使用解吸电喷雾电离质谱成像技术可视化中药空间代谢组中鉴定的代谢物

本文主要介绍一种经济高效的植物样品制备及解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）方法，可克服干燥组织在氮气吹扫时易碎裂的相关缺点。传统方法中，根部需在冷冻切片机上进行冷冻切片，而叶片则需通过印迹法进行制备，后者不仅需要昂贵设备，还可能导致信号强度下降。本方法可克服上述局限性。

该方法可用于植物的空间代谢组学研究，例如在非生物和生物胁迫条件下植物体内有毒物质的分布与迁移。首先，取两年生丹参（salvia miltiorrhiza）植株的清洁根部和叶片，直接切成横截面厚度约为三至五毫米的样本。然后，使用双面胶带将样本固定在载玻片上。

将另一张显微镜载玻片置于样品上方，用封膜将两者像三明治一样包裹起来。接着，将该三明治状样品在零下80摄氏度条件下冷冻至少4小时，然后在真空环境中处理2小时，期间保持温度在零下75至零下82摄氏度，真空压力表读数为2.5至3.7帕斯卡。进行分析时，从低温储存中取出样品后，需先在干燥器中恢复至室温，以避免样品表面产生冷凝水，然后再进行基质涂布处理。

在电喷雾电离（ESI）模式下实施仪器检测器的设置和质量校准。使用水-乙腈（1:1 比例）中的亮氨酸和脑磷脂进行检测器设置，并使用甲酸钠-异丙醇-水（1:1 比例）进行质量校准。取下 ESI 源，并将 DESI 单元安装到质谱仪上。

将氮气源连接至解吸电喷雾电离（DESI）装置，并将气体压力调节至约 0.5 兆帕。用 5 毫升注射器吸取亮氨酸、脑磷脂和甲酸的水-甲醇溶液（体积比为 1:9），并将该注射器连接至高性能注射泵，以提供用于样品中化学物质电离的溶剂。接着，将一根供溶剂用的毛细管一端连接至注射器，另一端连接至 DESI 喷雾器。

提供溶剂的毛细管为标准毛细管，其尺寸为内径75微米，外径375微米。启动注射泵，并将注入速率设为每分钟2微升，以获得稳定的溶剂流动和喷雾。关闭氮气阀门，约15秒后再将其打开。

当溶剂以恒定流速流动时，会有少量溶剂喷出到样品台上，并可观察到喷雾现象。接下来，根据喷雾角度、XYZ轴位置、伸出长度和高度调整喷雾器的位置。使用红色和黑色标记作为参考，优化质谱信号，使在灵敏度模式下的信号强度达到约1×10⁵。

由于喷雾器的突出程度是影响信号强度的最主要因素，因此请使用5毫米扳手调节氮气保护装置来调整其突出程度。喷雾方向会影响质谱成像的质量，因此需旋转喷雾器，直至喷雾呈直线状。

完成所有这些步骤后，装置即可用于实验，通常在初次安装后可保持约三周的稳定使用。对于解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MS成像），无需对样品进行预处理。但如有可能，应去除载玻片上多余的培养基。

拍摄载玻片上样品的图像。为避免污染样品表面，请勿触碰样品表面，将载玻片放置在DESI离子源平台上的载物位置，该平台有两个载物位置：A和B。使用标准载玻片或整片载玻片以适配该位置。整片载玻片最多可容纳四张载玻片，因此可提供更大的实验面积。

打开高分辨率质谱成像数据处理软件。在“采集”选项卡中设置一个新的样品板，并选择正确的板位置（A 或 B）以及板类型。在“图像选择”页面，选择载玻片的四个角，随后图像将自动调整至正确方向。

设置质谱参数时，选择实验类型为常用于仅检测母离子的 DESI-MS 模式。接着，选择正离子或负离子模式，因为仪器在一次实验中只能使用一种极性。然后启用高灵敏度模式，以获得微量化学物质的更多信息。

接下来，在“模式”选项卡中绘制一个矩形以定义扫描区域，并通过保持像素的X和Y尺寸相等来设置像素大小。将扫描速率设置为不超过像素大小的五倍。保存项目，并为质谱采集软件导出工作表。

接下来，将工作表导入质谱采集软件，并将其另存为新的样品列表。按下“开始运行”以启动质谱成像扫描，通过导入更多工作表可向实验队列中添加多个图像。将样品的数据文件载入质谱成像处理软件，并设置解吸电喷雾电离（DESI）成像处理的参数。

由于亮氨酸和脑磷脂用作内标锁定质量数，而锁定质量数是确定实验极性的唯一依据，因此设置正确的锁定质量数至关重要。正离子模式下应设置为556.2772，负离子模式下应设置为554.2620。为建立目标化合物列表，需加载已处理的数据文件，以可视化样本的解吸电喷雾电离（DESI）图像。

点击“归一化”按钮，通过总离子色谱图对数据进行归一化处理，以获得特定化学物质相对于参考物质的相对强度，从而实现不同样本之间的相互比较。绘制一个感兴趣区域（ROI），并在样本图像上复制多个副本。然后选择所有感兴趣区域，并导出多元分析结果，以从所有感兴趣区域中提取质谱信息。

根部和整片叶片切片的质谱成像展示了所选化合物的空间分布。每个像素的颜色代表其质荷比的相对强度，因此可反映代谢物离子在整个样品中的天然分布及丰度。目标化合物丹参酮IIA和迷迭香酸在根部不同区域的分布清晰可见。

在叶片切片中检测到化合物丹参醇A。作为一种旨在实现可重复性的实验方案，最重要的是通过在多个维度上调整喷雾器的位置来优化信号强度。