Name: 优化猪脑组织的微管蛋白产量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 学习从猪脑组织中高效分离微管蛋白的方法，通过离心和透射电子显微镜技术获得纯度超过99%的活性蛋白。该方案为神经退行性疾病研究和药物开发提供重要基础。

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本研究由捷克共和国技术局资助（项目编号：TN02000017——兽医医学国家生物技术中心——NaCeBiVet）。

所有溶液的组成和仪器信息详见材料表。所有溶液均使用FPLC级化学试剂配制，并在使用前经0.22 µm滤膜过滤。所有操作过程中均佩戴个人防护装备，例如实验服、手套和护目镜。所有仪器均保持清洁，且无任何洗涤剂残留。实验过程中遵循适当的动物护理指南（经机构批准）。所有生物材料，包括脑组织，均作为原材料从屠宰场购买获得。本实验方案的任何步骤均未使用活体动物。
1. 快速蛋白质液相色谱中磷酸纤维素柱的活化
<ol>
	<li>将700 mL的50%乙醇加入15 g干磷酸纤维素树脂中，用勺子在烧杯中轻轻混合。</li>
	<li>将悬浮液倒入适当体积（700 mL）的合适层析柱中。用带有烧结滤板的活塞封闭层析柱，柱顶至少保留10%的空余空间。 
	注意：也可使用其他容器，但结合蠕动泵使用的FPLC色谱柱可显著缩短树脂活化所需时间，并减少树脂损耗。</li>
	<li>在摇床中以60 rpm转速孵育30分钟。</li>
	<li>让树脂沉降，使用蠕动泵以3 mL/min的流速去除多余的50%乙醇。切勿让树脂变干。</li>
	<li>移除顶部活塞，加入 300 mL 50% 乙醇。关闭层析柱，轻轻振荡片刻，然后去除多余的乙醇 通过 蠕动泵。</li>
	<li>除去残留的乙醇。向柱中加入300 mL超纯水，用活塞封闭柱子，倾斜使树脂重悬。使用蠕动泵去除多余液体。重复此步骤三次。</li>
	<li>打开柱子上端，加入500 mL 0.5 M HCl，关闭柱子，通过轻轻倾斜重悬树脂。在摇床中以60 rpm振荡孵育30分钟。
	<ol>
		<li>使用蠕动泵去除多余液体。加入300 mL 0.5 M HCl，重悬树脂，然后去除多余液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>除去残留的盐酸。向柱中加入300 mL超纯水，用活塞封闭柱体，倾斜使树脂重新悬浮。使用蠕动泵去除多余液体。重复此步骤三次。</li>
	<li>加入700 mL MES缓冲液（25 mM MES，0.1 mM EGTA，0.5 mM MgCl₂）2将样品加入柱中，通过倾斜使树脂重悬。将悬液倒入烧杯中，用1 M NaOH调节pH至6.1，并在温和振荡条件下孵育2小时。</li>
	<li>让树脂沉降，倾去上清液，加入300 mL pH 6.4的MES缓冲液，4 °C过夜孵育。</li>
	<li>倒去多余液体，加入96%乙醇至终浓度为20%，4 °C保存备用。</li>
</ol>
2. 磷酸纤维素柱装填
<ol>
	<li>将12 mL活化树脂倒入带有封闭底塞的洁净层析柱中。让树脂自然沉降，沉降后的树脂体积约为5 mL。去除上层约2–3 mm的部分，该层可能含有较轻的破碎基质碎片。</li>
	<li>移除底塞，使保存液逐滴自由流出。切勿让树脂干燥。</li>
	<li>关闭层析柱并将其连接至FPLC系统。用PEM缓冲液（100 mM PIPES pH 6.9，1 mM EGTA，1 mM MgSO4）以1 mL/min的流速（最大压力1 bar）正向洗涤层析柱30分钟，调节活塞高度，将层析柱倒置，再在相同条件下以反向流速继续洗涤30分钟。</li>
	<li>将装有活化磷酸纤维素的层析柱于4 °C保存数天。</li>
</ol>
3. 微管蛋白的分离与纯化
注意：微管蛋白极易降解，因此操作必须迅速。所有溶液、仪器和设备都应提前准备，并根据需要预先冷却或预热。操作过程对推荐温度的变化非常敏感。考虑到纯化过程中产生的生物废弃物量，脑组织应在解剖后尽快处理。本实验步骤已针对配备六个75 mL超速离心管的转子进行优化。根据可用的超速离心机情况，可相应增加或减少处理的组织量。
<ol>
	<li>组织运输
	<ol>
		<li>将500 g新鲜解剖的猪脑组织（6–8块）放入3 L运输容器中，加入冰冻的运输缓冲液（4.1 mM MES pH 7，320 mM蔗糖，1 mM EGTA），直至完全浸没组织。冰上静置5分钟，更换新鲜运输缓冲液以促进散热。迅速在冰上运输，用于后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织匀浆 
	注意：组织匀浆在冷室中冰上操作。所有仪器应预先冷却，以防止微管蛋白自发聚合。微管蛋白的主要来源为灰质，其余部分将在后续步骤中去除。
	<ol>
		<li>将100 mL提取缓冲液（4.1 mM MES pH 7，520 mM蔗糖，1 mM EGTA，1 mM ATP，0.1 mM GTP）倒入1 L塑料烧杯中，称量烧杯总重W1（g）。ATP和GTP在使用前立即加入。</li>
		<li>从运输容器中取出猪脑组织，用手适度施力去除整个小脑、脂肪、大块白质、脑膜和血管；也可使用剪刀或镊子辅助。将去除多余组织的猪脑放入含100 mL冷提取缓冲液的烧杯中。重复操作直至所有组织处理完毕。</li>
		<li>称量装有处理后脑组织的烧杯，记录总重W2（g）。</li>
		<li>根据公式加入提取缓冲液：提取缓冲液质量 = W2 - W1（例如，若组织重400 g，则额外加入300 g提取缓冲液）。</li>
		<li>将脑组织与提取缓冲液转移至预冷的厨房搅拌机中，进行4–8次短暂脉冲处理，每次3秒。</li>
		<li>使用高速分散匀浆器（18 000 rpm）处理部分匀浆组织1分钟。将悬浮液置于冰上3–5分钟，期间偶尔用勺子混匀。重复此步骤五次，或直至完全匀浆。</li>
		<li>将匀浆液倒入预冷的超速离心管中，在4 °C、50,000 × g条件下离心10分钟。保留上清液，弃去沉淀。重复操作直至收集到430 mL澄清提取液。</li>
		<li>将澄清提取液分装至预冷的超速离心管（每管70 mL），在4 °C、75,000 × g条件下离心60分钟。收集上清液并测定体积S1。 
		注意：若仅有一个转子，需将其置于温水浴中预热，用于下一步37 °C离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第一次聚合
	<ol>
		<li>根据公式V = S1/9 mL加入10×MEM缓冲液（1 M MES pH 6.8，10 mM EGTA，10 mM MgCl2）（例如，若上清液体积为585 mL，则加入65 mL 10×MEM缓冲液）。充分混匀，再加入甘油至终浓度3.5 M，GTP至终浓度0.1 mM。将悬浮液倒入超速离心管中（上清液体积超过离心管容量时，多余部分弃去）。</li>
		<li>将离心管置于水浴中，在37 °C孵育45分钟。</li>
		<li>在37 °C、75,000 × g条件下离心90分钟。测量上清液体积（S2），用于计算MEM缓冲液体积，在步骤3.3.4中加入沉淀中，随后弃去上清液。保留含有聚合微管蛋白的沉淀。</li>
		<li>准备0.5 × S2体积的冰冻1×MEM缓冲液。将等量1×MEM缓冲液分别加入各含沉淀的超速离心管中。用缓冲液重悬沉淀，将悬浮液转移至量筒中，测定总体积。
		<ol>
			<li>加入GTP至终浓度1 mM。将悬浮液转移至Dounce玻璃匀浆器中，在冰上每10分钟左右匀浆一次，共45分钟。操作活塞时需小心，因其易碎。 
			注意：同时将转子置于冰水浴中冷却。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将匀浆液倒入预冷的超速离心管中，在4 °C、75,000 × g条件下离心60分钟。离心后测定上清液体积（S3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二次聚合
	<ol>
		<li>将上清液与0.35 × S3 mL甘油混合，并加入GTP至终浓度1 mM。将混合液倒入超速离心管中，在37 °C孵育45分钟。 
		注意：同时将转子在水浴中预热至37 °C。</li>
		<li>将步骤3.4.1中聚合后的上清液在75,000 × g、37 °C条件下离心60分钟。测定上清液体积（S4）。 
		注意：此为可选暂停点。含微管蛋白的沉淀可迅速在液氮中冷冻，并于-80 °C保存。</li>
		<li>让冷冻沉淀在冰上缓慢融化30分钟。准备0.25 × S4 mL PIPES缓冲液（500 mM PIPES pH 6.9，1 mM EGTA，1 mM MgSO4，1 mM DTT，0.1 mM ATP），均分至各含沉淀的离心管中，用勺子重悬沉淀，将溶液转移至Dounce玻璃匀浆器中。在冰上每10分钟匀浆一次，共45分钟。 
		注意：同时将转子置于冰水浴中冷却。</li>
		<li>将解聚后的微管蛋白溶液倒入超速离心管中，在4 °C、75,000 × g条件下离心60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第三次聚合
	<ol>
		<li>测定上清液体积（S5），加入S5/9 mL DMSO。将悬浮液倒入超速离心管中，在37 °C孵育20分钟以促进聚合。 
		注意：同时将转子在水浴中预热至30 °C。</li>
		<li>将聚合后的微管蛋白在75,000 × g、30 °C条件下离心60分钟。测定上清液体积（S6），保留沉淀。</li>
		<li>将沉淀溶解于0.25 × S6 mL PEM缓冲液（100 mM PIPES pH 6.9，1 mM EGTA，1 mM MgSO4，1 mM DTT，0.1 mM ATP）中。使用Dounce玻璃匀浆器促进溶解。持续加入PEM缓冲液，直至沉淀完全溶解（无可见乳光颗粒）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离子交换层析纯化 
	注意：采用反向离子交换层析去除微管相关蛋白。在指定pH条件下，微管蛋白自由流过层析柱，而杂质蛋白被磷酸纤维素树脂保留。所有操作均在接近4 °C或冰上进行。在FPLC纯化前，不得通过过滤或离心方式对微管蛋白提取液进行澄清处理。</li>
	<li>使用PEM缓冲液（100 mM PIPES pH 6.9，1 mM EGTA，1 mM MgSO4，1 mM DTT，0.1 mM ATP）对FPLC系统及层析柱进行平衡，平衡体积不少于10个柱体积。泵流速不得超过填柱时所用流速（1 mL/min）。</li>
	<li>缓慢将微管蛋白悬浮液上样至层析柱（0.5 mL/min），收集未结合蛋白的穿流液。</li>
	<li>向每1 mL含微管蛋白的组分中加入10 µL 100 mM GTP。</li>
	<li>将含微管蛋白的组分在液氮中速冻，并立即转移至液氮容器中。在此条件下，微管蛋白可保存数年。若在-80 °C保存，其稳定性将在数月内迅速下降。</li>
</ol>

Efficient Tubulin Isolation from Neural Tissue

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<li>Murphy, D. B., Hiebsch, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+microtubule+protein+from+beef+brain+and+comparison+of+the+assembly+requirements+for+neuronal+microtubules+isolated+from+beef+and+hog%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of microtubule protein from beef brain and comparison of the assembly requirements for neuronal microtubules isolated from beef and hog.</a> Anal Biochem. 96 (1), 225-235 (1979).</li>
<li>Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+and+associated+high+molecular+weight+proteins+from+porcine+brain+and+characterization+of+microtubule+assembly+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro.</a> Ann NY Acad Sci. 253, 1 The Biology o 107-132 (1975).</li>
<li>Weisenberg, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+formation+in+vitro+in+solutions+containing+low+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations.</a> Science. 177 (4054), 1104-1105 (1972).</li>
<li>Roychowdhury, S., Gaskin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+assembly-competent+tubulin+from+brain+microtubule+protein+preparations+using+a+fast-performance+liquid+chromatography+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Separation of assembly-competent tubulin from brain microtubule protein preparations using a fast-performance liquid chromatography procedure.</a> J Neurochem. 46 (5), 1399-1405 (1986).</li>
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<li>Munguía, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+native+M.+vogae+and+H.+contortus+tubulin+by+TOG+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Purification of native M. vogae and H. contortus tubulin by TOG affinity chromatography.</a> Exp Parasitol. 182, 37-44 (2017).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+ExpPurif%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein ExpPurif. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Lett. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Liu, C., Yao, J., Yin, J., Xue, J., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+%CE%B1-+and+%CE%B2-tubulin+from+Echinococcus+granulosus%3A+Expression%2C+purification+and+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Recombinant α- and β-tubulin from Echinococcus granulosus: Expression, purification and polymerization.</a> Parasite. 25, 62(2018).</li>
<li>Ti, S. -C., Wieczorek, M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+affinity+tag-free+recombinant+tubulin+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of affinity tag-free recombinant tubulin from insect cells.</a> STAR protoc. 1 (1), 100011(2020).</li>
<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22JVisExp%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> JVisExp. (165), e61826(2020).</li>
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<li>Sweetnam, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor+binding+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22JNat+Prod%22%5BJournal%5D)">The role of receptor binding in drug discovery.</a> JNat Prod. 56 (4), 441-455 (1993).</li>
<li>Qi, Z. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+1-%28benzofuran-3-yl%29-4-%283%2C4%2C5-trimethoxyphenyl%29-1H-1%2C2%2C3-triazole+derivatives+as+tubulin+polymerization+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of 1-(benzofuran-3-yl)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-1,2,3-triazole derivatives as tubulin polymerization inhibitors.</a> Bioorg Chem. 94, 103392(2020).</li>
<li>Sáez-Calvo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triazolopyrimidines+are+microtubule-stabilizing+agents+that+bind+the+vinca+inhibitor+site+of+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Triazolopyrimidines are microtubule-stabilizing agents that bind the vinca inhibitor site of tubulin.</a> Cell Chem Bio. 24 (6), 737-750 (2017).</li>
<li>Bellocq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+assembly-competent+tubulin+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EurJ+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of assembly-competent tubulin from Saccharomyces cerevisiae.</a> EurJ Biochem. 210 (1), 343-349 (1992).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

任何来源的神经组织都是分离微管蛋白的优良材料，因为神经元的树突和轴突富含微管（高达40%）23。脑组织相对容易获得足够数量。其主要缺点可能是翻译后修饰水平不明确，这可能会影响后续实验24,25。此外，唯一需要关注的是起始材料的快速降解，尤其是在温暖条件下。我们采用多次转移缓冲液更换以增强散热，并在运输过程中快速转运，以便尽早开始处理。新鲜组织在防止升温的条件下进行解剖，并在含有GTP和甘油的缓冲液中匀浆，以进一步稳定微管蛋白26。
在本方案中，已引入粗裂解液的澄清步骤（步骤 3.2.7）。通常不建议在第一次聚合之前进行长时间离心，因为微管蛋白易发生不可逆修饰并受蛋白酶影响。另一方面，本实验结果表明，在高重力加速度下进行短暂离心可减少碎片，从而增加处理后匀浆的相对体积，且对微管蛋白质量无明显影响。
准确测定蛋白质浓度对于后续实验至关重要，尤其是在研究与微管蛋白结合蛋白或抑制剂相互作用时。在研究过程中，我们发现不同蛋白质浓度检测方法的结果存在显著差异。主要原因在于高浓度的DTT、GTP和ATP会干扰检测。由于储存缓冲液中含有大量DTT，导致BCA法检测值偏高，接近其检测上限，从而降低了该方法的准确性。此外，蛋白质与ATP或GTP在280 nm处具有相似的吸收峰最大值，导致通过280 nm吸光度测定蛋白质浓度时结果不一致。这一问题在FPLC紫外检测器的读数中也较为明显。最可靠且结果稳定的检测方法是Bradford蛋白质测定法，该方法未观察到缓冲液成分的干扰作用。然而，必须使用储存缓冲液配制蛋白质标准品的稀释系列。
纯化微管蛋白形成适当结构的能力是后续实验的前提条件。微管蛋白在本质上即使处于富含甘油和GTP的环境中也极易降解，从而导致其形成均一纤丝的能力下降。因此，必须追踪纯化过程，并通过实验验证储存的微管蛋白是否仍具备聚合形成稳定且规则纤丝的能力。目前已建立多种独立方法用于在体外（in vitro）和体内（in vivo）评估微管蛋白的状态。其中较为重要的方法包括圆二色光谱法27、表面等离子共振检测28、热迁移实验29、聚合抑制实验30、免疫荧光染色31,32、共沉淀实验22,33以及透射电子显微镜分析32。本方案中所采用的微管蛋白聚合实验和共沉淀实验操作简便，可通过观察离心后管底是否出现沉淀物，或通过SDS-PAGE进行快速评估。然而，沉淀的微管蛋白可能以聚集体的形式存在。因此，必须结合更为精密的方法（如透射电子显微镜）来确认微管纤维的存在，以实现质量控制。

微管是由α-和β-微管蛋白异源二聚体组成的中空蛋白丝状结构（直径24 nm），参与多种重要的细胞过程，包括细胞内结构的形成、细胞运动、细胞分裂、细胞分化、细胞内运输、细胞形态维持以及分泌活动。1微管的细胞功能可能受到微管相关蛋白（MAPs）及其他蛋白质的直接或间接相互作用的影响。 通过 由微管蛋白编码定义的复杂翻译后修饰2.
微管蛋白纤维通过α-和β-亚基在成核-延伸机制中的动态非共价相互作用而形成。首先形成短的微管，随后微管蛋白纤维通过两端可逆的延伸而继续生长，形成由平行排列的微管蛋白异源二聚体组成的原纤维结构的圆筒状结构2。动态不稳定性指的是组装好的微管通常并不与其亚基处于平衡状态，而是能够在持续生长与缩短之间发生相变，同时维持稳态1,2。
微管蛋白纤维的动态不稳定性主要被应用于多种微管蛋白分离纯化流程中，通过在高纯度甘油、DMSO、GTP/ATP和Mg存在的条件下，反复进行高温聚合与低温解聚的循环步骤2+，或其他化学试剂（如紫杉醇或多聚阳离子）3. 大部分分离步骤4 随后进行蛋白质层析5,6,7,8,9，从而确保与二磷酸核苷激酶和ATP酶活性相关的微管蛋白结合蛋白的有效分离5. 使用高盐缓冲液也可获得类似结果10. 多个来源，包括神经11,12,13,14 和非神经15 组织，鱼类16 （包括淡水和海水）、酵母或重组变体17 在不同生产菌株中过表达11,12,13,14以及其他来源9,18 用于组分分离和纯化。
本方案利用沉淀和蛋白质层析技术，从猪脑中分离出高纯度的微管蛋白（图1）。其主要优势在于，仅需配备常规分子生物学实验设备的实验室即可实现相对较高的产率。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>---</td><td>---</td><td>常用材料</td></tr><tr><td>10 mL 离心管</td><td>---</td><td>---</td><td>常用材料</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>---</td><td>---</td><td>常用材料</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>Dounce 玻璃匀浆器</td><td>P-LAB</td><td>H244043</td><td>匀浆器</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>PENTA</td><td>70390-11001</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>甘油</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>带刻度烧杯</td><td>---</td><td>---</td><td>常用设备</td></tr><tr><td>带刻度量筒</td><td>---</td><td>---</td><td>常用设备</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td><td>极高纯度</td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>组织运输用隔离箱</td><td>---</td><td>---</td><td>常用设备</td></tr><tr><td>厨房搅拌机</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>玻璃或塑料容器</td></tr><tr><td>液氮</td><td>---</td><td>---</td><td>常用材料</td></tr><tr><td>MES&amp;nbsp;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>MERCK</td><td>814733&amp;nbsp;</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>A94469</td><td>超速离心机</td></tr><tr><td>磷酸纤维素柱</td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>空柱</td></tr><tr><td>磷酸纤维素树脂</td><td>Creative - Biomart, inc</td><td>Phosphate-001C</td><td>离子交换树脂</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>PENTA</td><td>24970-31000</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>天平</td><td>---</td><td>---</td><td>常用设备</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>---</td><td>---</td><td>常用设备</td></tr><tr><td>勺子&amp;nbsp;</td><td>---</td><td>---</td><td>塑料或玻璃</td></tr><tr><td>Ti45 转子</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>339160</td><td>超速离心机转子</td></tr><tr><td>镊子</td><td>---</td><td>---</td><td>常用设备</td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 basic</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>实验室匀浆器</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴</td><td>---</td><td>---</td><td>搅拌式</td></tr></tbody></table>

优化从猪脑组织中提取微管蛋白的产量

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

任何来源的神经组织都是分离微管蛋白的优良材料，因为神经元的树突和轴突富含微管。本文介绍一种可用于多种来源神经组织的微管蛋白提取方法，仅需少量修改即可适用。在本方案中，新增了一个粗裂解液的澄清步骤，可在第一次聚合反应前显著减少不溶性碎片的初始量。这一附加步骤使得在使用相同仪器设备的情况下能够处理更多组织，从而提高了所处理匀浆的相对体积。新增步骤对纯化微管蛋白的质量无显著影响，这一点已通过 体外 活性测定和透射电子显微镜分析。所述方法包含所有关键步骤，包括组织采集、运输、组织匀浆、微管蛋白分离循环，以及通过FPLC离子交换层析进行最终纯化，随后开展活性测定实验。经电喷雾电离和MALDI-TOF质谱分析确认，所纯化的微管蛋白均一性超过97%。

在分离与纯化步骤中，取样进行 SDS-PAGE 电泳，并随后采用考马斯亮蓝染色分析（图 2）。每份样品取 20 µL，加入 10 µL Laemmli 上样缓冲液（188 mM Tris-HCl pH 6.8，3% SDS (w/w)，30% 甘油 (v/v)，0.01% 溴酚蓝 (w/w)，15% β-巯基乙醇），于 95 °C 孵育 15 分钟。每份样品取 4 µL 上样至 12.5% 丙烯酰胺 SDS 凝胶，在还原与变性条件下，以每块凝胶恒定电流 30 mA 进行电泳分离。
结果证实，微管蛋白的相对浓度逐步增加，同时污染蛋白有所减少。此外，与省略该步骤相比，在第一次离心（步骤 3.2.7）中澄清裂解液中的微管蛋白未出现显著损失（图 2A，B）。
采用三种独立方法测定蛋白浓度：BCA 法、Bradford 蛋白测定法以及 SDS-PAGE 凝胶密度分析法19（图 3）。根据所述实验步骤，从 250 g 神经组织中获得的微管蛋白总产量为 123 mg 纯化微管蛋白。在测量过程中，必须考虑到保存缓冲液中高浓度 DTT 对 BCA 法具有显著影响。含有 DTT 的 PEM 缓冲液和 PBS 缓冲液均使其背景吸光度增加约 0.900 A595，从而显著降低 BCA 法的检测能力（图 3A）。即使将样品用纯水稀释十倍，DTT 的负效应仍然可被检测到（数据未显示）。Bradford 法似乎不受保存缓冲液的影响（图 3B），这一点已通过密度分析得到证实。
通过在两个独立机构（捷克共和国布尔诺病毒学研究所；捷克共和国布尔诺马萨里克大学CEITEC）采用电喷雾离子化和MALDI-TOF质谱分析，验证了微管蛋白制备物的纯度。两项分析均确认存在多种亚型的猪源α和β微管蛋白。总体纯度超过97.07%（肽谱匹配数1065），主要杂质来源于人Homo sapiens II型角蛋白（肽谱匹配数246，占杂质总量的2.24%），这些杂质可能在微管蛋白分离及质谱/质谱分析样品制备过程中引入。其他杂质共322个肽谱匹配，仅检测到源自猪Sus scrofa的血清白蛋白、γ-肌动蛋白和胰蛋白酶原，且均为单肽段水平鉴定（占0.0069%）。
在后续实验中，验证了快速冷冻并在液氮中储存后聚合能力的保持情况。将10 mg/mL的等份样品从液氮中取出，并在冰上缓慢解冻。通过在含有DTT、ATP和GTP的PEM缓冲液中稀释等份样品，制备不同浓度的样品（10 mg/mL、8 mg/mL、6 mg/mL、4 mg/mL和2 mg/mL），用于自组装实验。第一组稀释样品在37 °C孵育60分钟，第二组则在冰上孵育60分钟。两组样品均在21,000 x g离心60分钟，并分别维持相应温度（4 °C或37 °C）。取出30 µL上清液用于SDS-PAGE分析。使用移液器小心吸除剩余上清液并弃去。沉淀物用100 µL PEM缓冲液短暂洗涤，随后立即用移液器吸除。接着，将沉淀物重悬于50 µL 1x浓度的SDS上样缓冲液中，以保持沉淀物与上清液之间的相对浓度一致。向每份上清液中加入10 µL SDS上样缓冲液。所有样品均通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行分析（图4）。根据起始浓度调整上样至SDS-PAGE的各样品体积，以便更明显地观察因浓度差异导致的沉淀变化。在PEM缓冲液中对微管蛋白进行的自组装测试证实了其能够以温度依赖的方式形成微管蛋白纤维。
采用MAP2c驱动的微管蛋白20,21组装实验，验证微管蛋白与其他蛋白相互作用的能力22。制备MAP2c的系列稀释液，将100 µL浓度为1 mg/mL的微管蛋白等分试样与MAP2c混合，使MAP2c终浓度范围为0 µM至8 µM。所有样品均在冰上配制，用新鲜配制的含1 mM DTT和1 mM GTP的PEM缓冲液稀释。微管蛋白与不同浓度的MAP2c在37 °C孵育15分钟，随后在37 °C、21,000 x g条件下离心60分钟。沉淀物最终用100 µL PEM缓冲液洗涤两次。实验结果证实所制备的微管蛋白具有发生MAP2c驱动聚合的能力，因为未添加MAP2c的样品未形成沉淀物（图5）。
进一步采用透射电子显微镜确认共聚合实验中微管蛋白纤维的存在。将微管相关蛋白2c（MAP2c）沉淀的纯化微管蛋白悬浮液制备成透射电子显微镜样品，并使用负染色法进行观察。样品吸附于聚乙烯醇缩甲醛（Formvar）包被的碳稳定铜网上，随后用2%的钼酸铵（NH4MoO4）进行负染色，并在电子显微镜下以18,000倍放大倍数和80 kV加速电压下观察。观察到均一的微管结构，具有清晰的纤维状形态和适当尺寸，表明该体系能够形成天然构象的微管（图6）。
<img alt="神经组织处理示意图：聚合、解聚、离子交换层析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：微管蛋白分离与纯化的示意图。 括号中的数字对应于实验方案步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白纯化过程中的 SDS-PAGE 凝胶电泳结果。显示分子量标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：微管蛋白的分离与纯化。（A）利用温度驱动聚合法分离微管蛋白过程中各步骤取样进行 SDS-PAGE 分析的结果（每泳道 3 µL）。可见杂质蛋白逐渐减少，而微管蛋白（分子量约 50 kDa）的相对丰度稳定增加。各泳道上方的数字对应于实验方案中的步骤编号。（B）微管蛋白经磷酸纤维素树脂柱层析后各洗脱组分的 SDS-PAGE 分析结果（每泳道 4 µL）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质浓度与吸光度关系图；PEM、PBS 条件；吸光度行为的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：蛋白质浓度。 比较了在 PEM 缓冲液或 PBS 中浓度最高达 1 mg/mL 的牛血清白蛋白稀释系列，以及在 PEM 或 PBS 缓冲液中分别或联合含有 0.1 mM ATP、1 mM GTP、1 mM DTT 的 BSA 稀释系列。(A) 使用 BCA 法时，含有 DTT 的样品（实心符号）背景值出现显著偏移。(B) 当使用 Bradford 法测定浓度时，未检测到此效应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质纯化凝胶电泳结果；分子量标准，70-50 kDa 蛋白条带比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：微管蛋白自组装实验。 自组装实验的 SDS-PAGE 分析证实，储存的微管蛋白在（A）4 °C 或（B）37 °C 条件下孵育时，能够在较宽浓度范围内以温度依赖的方式发生聚合。（P — 沉淀，S — 上清；每对泳道上方标注了相应的微管蛋白浓度；每个样品的上样量为 10 µg）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="按分子量分离蛋白质的SDS-PAGE凝胶示意图，显示浓度梯度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：微管蛋白共沉淀实验。 MAP2c辅助的微管蛋白组装的SDS-PAGE分析结果证实，储存的微管蛋白能够以浓度依赖的方式通过与微管相关蛋白相互作用而发生聚合。每条泳道上方标注了MAP2c的摩尔浓度。（P - 沉淀组分，S - 上清组分）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微管的电子显微镜图像；结构分析；纳米尺度；图像A与B的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：透射电子显微镜观察。 透射电子显微图像显示，微管蛋白（tubulin）可组装成（A）具有合适直径的微管（B），这些微管由均匀的微管蛋白丝构成，并结合有MAP2c蛋白。标尺对应1000 nm（A）和200 nm（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种适用于小型仪器设备的猪脑微管蛋白高产率分离技术。该分离流程辅以微管蛋白聚合活性的测定方法。 体外 使用共沉淀实验和透射电子显微镜。

任何来源的神经组织都是分离微管蛋白的优良材料，因为神经元的树突和轴突富含微管。这里，我们……

本实验方案可获得纯度超过99%的微管蛋白，同时保持其天然的动态特性。这对于研究微管蛋白自身的性质及其与结合伴侣蛋白的相互作用至关重要。针对脑组织中微管蛋白的研究，有助于理解神经元的结构、连接性、神经可塑性，甚至神经退行性疾病，并有助于开发靶向性脑部治疗手段或药物。微管蛋白相互作用的研究采用了X射线晶体学、TOEM和核磁共振（NMR）波谱学等先进技术。其中，NMR能够独特地捕捉微管蛋白在溶液中的天然行为，因此要求蛋白保持其原始的活性状态。对微管蛋白动力学的精确了解有望推动未来的发展，为微管蛋白相关疾病的更有效药物设计提供支持。例如，这将加深对细胞分裂的理解，并有助于开发针对癌症和神经退行性疾病的新型疗法。这一认识使得微管蛋白功能能够被精确调控，从而改善治疗效果。微管是真核细胞骨架的关键组分，参与多种细胞功能。尽管结构相似，微管蛋白会经历翻译后修饰，形成调控其功能、细胞功能及稳态的微管蛋白编码。首先，将100毫升提取缓冲液倒入一个一升的塑料烧杯中。称量缓冲液和容器的重量W1。从运输容器中取出猪脑。用手指施加适当力度，从脑组织中去除小脑、脂肪、大块的白质、脑膜和血管。将去除非目标组织的脑放入含有100毫升冷提取缓冲液的烧杯中，称重并记录重量W2。根据计算结果向烧杯中加入适量的提取缓冲液。将脑组织连同提取缓冲液转移至预冷的家用搅拌机中，以每次三秒的短时脉冲进行4到8次处理。然后，使用高速分散匀浆器将部分匀浆的组织处理一分钟。接着，将悬液置于冰上静置三到五分钟，期间偶尔用勺子混匀。将细胞悬液倒入预冷的超速离心管中，在4°C条件下以50,000 G离心一分钟。保留上清液，弃去沉淀。首先，取匀浆后的猪脑组织澄清提取物。将提取物倒入预冷的超速离心管中，在4°C条件下以75,000 G离心60分钟。收集上清液并测量其体积 S1。接着，向上清液中加入 10X MEM 缓冲液并充分混匀。加入甘油和 GTP，使其终浓度分别为 3.5 摩尔和 0.1 毫摩尔。将悬液倒入超速离心管中，在 37 摄氏度水浴中孵育 45 分钟。随后，在 37 摄氏度下以 75,000 G 离心 90 分钟。然后，在弃去上清液 S2 之前，测量其体积。现在向沉淀中加入等体积的预冷 MEM 缓冲液。重悬沉淀后，将悬液转移至量筒中，测定总体积。然后加入GTP，使其终浓度为1毫摩尔。将悬液转移至Dounce玻璃匀浆器中，在冰上每10分钟间歇匀浆一次，共持续45分钟。将匀质后的溶液倒入预冷的超速离心管中，在4°C条件下以75,000 G离心60分钟，收集上清液S3并测定其体积。随后将上清液与甘油混合，加入GTP后，将混合液转移至超速离心管中，在37°C孵育45分钟。当聚合后的上清液离心完成后，检查上清液 S4 的体积。然后将配制好的 PIPES 缓冲液等量分装至含有沉淀的离心管中，并用小勺将沉淀重悬。充分匀浆沉淀后，在 4 摄氏度条件下以 75,000 G 离心 60 分钟。测量上清液 S5 的体积，并加入计算所需体积的二甲基亚砜。将悬浮液倒入超速离心管中，在37摄氏度孵育20分钟以促进聚合。随后，在30摄氏度下以75,000 G离心聚合的微管蛋白60分钟。测量上清液S6的体积，并将沉淀物保留备用。用 PEM 缓冲液溶解沉淀。使用 Dounce 玻璃匀浆器匀浆沉淀，同时加入 PEM 缓冲液，直至完全溶解。

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