（即上清液）。吸除阴性组分，将其转移至一个新的 2 毫升圆底离心管中，并置于冰上备用。向含有阳性组分的离心管中加入 500 微升高盐洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀。将离心管置于冰上预冷的磁力架上静置 1 分钟，使磁珠充分分离。弃去上清液后，将离心管从磁力架上取下，重复该步骤，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于 350 微升 RNA 裂解缓冲液中，该缓冲液中已添加 3.5 微升 2-巯基乙醇。将离心管置于数字摇床中，在室温下以 900 RPM 混合孵育 10 分钟。使用磁力架在室温下静置 1 分钟，使磁珠与含有目标核糖体 RNA 的溶液分离。将洗脱的阳性组分收集到一个新的1.5毫升离心管中。对Cyp17-Cre阳性NuTRAP flox和Cyp17-Cre阴性NuTRAP flox小鼠的石蜡包埋卵巢组织进行免疫荧光成像。EGFP蛋白使用山羊抗GFP一抗和Alexa 488标记的驴抗山羊二抗进行染色，细胞核用DAPI染色。在荧光显微镜下以 20 倍放大倍数拍摄图像。从 Cyp17-Cre 阳性的 NuTRAP flox 小鼠卵巢中分离出输入样本和 TRAP 阳性组分的 RNA，并进行双端测序。对所有表达基因进行的主成分分析显示，TRAP 输入组分与阳性组分在第一主成分上明显分离。此处展示了输入组与阳性组之间差异表达基因的火山图。将TRAP阳性组分与输入组进行比较，结果显示TRAP阳性组分中基质/卵泡膜细胞标志基因整体富集，而卵母细胞、颗粒细胞、免疫细胞及平滑肌细胞的标志基因则减少。在对核悬液进行第一次离心以去除未解离的血管后，细胞核存在于上清液中。此时务必保留上清液，弃去沉淀。采用完整细胞核方法后，可进行多种表观基因组学技术，包括染色质可及性检测或DNA修饰分析等。采用TRAP方法后，可进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）或RNA测序，以评估翻译组。这是首次在小鼠卵巢中应用NuTRAP方法。该方法能够对特定的卵巢细胞类型进行高通量的表观基因组和转录组分析，可用于研究卵巢衰老或癌症。

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