Name: 八紫布参胶囊对去卵巢大鼠的雌激素样作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 了解八紫布参胶囊在去卵巢大鼠模型中通过调控RANKL/OPG信号通路发挥雌激素样作用的实验方法。本研究结合Micro-CT成像与组织学分析，为绝经后骨健康治疗提供新思路。

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本工作得到中国工程院战略咨询项目（项目编号：2022-XY-45）“中医药抗衰老效应战略研究”、中国河北省自然科学基金（项目编号：2022106065）的资助，&amp;中国河北省 #38;T 计划（项目编号：22372502D）和高层次人才计划 S&amp;中国河北石家庄市“三三三人才工程”创新与创业人才项目（资助编号：07202203）。

动物实验经河北以岭医药研究院动物研究与伦理委员会批准（批准号：N2020150）。36只雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠（3月龄，体重180-200 g）（见材料表）饲养于河北以岭医药研究院新药评价中心，给予常规饲料和清洁饮水，饲养环境温度控制在20-26 °C，相对湿度为40%-70%，每日接受12小时人工光照。
1. 动物实验
<ol>
	<li>将大鼠随机分为六组：假手术组（SHAM组，10 mL/kg/d生理盐水）、模型组（OVX组，10 mL/kg/d生理盐水）、补佳乐15组（0.2 mg/kg/d）、低剂量BZBS组（BZBSL组，1 g/kg/d）、中剂量BZBS组（BZBSM组，2 g/kg/d）和高剂量BZBS组（BZBSH组，4 g/kg/d）。 
	注：BZBSM组的剂量根据人体推荐剂量换算得出，计算公式如下：大鼠等效实验剂量（mg/kg/d）= 人体剂量（mg/kg）/ 体重（60 kg）× 6.3。</li>
	<li>手术过程中，分别使用3%和1.5%异氟烷进行大鼠麻醉诱导和维持。 
	注：若大鼠无眨眼反应且足底反射消失，则确认麻醉深度合适，并继续维持麻醉状态。</li>
	<li>使用无菌剃刀去除大鼠腹部毛发，并用无菌棉球交替使用乙醇和聚维酮碘溶液对大鼠腹部皮肤消毒3次。麻醉后，局部注射1.5 mg/kg布比卡因进行镇痛。 
	注：消毒方式采用以切口为中心、由内向外的环形消毒法。</li>
	<li>在假手术组中，使用无菌手术刀在大鼠腹部正中做2 cm切口，并使用4-0外科缝线缝合正中切口。 
	注：首先使用可吸收缝线缝合内部肌层，外部/皮肤层使用单丝缝线缝合。术后第10天，用剪刀剪开单丝缝线，用镊子将其取出。</li>
	<li>对于其余各组大鼠，使用无菌镊子分离并暴露完整的卵巢，用4-0外科缝线在卵巢根部结扎，使用无菌手术剪切除完整卵巢，再用4-0外科缝线缝合正中切口。 
	注：所有术后大鼠均置于37 °C容器中隔离饲养，直至清醒并能自由活动。</li>
	<li>在灌胃给药4个月后（见步骤1.1），首先使用3%异氟烷麻醉大鼠，使用脱毛膏去除大鼠背部毛发，然后用无菌棉球交替使用乙醇和聚维酮碘溶液对腹股沟及整个下肢皮肤消毒3次。 
	注：药物通过10 cm不锈钢灌胃针每日给药一次。灌胃剂量根据大鼠体重每周调整一次。</li>
	<li>使用无菌手术剪和镊子切开并剥离腹股沟皮肤，暴露股动脉，用真空采血管采集股动脉血液样本，随后用无菌棉球按压止血。通过过量吸入二氧化碳处死大鼠。</li>
	<li>继续使用无菌手术剪和镊子切开并剥离腹股沟及下肢皮肤，暴露完整的胫骨。取出胫骨后，用无菌生理盐水冲洗3次，并在生理盐水中继续使用&#160;镊子和眼科剪去除多余肌肉组织。</li>
	<li>使用无菌棉球交替使用乙醇和聚维酮碘溶液对腰椎L4背部皮肤消毒3次。使用无菌手术剪和镊子切开背部皮肤，暴露腰椎L4。</li>
	<li>使用咬骨钳切断腰椎L4上下方的椎体，用无菌手术剪剪除腰椎L4周围的骶骨。用生理盐水冲洗分离出的腰椎L4三次，并继续在生理盐水中使用镊子和显微剪去除多余肌肉组织。</li>
	<li>将胫骨和L4椎体置于10%福尔马林组织固定液（见材料表）中，室温保存3天。</li>
	<li>将尸体装入专用尸体袋，放入动物尸体储存柜中。</li>
</ol>
2. 微型计算机断层扫描成像16
<ol>
	<li>按下绿色电源按钮以开启显微CT扫描仪（参见材料表），并启动软件以加热X射线源。 
	注意：为避免X射线散射，在启动前应移除成像区域附近的任何金属物体。在步骤1.11中，若对大鼠胫骨组织进行显微CT检测时X射线照射不足，可能影响实验结果。在显微CT扫描过程中应保持骨骼湿润。在预热期间应取出动物床。确保CT仪器前方左下角的安全钥匙已旋转至“ON”位置。</li>
	<li>通过点击新建创建数据库，以建立用于保存后续数据的文件。</li>
	<li>在软件控制窗口中设置数据采集参数如下：X射线管电压（50 kV）；CT X射线管电流（100 µA）；实时X射线管电流（100 µA）；视野（FOV）（18 mm）；无门控技术；扫描模式（高分辨率，4分钟）。</li>
	<li>用生理盐水清洗胫骨三次，并用滤纸吸去多余水分。用塑料薄膜将胫骨组织包裹固定在动物床上。通过旋转仪器上的旋钮，调整胫骨组织至成像视野中心位置。</li>
	<li>关闭仪器门并开启实时模式。按下捕获按钮以查看胫骨组织图像。</li>
	<li>点击CT扫描按钮开始扫描。点击是以生成图像。 
	注意：一旦X射线开启，仪器顶部的橙色指示灯将亮起，为保障操作者安全，滑动门将无法打开。扫描完成后，2D Viewer软件中将弹出新窗口，显示重建后的横断面、冠状面和矢状面图像。点击复制到绘图板以保存图像。</li>
	<li>将胫骨从动物床中取出。打开Analyze 12.0软件，通过点击文件 &#62; 加载 &#62; 处理导入目标CT图像。点击图像计算器...和区域填充选项，以显示子区域对话框。
	<ol>
		<li>点击交互式选项，并在2 mm厚度区域内选择骨组织。点击应用以选择更改已加载体积的副本。在Analyze 12.0界面中，点击应用选项以选择BMA。</li>
		<li>点击皮质骨分割和小梁骨分割，然后点击保存最终对象图。点击骨测量以显示特定参数指标的数值，包括骨矿物密度（BMD，g/cm3）、骨体积分数（骨组织体积/组织体积 [BV/TV]，%）、骨小梁数量（Tb.N，1/mm）、骨小梁厚度（Tb.Th，µm）以及小梁分离度（Tb.Sp，µm）。 
		&#8203;注意：未对L4椎体进行显微CT检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>取出步骤1.11中大鼠的胫骨和L4椎骨样本，置于20%甲酸溶液中，进行为期4天的脱钙处理。 
	注意：20%甲酸溶液通过将2,400 mL甲醛溶液与600 mL甲酸溶液混合配制而成。</li>
	<li>将步骤3.1处理后的大鼠胫骨和L4椎骨样本放入包埋盒中，用流水冲洗超过6小时。</li>
	<li>使用自动组织处理机，以梯度浓度的酒精溶液对样本进行脱水（60%乙醇1小时，70%乙醇1小时，90%乙醇1小时，95%乙醇2小时，100%乙醇2小时）。</li>
	<li>将组织样本置于二甲苯中2小时，使其透明。脱水结束后，将已通透的样本置于60 °C的石蜡中浸泡3小时，并在自动处理机中进行包埋。</li>
	<li>使用旋转切片机切取4 µm厚的切片。将切片分别放入苏木精染液中染色3–8分钟，伊红染液中染色1–3分钟。</li>
	<li>将染色后的切片依次转移至纯酒精和二甲苯中。用中性树胶封片并固定，用于光学显微镜下的病理学检查。</li>
	<li>使用切片扫描仪（见材料表）以40倍放大倍数扫描切片，并通过查看软件获取整个胫骨和L4椎骨的H&amp;#38;E染色结果。</li>
</ol>
4. 免疫组织化学
<ol>
	<li>使用步骤 3.5 中获得的 4 µm 胫骨切片进行热诱导表位修复。将适当的抗原修复缓冲液（柠檬酸缓冲液，pH = 6.0）加入可微波容器中。将载片放入该容器内，并将容器置于微波炉中。设置程序，在 98 °C 下维持抗原修复 20 分钟。</li>
	<li>取出容器，用冷水冲洗内部 10 分钟。使用过氧化氢（3% H2O2）（见材料表）封闭内源性过氧化物酶活性，然后在室温下孵育切片 15 分钟。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见材料表）洗涤切片三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将切片放入正常山羊血清封闭液（见材料表）中，在湿盒中于室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>向切片样本中加入 200 µL RANKL 抗体（1:200）（见材料表）、OPG 抗体（1:300）（见材料表）和 sclerostin 抗体17（1:200）（见材料表），于 4 °C 避光孵育过夜。 
	注：Sclerostin 是骨生长的负调控因子。它是一种分泌型糖蛋白，具有 C 末端半胱氨酸结样结构域，其序列与骨形态发生蛋白拮抗剂 DAN 家族具有相似性17。该蛋白不属于 RANKL 信号通路。</li>
	<li>向切片中加入生物素标记的山羊抗兔 IgG（见材料表），室温孵育 30 分钟。用 PBS 冲洗切片，并使用二氨基联苯胺（DAB）（见材料表）在室温下染色 3–5 分钟。</li>
	<li>用苏木精对切片染色 1–2 分钟。切片脱水、干燥后，用中性树胶封片。</li>
	<li>使用切片扫描仪（见材料表）以 40 倍放大倍数扫描切片，并使用自动显微镜成像系统（见材料表）采集数字图像。</li>
	<li>打开Imagepro Plus 软件（见材料表）。
	<ol>
		<li>点击File 导入分析图像。点击Measure &#62; Calibration &#62; Intensity Calibration进行光密度校正。依次点击Measure, IOD, Count/Size和Select Colors选项，以显示Segmentation 界面。</li>
		<li>点击Histogram Based选项选择HIS ，然后点击Load File。点击Count 生成IOD 值和Area 值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 酶联免疫吸附测定（ELISA）实验方案
<ol>
	<li>确保用于检测17β-雌二醇的ELISA试剂盒包含已包被抗17β-雌二醇IgG的微孔板（12 × 8孔）、15 mL终止液、22 mL 17β-雌二醇-HRP偶联物、15 mL 3,3',5,5'四甲基联苯胺（TMB）底物溶液、50 mL 10倍浓缩洗涤液、封板膜、微孔板架、17β-雌二醇对照品以及不同浓度梯度的17β-雌二醇标准品（见材料表）。</li>
	<li>将17β-雌二醇检测试剂盒从冰箱中取出，使所有试剂平衡至室温（18–25 °C）。</li>
	<li>试剂配制：用去离子水将10倍浓缩洗涤液稀释，配制成1倍洗涤液。取50 mL 10倍浓缩洗涤液加入450 mL去离子水中，混匀后得到500 mL 1倍洗涤液。</li>
	<li>从冰箱中取出血清样本，并在室温下解冻。</li>
	<li>从板框中取出未使用的微孔条，将其放回含有干燥剂的铝箔袋中，密封后于4 °C保存。</li>
	<li>向各自的微孔中加入25 µL对照品、标准品或样本，然后每孔加入200 µL 17β-雌二醇-HRP偶联物。</li>
	<li>用封板膜覆盖所有微孔，将微孔板置于37 °C孵育2小时。</li>
	<li>移去封板膜并弃去各孔中的液体，用300 µL 1倍洗涤液洗涤微孔3次。 
	注意：避免反应孔溢出。每次洗涤间隔的浸泡时间应&#62;5秒。洗涤结束后，在进行下一步操作前，轻轻拍打滤纸条以除去残留液体。</li>
	<li>每孔加入100 µL TMB底物溶液，在室温下避光孵育30分钟。</li>
	<li>每孔加入100 µL终止液，轻轻振荡微孔板30秒。在30分钟内测定样本在450 nm处的吸光度。</li>
	<li>以标准品浓度为横坐标，其平均吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并根据所绘点拟合最佳拟合曲线。</li>
	<li>通过将样本的吸光度值代入标准曲线，获得其对应的浓度值（以pg/mL表示）。 
	&#8203;注意：根据试剂盒说明书，血清Ca2+、磷、SOST、TRACP-5b和β-CTX的检测方法与17β-雌二醇检测相同。</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>数据以均值 ± 标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，随后进行 Tukey 检验。p &#60; 0.05 被认为具有统计学显著性。</li>
</ol>

<ol><li>Zhai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscone+ameliorates+ovariectomy-induced+bone+loss+and+receptor+activator+of+nuclear+factor-%CE%BAb+ligand-induced+osteoclastogenesis+by+suppressing+TNF+receptor-associated+factor+6-mediated+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Muscone ameliorates ovariectomy-induced bone loss and receptor activator of nuclear factor-κb ligand-induced osteoclastogenesis by suppressing TNF receptor-associated factor 6-mediated signaling pathways.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 348(2020).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antioxidant+sesquiterpene+inhibits+osteoclastogenesis+via+blocking+IPMK%2FTRAF6+and+counteracts+OVX-induced+osteoporosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">An antioxidant sesquiterpene inhibits osteoclastogenesis via blocking IPMK/TRAF6 and counteracts OVX-induced osteoporosis in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 36 (9), 1850-1865 (2021).</li>
<li>Xia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bushenhuoxue+formula+promotes+osteogenic+differentiation+of+growth+plate+chondrocytes+through+%CE%B2-catenin-dependent+manner+during+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Bushenhuoxue formula promotes osteogenic differentiation of growth plate chondrocytes through β-catenin-dependent manner during osteoporosis.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110170(2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shikonin+relieves+osteoporosis+of+ovariectomized+mice+by+inhibiting+RANKL-induced+NF-%CE%BAB+and+NFAT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Shikonin relieves osteoporosis of ovariectomized mice by inhibiting RANKL-induced NF-κB and NFAT pathways.</a> Experimental Cell Research. 394 (1), 112115(2020).</li>
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<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278(2022).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
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<li>Ohlsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+estradiol+are+modulated+in+a+tissue-specific+manner+in+mice+with+inducible+inactivation+of+ER%CE%B1+after+sexual+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The effects of estradiol are modulated in a tissue-specific manner in mice with inducible inactivation of ERα after sexual maturation.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 318 (5), E646-E654 (2020).</li>
<li>Yahiro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-induced+Atoh8+attenuates+osteoclastogenesis+by+suppressing+Runx2+transcriptional+activity+and+reducing+the+Rankl%2FOpg+expression+ratio+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">BMP-induced Atoh8 attenuates osteoclastogenesis by suppressing Runx2 transcriptional activity and reducing the Rankl/Opg expression ratio in osteoblasts.</a> Bone Research. 8 (1), 32(2020).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinpocetine+inhibits+RANKL-induced+osteoclastogenesis+and+attenuates+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Vinpocetine inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis and attenuates ovariectomy-induced bone loss.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109769(2020).</li>
<li>Ardawi, M. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+serum+sclerostin+predicts+the+occurrence+of+osteoporotic+fractures+in+postmenopausal+women%3A+the+Center+of+Excellence+for+Osteoporosis+Research+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">High serum sclerostin predicts the occurrence of osteoporotic fractures in postmenopausal women: the Center of Excellence for Osteoporosis Research Study.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 27 (12), 2592-2602 (2012).</li>
<li>Bai, S. Y., Chen, Y., Dai, H. W., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sclerostin+on+the+functions+and+related+mechanisms+of+cementoblasts+under+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22West+China+Journal+of+Stomatology%22%5BJournal%5D)">Effect of sclerostin on the functions and related mechanisms of cementoblasts under mechanical stress.</a> West China Journal of Stomatology. 37 (2), 162-167 (2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+and+outlook+of+alternative+medicine+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential and outlook of alternative medicine for osteoporosis.</a> Current Drug Targets. 18 (9), 1051-1068 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

卵巢切除术后，由于骨小梁持续减少和骨转换增加，雌激素水平急剧下降。本质上，绝经后雌激素分泌减少可导致显著的骨量丢失18，从而引起去卵巢大鼠体内的Ca2+流失19,20。已有报道表明，补充雌激素有助于促进去卵巢大鼠干骺端骨折的恢复，而雌激素替代疗法也可用于维持绝经后女性的骨量并预防骨质疏松症。先前的研究表明，使用雌二醇有助于改善骨微结构21。本实验证实，BZBS能够抑制去卵巢大鼠的骨Ca2+流失，并改善其骨微结构，这与既往研究结果一致18。在血清检测中，BZBS缓解了去卵巢大鼠雌激素水平的下降，并调节了钙和磷的水平。同时，BZBS可降低去卵巢大鼠中RANKL的表达，并增加OPG的表达，从而有效抑制骨吸收标志物的升高。此外，显微CT成像和H&amp;#38;E染色结果显示，BZBS改善了去卵巢大鼠的骨微结构，表明BZBS具有预防和治疗骨质疏...

绝经后骨质疏松症（PMOP）是一种由于卵巢功能不足、雌激素水平下降以及破骨细胞活性增强所致的骨骼系统疾病1，其特征为骨量降低、骨组织微结构退化以及骨小梁损伤。PMOP易导致骨折，严重影响患者的生活质量。全球约有2亿人受骨质疏松症影响2；约40%的绝经后女性患有骨质疏松症3，其中33%的PMOP患者会发生骨折4。雌激素减少可导致破骨细胞活性相对增强5，当骨吸收超过骨形成时，骨量随之下降。因此，破骨细胞的激活通常被视为骨丢失的标志6。在生理条件下，RANKL/OPG是通过调控破骨细胞活化以促进骨吸收的重要通路，参与骨重建过程7。同时，雌激素也可通过调节RANKL/OPG信号通路来介导破骨细胞的形成与功能8。
近年来，传统医学因其不良反应较少且预后较好，被越来越多地用于治疗各种疾病9,10。八子补肾胶囊（BZBS）是一种中药，可能成为预防和治疗绝经后骨质疏松症（PMOP）的替代方法。其成分包括菟丝子（Cuscuta）、枸杞子（Fructus lycii）、五味子（Fructus schisandrae）、蛇床子（Fructus cnidii）、金樱子（Fructus rosae laevigatae，即刺梨果）、覆盆子（Raspberry）、韭菜子（Semen Allii Tuberosi）、川楝子（Toosendan fructus）、淫羊藿（Herba epimedii）、巴戟天（Morinda officinalis）、肉苁蓉（Herba cistanches）、地黄（Rehmannia glutinosa）、川牛膝（Medicinal cyathula root）、人参（Ginseng）、鹿茸（Pilose antler）以及海马（Hippocampus Kelloggi）（表1），含有11种具有类激素作用的植物雌激素。既往研究已证实，BZBS可通过类雌激素作用延缓动脉粥样硬化斑块的形成11，这与使用雌激素治疗骨质疏松症的机制相似12。然而，BZBS在防治因雌激素缺乏所致骨质疏松症中的潜在作用机制尚不明确。因此，本研究旨在验证BZBS是否对卵巢切除诱导的大鼠骨质疏松症具有骨保护作用13,14。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Proteintech Group, Inc.</td><td>23408-1AP-100</td><td></td></tr><tr><td>17-β-雌二醇 ELISA 试剂盒</td><td>Proteintech Group, Inc.</td><td>21933-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>3% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>山东莱尔康医疗科技有限公司</td><td>20221027</td><td></td></tr><tr><td>抗骨保护素抗体</td><td>Abcam</td><td>ab203061</td><td></td></tr><tr><td>八子补肾胶囊</td><td>石家庄以岭药业股份有限公司</td><td>XB2103001</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记山羊抗兔 IgG</td><td>Abcam</td><td>ab207995</td><td></td></tr><tr><td>钙含量检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>C004-2-1</td><td></td></tr><tr><td>二氨基联苯胺</td><td>中杉金桥</td><td>ZLI-9018</td><td></td></tr><tr><td>戊酸雌二醇片</td><td>Bayer AG</td><td>156A</td><td></td></tr><tr><td>Gene 1580R 离心机</td><td>GENE Co. Ltd.&amp;nbsp;</td><td>GZ422515090077</td><td></td></tr><tr><td>Image-Pro Plus</td><td>Media Cybernetics</td><td>IPP 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000B 显微镜（全自动正置显微镜系统）</td><td>Leica</td><td>361715</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清封闭液</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>C006-1-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>武汉赛维尔生物科技有限公司，中国武汉</td><td>CR10201M</td><td></td></tr><tr><td>Quantum GX2 微型 CT 成像系统</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS149276</td><td></td></tr><tr><td>RANKL 兔多克隆抗体</td><td>武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司</td><td>E-EL-R3032-96T</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 SOST（硬化蛋白）ELISA 试剂盒</td><td>武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司</td><td>E-EL-R1405c-96T</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 TRACP-5b（抗酒石酸酸性磷酸酶 5b）ELISA 试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab108667</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 &amp;beta;-CTx（β-交联肽）ELISA 试剂盒</td><td>武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司</td><td>E-EL-R0939c-96T</td><td></td></tr><tr><td>硬化蛋白兔多克隆抗体</td><td>北京维通利华实验动物技术有限公司</td><td>SCXK(JING)2016-0006</td><td></td></tr><tr><td>切片扫描仪</td><td>滨松光子学株式会社</td><td>Nano Zoomer-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley 雌性大鼠</td><td>北京维通利华实验动物技术有限公司</td><td>ZLI-9381</td><td></td></tr></tbody></table>

八子补肾胶囊在去卵巢大鼠中的类雌激素作用

Estrogen-Like Effect of Bazi Bushen Capsule in Ovariectomized Rats

本研究旨在探讨中草药复方八子补肾胶囊（BZBS）在卵巢切除小鼠模型中模拟雌激素的作用。将雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为六组：假手术组、模型组（OVX）、补佳乐组以及BZBS低、中、高剂量组（1、2和4 g/kg/d）。除假手术组外，其余各组大鼠均进行卵巢切除手术。给予BZBS干预4个月后，采用微型计算机断层扫描（micro-CT）、苏木精-伊红（H&amp;E）染色、免疫组织化学以及酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法进行检测。结果显示，与OVX组相比，BZBS治疗组大鼠的骨小梁数量和面积增加，骨髓细胞增多，脂肪细胞数量减少。用药组右侧胫骨的骨体积、骨小梁数量和骨小梁厚度均增加，骨小梁间距减小。用药组血清中17β-雌二醇和钙水平升高，而血磷、硬化素、β-CTX和TRACP-5b水平降低。在用药组中，RANKL和硬化素表达水平下降，而骨保护素（OPG）水平上升。综上所述，本实验方案结合多种技术手段，系统评价了中草药复方对卵巢切除大鼠的治疗效果及其潜在的分子作用机制。

通过显微CT扫描评估胫骨的骨微结构 
对卵巢切除大鼠给予BZBS治疗显著减轻了卵巢切除诱导的骨小梁结构改变。如右侧胫骨的显微CT重建图像所示（图1A、B），与假手术组（SHAM组）相比，OVX组的骨小梁骨密度（BMD）（图1C）、骨体积分数（BV/TV）（图1D）、骨小梁厚度（Tb.Th）（图1E）、骨小梁数量（Tb.N）（图1F）均显著降低，而骨小梁分离度（Tb.Sp）（图1G）则显著升高。与OVX组相比，BZBS治疗组右侧胫骨的BV/TV、Tb.N和Tb.Th显著增加，Tb.Sp明显降低。
通过H&amp;E染色评估胫骨和L4椎体的骨组...

本文介绍了一种实验方案，用于证明八子补肾胶囊（BZBS）可通过其类雌激素作用，在卵巢切除的啮齿类动物模型中调节RANKL/OPG信号通路。

本研究旨在探讨中草药复方八子补肾胶囊（BZBS）在卵巢切除小鼠中发挥的类雌激素作用。雌性Sprague-Dawley小鼠...

该方案能够直观地呈现骨表型、代谢指标等实验结果。本实验的主要应用是显微CT（micro-CT），可对骨形态进行组织三维重建分析，其应用范围远超皮肤样本。开始操作前，先对已适当麻醉的大鼠进行局部镇痛处理，通过表面注射布比卡因实现。然后使用无菌棉球，用乙醇和聚维酮碘对剃毛区域进行三次消毒。使用手术刀，在动物腹部正中做一道2厘米长的切口。用镊子暴露完整的卵巢，并用4-0外科缝线在卵巢根部进行结扎。缝合正中切口前，使用手术剪切除完整的卵巢。经胃给药四个月并麻醉动物后，用手术剪和镊子切开并剥离腹股沟部位的皮肤，暴露股动脉。使用真空采血管从股动脉采集血液样本。然后用棉球按压以止血。继续切开并剥离下肢腹股沟处的皮肤，暴露完整的胫骨。取出胫骨，并用生理盐水冲洗三次。使用镊子和眼科剪，在生理盐水中去除胫骨上多余的肌肉组织。用无菌棉球蘸取乙醇和聚维酮碘，对腰椎L4部位的背部皮肤进行三次消毒。使用手术剪和镊子切开背部皮肤，暴露腰椎L4。用咬骨钳切断腰椎L4上下方的椎骨，并用手术剪剪除其周围的骶骨。使用镊子和显微剪刀从置于生理盐水中的清洗过的腰椎L4节段去除多余的肌肉组织。将胫骨和L4椎骨置于10%福尔马林组织固定液中，室温保存三天。开启显微CT扫描仪后，启动软件以加热X射线源。通过点击“创建新样本”来建立数据库，以生成文件在获取下一个数据前保存当前数据。在软件控制窗口中，设置数据采集参数：将X射线管电压设为50千伏，CT X射线管电流和实时X射线管电流均设为100微安，视野设为18毫米，不使用门控技术，扫描模式设为高分辨率，扫描时间为4分钟。用生理盐水冲洗胫骨三次后，用滤纸吸去多余水分。用塑料膜将胫骨组织固定在载物台上，以固定其位置。通过旋转仪器上的按钮，将胫骨组织调整至成像视野的中心。关闭仪器门并打开实时模式。按下捕获按钮以查看胫骨组织。单击CT扫描按钮开始扫描。单击“是”以生成图像。单击图像保存，将图像保存到目标文件夹。将之前保存在10%甲醛中的胫骨和L4椎骨样本转移至20%甲酸溶液中，进行为期四天的脱钙处理。脱钙后，将置于包埋盒中的胫骨和L4椎骨用流水冲洗超过六小时。使用自动组织处理机以梯度浓度的酒精溶液对样本进行脱水。将组织样本置于二甲苯中两小时，使其透明。然后将透化后的样本置于60摄氏度的石蜡中浸泡3小时，再放入自动组织处理机中包埋。使用旋转切片机获取4微米厚的组织切片。将切片放入苏木精染液中染色3至8分钟，再放入伊红染液中染色1至3分钟。将染色的切片依次转移至纯酒精和二甲苯中。用中性树胶封片并固定，以便在光学显微镜下观察。对胫骨切片进行热诱导表位修复时，将载片放入微波容器中，并加入适当的抗原修复缓冲液。抗原修复时，将容器在98摄氏度下微波加热20分钟。取出容器后，用冷水冲洗其内部10分钟。为阻断内源性过氧化物酶活性，将胫骨切片在室温下与3%过氧化氢孵育15分钟。用 P

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八紫布参胶囊对去卵巢大鼠的雌激素样作用

本文演示了在大鼠和小鼠中进行卵巢切除术，以及通过硅胶胶囊和口服 Nutella 补充...

卵巢切除术与17β-雌二醇替代在大鼠和小鼠中的可视化演示

雌激素等性腺激素在多种实验范式中调节记忆形成，包括恐惧消退记忆。本方案描述了一组用于研究性腺激素在自然动情周期雌性动物消退过程中特异性作用的方法，包括动情周期监测和外源性雌激素给药。...

研究自然动情周期雌性大鼠条件性恐惧消退的实验方案

临床上，绝经期女性雌激素缺乏可能加剧脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化的发生。我们通过双侧背部外侧切口行双侧卵巢切除术，在apoE-/-小鼠中建立了体内雌激素缺乏模型。该小鼠模型可用于筛选绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗方法。...

一种用于筛选绝经后心血管功能障碍外源性雌激素治疗的体内雌激素缺乏小鼠模型

多种腺外组织和器官中的促卵泡激素（FSH）与多种疾病的发病机制相关。去卵巢并经FSH处理的小鼠模型（OVF）可用于探索FSH的腺外作用。...

探索促卵泡激素的独立效应 体内 在小鼠模型中

本方案介绍了一种通过微型泵控释来曲唑在小鼠中诱导多囊卵巢综合征（PCOS）模型的技术。在充分麻醉条件下，将微型泵皮下植入小鼠体内，经过微型泵一定时间的释放后，成功诱导出小鼠PCOS模型。...

一种改良的小鼠多囊卵巢综合征诱导技术

本方案描述了通过皮下注射睾酮或雌二醇联合醋酸环丙孕酮（用于跨性别者的性别肯定激素治疗）建立两种啮齿类动物模型的方法：剂量设定、相关生物标志物的确定以及治疗效果的评估。...

建立模拟性别确认激素治疗的大鼠模型

急性心肌梗死（AMI）的大鼠模型可用于研究心肌梗死对心脏病理生理学和生理功能的影响。...

大鼠急性心肌梗死模型

人类多能干细胞（hPSCs）具有治疗多种不同疾病的可能性。这些细胞的应用价值在于它们能够分化为体内任何类型的细胞。本文中，我们介绍用于证明hPSCs多能性的畸胎瘤实验方法。...

睾丸被膜内畸胎瘤生成

小肠移植已成为不可逆性肠功能衰竭患者的可接受治疗选择。我们在大鼠中建立的原位小肠移植实验模型，是研究肠移植过程中复杂的免疫和炎症反应的可靠工具。...

大鼠原位小肠移植

我们介绍一种易于建立的、用于大鼠原位肝移植的经典双袖套技术的改良方法。...

大鼠原位肝移植

了解八紫布参胶囊在去卵巢大鼠模型中通过调控RANKL/OPG信号通路发挥雌激素样作用的实验方法。本研究结合Micro-CT成像与组织学分析，为绝经后骨健康治疗提供新思路。

八子补肾胶囊在去卵巢大鼠中的类雌激素作用

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