采用多转染的细胞状态识别电路的快速开发
February 24th, 2023
复杂的基因回路在设计、测试和优化方面非常耗时。为了促进这一过程，哺乳动物细胞的转染方式允许在单个孔中测试电路组件的多个化学计量。该方案概述了实验计划、转染和数据分析的步骤。
我们的协议可以更容易、更快速地理解生物部件之间的关系。我们可以在单个孔中测试许多比率度量组合部件的行为。该技术使研究人员能够以比传统方法更高的实验效率更全面地表征电路组件之间的复杂关系。
该方法适用于合成生物学和任何生物学问题，探测细胞中的行为变化，以响应不同水平的转染基因，其中可以通过流式细胞术测量输出。通过搁置标记为无颜色对照、mKO2 对照、TagBFP 对照、霓虹绿对照、全色对照、多转染混合物一和多转染混合物二的 1.5 毫升微量离心管，开始为每个 DNA 聚集体制备试管。向无色对照、mKO2对照、TagBFP对照、霓虹绿对照和所有颜色对照管中加入36微升还原血清培养基，然后向每个多转染混合物一个和聚转染混合物两个管中加入18微升还原血清培养基。
接下来，向无色对照管中加入 600 ng 填充质粒，向 mKO2 颜色对照管中加入 300 ng mKO2 和 300 ng 填充质粒，并向 TagBFP 颜色对照管中加入 300 ng TagBFP 和 300 ng 填充质粒。向霓虹绿色对照管中，加入300纳克组成型霓虹绿和300纳克填充质粒，然后向全色对照管中加入每个mKO2，TagBFP，组成型霓虹绿和300纳克填充质粒100纳克。向多转染混合一管中，加入150纳克mKO2、75纳克报告霓虹绿质粒和75纳克填充质粒。
向多转染混合两管中，加入150纳克TagBFP、75纳克L7Ae质粒和75纳克填充质粒。完成后，将216微升还原血清培养基与9.48微升转染试剂混合，在1.5毫升微量离心管中创建转染预混液。在将其放在一边之前，通过上下移液充分混合。
向无颜色对照、单色对照和所有颜色对照管中加入1.58微升增强剂试剂，并向每个多转染混合管中加入79微升增强剂试剂。通过剧烈移液单独混合每个试管。将37.58微升转染预混液加入无色控管、单色对照管和全色控管中，剧烈移液混合。
接下来，向每个多转染混合管中加入18.79微升转染预混液，并用剧烈移液充分混合每个试管。将无色、单色和全色对照的每种转染混合物移液65.97微升，将转染混合物分液到孔中，然后将32.98微升多转染混合物一转移到多转染孔中，并通过快速但轻柔地在紧密中旋转板来有效地分配复合物， 沿着平坦的表面绘制图案，然后移液32.98微升的多转染将两个混合到相同的多转染孔中，并以相同的方式旋转板。孵育细胞两天。
进行流式细胞术以读取转染标记物的荧光并输出每个细胞的报告基因。与视频中显示的多转染不同，执行良好的共转染显示TagBFP和EYFP之间具有紧密的相关性，表达共递送的质粒。相比之下，执行不佳的共转染显示两个质粒之间的相关性较差。
执行良好的多转染显示出良好的二维空间覆盖率，并很好地补偿了荧光蛋白之间的任何光谱渗漏。活细胞数量较少的多转染数据很难细分到足够的活细胞箱中，每个活细胞箱中都有足够数量的细胞进行分析。转染效率差的多转染导致二维分析空间覆盖稀疏。
通过将阻遏蛋白L7Ae与mKO2和输出蛋白霓虹绿与TagBFP置于单独的转染混合物中来测试输出表达的有效DNA比率。然后监测不同水平的mKO2和TagBFP的霓虹绿表达。比较了该回路的共转染和多转染结果。
将11个单独的共转染结果整理到一个数据集中，并与多转染数据进行比较。L7Ae抑制输出报告基因的剂量反应曲线比较显示，共转染和多转染数据中每仓的中位数输出水平非常相似。验证了多转染在优化细胞类型分类器方面的成功应用。
存在于HeLa细胞和非HEK细胞中的micro RNA-21会敲低BM3R1的表达，因为BM3R1抑制电路输出mKO2的产生。当细胞中存在微小RNA 21时，mKO2表达将被打开。Gal4-VP16的量在低水平的BM3R1下调节mKO2表达。
每个电路组件都与不同的荧光标记物共同交付。这种多转染量化了每个细胞接收的每个电路组件的量。mKO2在MIR21中产生，产生HeLa细胞，但不在HEK细胞中产生。
在将这些电路元件用不同的荧光报告基因在单独的转染混合物中递送后，分析mKO2输出，以指示特定细胞接收的每个电路元件的量。该子样本预测，在该比率下，共转染电路在对HEK293与HeLa细胞进行分类时具有91%的特异性，62%的灵敏度和77%的准确度。该方案中最常见的痛点是每种转染混合物中缺乏紧密的相关性。
因此，请记住在加入增强剂试剂后立即大力混合转染管，然后在加入含脂质的转染混合物后温和地混合和移液转染管该程序中的遗传成分可以用任何其他遗传成分代替，以回答有关其在各种环境中的功能性能的问题。这种方法已经迅速发展了遗传回路，例如细胞分类器，反馈和前馈控制器，双稳态基序等等。
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概览
该协议通过允许在单个孔中测试多种电路组件的计量关系，简化了复杂遗传电路的设计和测试。研究人员可以高效地表征生物部分与其对转染基因不同水平响应行为之间的关系。
关键研究组成部分
科学领域
- 合成生物学
- 基因工程
- 细胞生物学
背景
- 复杂的遗传电路设计和优化具有挑战性。
- 传统方法通常耗时且效率较低。
- 流式细胞术可以测量转染基因的输出。
- 该协议旨在提高实验效率。
研究目的
- 促进多个遗传电路组件的测试。
- 提高对生物部分关系的理解。
- 实现对电路行为的全面表征。
使用的方法
- 用各种DNA聚集体转染哺乳动物细胞。
- 准备不同控制和混合的微离心管。
- 使用低血清培养基以获得最佳转染条件。
- 通过流式细胞术测量输出。
主要结果
- 在单个孔中高效测试多种计量关系。
- 加深对组件之间复杂关系的理解。
- 与传统方法相比，实验效率更高。
- 适用于各种生物学问题。
结论
- 该方法简化了遗传电路的设计和测试。
- 它允许对电路行为进行更全面的分析。
- 研究人员可以有效探索不同基因水平的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Poly-transfection enables rapid, high-throughput optimization of mammalian genetic circuits by allowing simultaneous testing of multiple DNA stoichiometries in a single well. This approach accelerates the design-build-test cycle for cell state identification circuits, supporting predictive confidence and functional target validation in early discovery. The method streamlines portfolio triage by providing robust quantitative data for complex synthetic biology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of genetic circuit component relationships in mammalian cells.
- Supports functional de-risking and target validation by quantifying circuit behavior across diverse stoichiometries.
- Facilitates rapid hypothesis testing for cell classifier and regulatory motif development.
- Provides actionable data for prioritizing circuit designs with optimal specificity and sensitivity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cell-based systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via flow cytometry for robust assay standardization.
- Enables high-throughput evaluation of circuit performance in a single-pot format.
- Supports scalable optimization of multi-component genetic constructs for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell state identification circuits with disease-relevant biomarkers for translational continuity.
- Provides quantitative specificity, sensitivity, and accuracy metrics for preclinical model selection.
- Reduces mechanistic ambiguity in circuit-driven cell classification and functional readouts.
- Supports risk-adjusted advancement of synthetic biology assets into preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
Poly-transfection integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid optimization of genetic circuits for downstream translational and preclinical workflows.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification by mapping circuit output to DNA input ratios.
- Screening: Provides reproducible, quantitative flow cytometry data for assay readiness and platform reuse.
- Analytics: Enables binning and statistical comparison of circuit performance across multiple conditions in a single experiment.
- Translational Research: Supports alignment of circuit outputs with disease-relevant cell states and biomarkers.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, generalizable workflow for rapid optimization of diverse genetic circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic circuit optimization.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable transfection and analysis workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of synthetic biology assets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and flow cytometry analysis.
- Demands access to high-throughput flow cytometry and robust data analytics infrastructure.
- Necessitates rigorous mixing and pipetting protocols to ensure reproducibility across transfection mixes.
- May require adaptation of fluorescent markers and circuit components for different cell types or model systems.
- Dependent on sufficient transfection efficiency and live cell numbers for robust statistical analysis.
