Name: 氯化铁诱导的动脉血栓形成和用于3D电子显微镜分析的样本采集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: 了解氯化铁诱导动脉血栓形成的方法，用于三维电子显微镜分析样本采集。该技术可研究血栓生长和结构变化的细胞机制，为心血管疾病治疗提供可重复的实验框架。

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作者感谢Whiteheart实验室成员对本文稿的仔细审阅。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）、国家心肺血液研究所（NHLBI）（资助号HL56652、HL138179和HL150818）、美国退伍军人事务部杰出研究奖（授予S.W.W.）、R01 HL155519（授予B.S.）以及国家生物医学影像与生物工程研究所（NIBIB）院内研究项目基金对R.D.L.的资助。

本文讨论的所有实验均经肯塔基大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查并批准。
注意：手术器械列于图1及材料表中。实验使用8至10周龄的C57BL/6J小鼠，性别为雄性/雌性，或相关的基因操作（敲除或敲入）品系。
1. FeCl3诱导的颈动脉损伤
<ol>
	<li>小鼠麻醉诱导
	<ol>
		<li>称量小鼠体重。</li>
		<li>通过腹腔注射（i.p.）0.2 g/kg 三溴乙醇溶液使小鼠麻醉。注射前确保麻醉液处于室温（RT）。此剂量足以使小鼠镇静约 1 小时。</li>
		<li>注射后5分钟，通过捏压小鼠脚趾检查趾反射，以确认小鼠是否已进入镇静状态。若小鼠未镇静，会将脚趾缩回。若出现此情况，需等待5分钟后再次检查。</li>
		<li>如果小鼠仍未完全镇静，可追加初始剂量的1/4，并等待5分钟。</li>
		<li>在整个操作过程中，应定期通过夹捏脚趾来监测小鼠的麻醉深度。此外，还可监测呼吸频率和体温，以维持最佳的麻醉状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定小鼠
	<ol>
		<li>将小鼠仰卧置于加热垫（37 °C）上&#160;并使用胶带固定四肢。</li>
		<li>使用外科缝合线（0.1 mm）轻轻牵拉小鼠上颌前牙，以伸展颈部区域。此步骤对于更好地暴露手术区域以及稳定多普勒探头至关重要。缝合线的规格并不重要，因其仅用于牵拉动物前牙以伸展颈部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切口
	<ol>
		<li>用70%乙醇喷洒手术区域，或用酒精擦拭巾擦拭。</li>
		<li>使用棉签在手术区域涂抹少量脱毛膏。等待1-2分钟，然后用湿纸巾或纸巾擦去脱毛膏。 
		注意：此步骤对于保持手术区域清洁至关重要。</li>
		<li>使用剪刀和镊子（图1B11,1B13），从下颌至胸骨上切迹做正中切口。牵开皮肤以更好地暴露手术区域（图2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颈动脉暴露
	<ol>
		<li>使用手术镊和显微解剖镊，钝性分离覆盖的浅筋膜并将其去除，以暴露左侧颈总动脉图1B12,1B13）。此阶段切勿使用剪刀，以免损伤该区域的其他血管结构。</li>
		<li>去除颈动脉周围多余的组织。避免过度剥离周围组织，因为该区域含有迷走神经和椎动脉。</li>
		<li>用手术镊和打结镊解剖分离颈动脉及其周围组织图1B12,1B15,2C确保不要拉伸或牵拉动脉，以避免对动脉或周围血管系统造成机械性损伤。</li>
		<li>在动脉下方放置一块塑料片以标记损伤位置（图 2D）。使用彩色透明片，以便在手术视野中更清晰地观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流量探头的放置
	<ol>
		<li>将多普勒超声血流探头置于生理盐水（0.9% NaCl 溶液）中2手术前将探头另一端插入流量计的接口中约10分钟，以方便读取流量。将流量计连接至计算机。 
		注意：在手术间隙，多普勒超声血流探头应置于生理盐水中。确保在整个操作过程中保持探头湿润和清洁。</li>
		<li>将超声多普勒透射式血流探头放置在塑料管上游的动脉周围图 2D）。确保探头的容器支架区域不要过度伸展（图1C，红色箭头）。 
		注意：如有需要，可用纱布垫支撑探头（图1B1以调整探针至适当高度，便于获得最佳读数位置。</li>
		<li>如果此时手术区域已干燥，可加入数滴室温生理盐水以保持湿润。密切监测流量探头读数。最佳读数因动物个体而异，通常在0.6–1.2 mL/min之间。若读数偏低或不稳定，应调整流量探头位置以获得最佳读数。 
		注意：确保小鼠颈部不过度伸展，并保持手术区域清洁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录流速基线
	<ol>
		<li>放置探头后，监测血流2分钟，以确保血流稳定。随后，记录血流2分钟（图 3B) 作为基线。有关流量计的详细描述，请参阅 Subramaniam 等人的研究。17.</li>
		<li>要记录血流，启动 WinDAQ 软件。点击“文件”选项，然后点击 记录新建一个文件夹和文件，然后开始录制。要停止录制，请点击 停止 在文件部分。 
		注意：WinDAQ 软件可从出版商处免费获取：&#160;https://www.dataq.com/products/windaq/</li>
	</ol>
	</li>
	<li>损伤
	<ol>
		<li>停止记录血流。确保不要改变探头位置，以便在损伤后读数保持一致。</li>
		<li>用纸巾或擦拭布彻底擦干该区域。 
		注意：即使残留少量液体也可能改变 FeCl 的浓度3&#160;用于造成血管损伤的溶液。这会导致结果出现变异，影响可重复性。当区域完全干燥时，探针无法&#160;能够测量流速。</li>
		<li>在塑料称量舟中放入一张圆形滤纸（直径1 mm，使用直径1 mm的耳孔打孔器裁切）。加入1 µL的6% FeCl₃溶液。3 溶液（用dH₂O配制）2O）滴加到滤纸上。 
		注意：务必添加 FeCl3&#160;使用滤纸前立即加入溶液。过早浸泡滤纸可能导致 FeCl 挥发。3&#160;溶液并改变损伤的严重程度。</li>
		<li>使用精细镊子夹取滤纸，将其放置在探针上游的动脉上，即动脉被塑料标记的部分图 2D，E）。这种塑料起到标记物和间隔物的作用，标记损伤区域并防止 FeCl 的意外稀释3 通过避免接触周围潮湿区域。 
		&#8203;注意：确保滤纸平直，不得折叠、扭曲或以任何方式弯折。一旦将滤纸放置于动脉上，不得再移动其位置；否则会改变损伤程度。</li>
		<li>放置滤纸后，立即启动计时器并记录血流情况。3分钟后，移除滤纸，并在损伤部位加入生理盐水以去除氯化铁（FeCl₃）3 并终止损伤过程，同时保持该区域湿润。在此阶段，血流应恢复至损伤前记录的基线水平。</li>
		<li>监测并记录血流，直至其降至原始记录值的10%或降至零。一旦在损伤部位开始形成血栓，血流将呈现持续下降趋势。图3C记录此期间流速的任何显著波动。</li>
		<li>为了研究血栓的稳定性，记录每次显著且持续减少后血流的快速增加。这些事件被归类为不稳定血栓形成所致的栓塞图4D）。在血流持续减少后，操作者能够在实验结束时观察到动脉上的损伤情况（图2F，蓝色箭头/虚线椭圆）。</li>
		<li>血管闭塞时间定义为血流完全停止至少1分钟。记录闭塞性血栓形成的时间，表现为血流读数为零或显著减少。</li>
		<li>在30分钟时终止实验。如果在监测30分钟后仍未形成血栓，则记录血流情况，停止记录，并移除探针。</li>
		<li>用70%乙醇和刷子清洁探头，以去除残留的组织、毛发或碎屑。在将探头放入储存盒之前，务必将其完全干燥。&#160;在长期存放前，务必将探头完全干燥后再放入储存盒中。</li>
		<li>通过颈椎脱位法处死小鼠。将尸体置于标有实验室名称和日期的尸体处理袋中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

2. FeCl3诱导损伤后用于连续块面扫描电镜（SBF-SEM）研究的样本采集与制备
注意：本实验方案中提供的电镜（EM）方法适用于聚焦离子束扫描电镜（SBF-SEM）的样品制备。该成像技术能够以前所未有的能力研究血凝块中血小板的三维结构。利用该技术，可在逐步切削样品的过程中获得一系列连续的块面扫描电镜图像。本样品制备的关键要点包括：1）样品必须在包埋前进行重金属染色；2）塑料包埋的样品必须修剪至适合安装于扫描电镜（SEM）的合适尺寸（修剪后样品的示意图见图6）。在扫描电镜中无法进行包埋后染色。当采集三氯化铁（FeCl3）诱导的血管损伤样品用于电镜分析时，在手术过程中需进行以下调整。本方案中所述的FeCl3手术步骤的修改同样适用于任何形式的电子显微镜分析。麻醉条件、切口操作及颈动脉暴露步骤与方案1相同。
<ol>
	<li>暴露颈动脉后，用两根手术线（直径：0.1 mm）松松地环绕其间区域，标记损伤部位图5A，B).</li>
	<li>将探针置于动脉下方，远离下端缝线处图5C).</li>
	<li>将塑料片插入动脉下方的两根缝线之间，以标记 FeCl₃ 处理位点3 损伤（图5C).</li>
	<li>在进行损伤操作前采集血流数据，以记录基础血流量。这些数据用于确定样本采集的时间点。 
	注意：确保固定液（3% 多聚甲醛/PFA + 0.1% 戊二醛，均用 1x PBS 配制）已准备好并置于室温。&#160;或者，也可使用含2.5%戊二醛的生理盐水溶液进行固定。 
	警告：甲醛和戊二醛均具有高毒性和刺激性。操作时应佩戴手套、护目镜和口罩，以防止接触。所有固定液均有毒性，固定步骤应在通风橱中进行。</li>
	<li>通过放置 FeCl₃ 来实施损伤3-将浸有滤纸的动脉置于（8% FeCl₃）溶液中3 使用）3分钟（此时间也可能有所变化）。3分钟后，移除滤纸，并在损伤部位加入生理盐水，以清除残留的过量FeCl₃。3此步骤对于防止损伤程度不一以及便于探针进行流式计数是必要的。图 5D).</li>
	<li>监测流速读数。当流速降至初始值的50%以下时，移除探头。迅速擦干该区域，并在损伤部位添加固定剂，进行外部固定。</li>
	<li>立即用镊子夹住损伤区域附近的动脉，并在下端结扎线的远端和上端结扎线的近端进行剪切。如有需要，可请另一人协助剪断一端。将组织以采集时的相同方向置于塑料组织培养皿中，并加入数滴固定液。 
	注意：切断动脉会导致立即且大量的出血，因此首次切断前务必先夹住动脉。在此情况下，小鼠将因失血过多而死亡。通过放血结合颈椎脱位法对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>使用手术刀清理动脉周围的多余组织。注意记录血流方向，为此可将一端横向剪切，另一端剪成渐窄/斜切状以作标记。图5E).</li>
	<li>将样品在固定液（3% PFA 和 0.1% 戊二醛）中于室温固定 1 小时。随后，将样品置于 1% PFA 中，4 °C 保存，直至用湿冰运输至样品处理实验室进行电镜分析。 
	注意：样品不应冷冻. 该样本采集方法面临的挑战包括：
	<ol>
		<li>最初的读数可能并非最佳，或在损伤后出现波动，这可能影响用于电镜分析的损伤程度的判定。为解决这一问题，应在尝试将探头置于不同位置后，选择最佳位置，并在此位置持续记录几分钟的基础读数。</li>
		<li>通过外部固定剂固定损伤部位以及实际切割动脉段用于分析所需的时间，可能会增加血栓形成程度的变异性。在外部固定后，应迅速进行样本采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将用于电镜分析的样品置于含1% PFA的湿冰中接收。在冰上用0.1 M 卡可基酸盐缓冲液冲洗样品3分钟，以启动后续处理步骤。</li>
	<li>在冰上用含有2.5%戊二醛和2 mM CaCl₂的0.1 M 卡可基酸盐缓冲液固定样品1小时2.</li>
	<li>弃去固定液，用含 2 mM CaCl₂ 的冷 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗样品2 （5 × 3 分钟）图6A).</li>
	<li>用锇溶液（3% 铁氰化钾 [K4C6N6Fe] + 0.3 M 卡可基酸盐缓冲液 + 4 mM CaCl₂2 与等体积的4%水溶液四氧化锇 [OsO₄] 混合4；在ddH₂O中2在冰上孵育1小时。</li>
	<li>样品固定的同时，用ddH₂O配制新鲜的1%三氯乙醛水合物（TCH）溶液2O. 将溶液在 60 °C 下孵育&#160;轻柔混匀，孵育1小时。</li>
	<li>固定后，用ddH₂O洗涤样品2室温下振荡洗涤，每次3分钟，重复5次。</li>
	<li>将样品在过滤后的1% TCH溶液（用ddH₂O配制）中孵育2室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>用ddH₂O洗涤样品2室温下振荡洗涤5次，每次3分钟。</li>
	<li>用2%四氧化锇的ddH₂O溶液固定样品2室温下孵育 30 分钟</li>
	<li>用ddH₂O洗涤样品2室温下每次3分钟，共5次。</li>
	<li>将样品置于1%醋酸铀酰（水溶液）中，4 °C条件下孵育过夜。</li>
	<li>用ddH₂O洗涤样品2室温下振荡洗涤5次，每次3分钟，然后进行后续处理 整块 沃尔顿氏铅天冬氨酸染色法</li>
	<li>整块 沃尔顿氏铅-天冬氨酸染色法3:
	<ol>
		<li>在ddH₂O中配制30 mM L-天冬氨酸溶液2O. 
		注意：将pH值调至3.8时，天冬氨酸溶解更快。该储备液若冷藏可稳定保存1-2个月。</li>
		<li>在10 mL天冬氨酸储备液中配制20 mM硝酸铅溶液，并用1 N KOH调节pH至5.5。</li>
		<li>将样品在 ddH₂O 洗涤五次后，置于 60 °C 的铅天冬氨酸溶液中 30 分钟2室温下，每次3分钟，振荡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用梯度乙醇系列对样本进行脱水。采用Valdivia方案进行化学脱水。18.
	<ol>
		<li>依次用下列每种溶液洗涤样品，以逐步对样品进行脱水（图6B): 
		25% 乙醇，3 分钟 
		50% 乙醇，3 分钟 
		75% 乙醇，3 分钟 
		95% 乙醇，3 分钟 
		100%&#160;乙醇中洗涤10分钟，重复该步骤两次（共洗涤三次）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用100%丙烯酸氧化物（PO）清洗样品10分钟，重复该步骤两次（共清洗三次）。</li>
	<li>在室温下用含 DMP 30 促进剂的 50%/50% PO/树脂溶液孵育过夜，然后用含 DMP30 促进剂的 100% Araldite 502/embed 812/DDSA 包埋剂在 48 小时内完成包埋。</li>
</ol>

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li>
<li>Raskob, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis%3A+a+major+contributor+to+global+disease+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Thrombosis: a major contributor to global disease burden.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).</li>
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</ol>

作者声明本研究无利益冲突。
ORCID 资料：S.J.：0000-0001-6925-2116；S.W.W.：00000-0001-5577-0473。

局部应用FeCl3作用于血管以诱导血栓形成是一种广泛使用的技术，已在此前研究中对明确多种血小板受体、配体信号通路及其抑制剂的作用发挥了关键作用20,21,22,23。FeCl3诱导血栓形成的机制是多方面的；过去认为内皮剥脱是导致血栓形成的原因，但近年来多项研究表明红细胞和血浆蛋白在此过程中亦发挥重要作用24,25,26,27。
本方案中最关键的步骤包括：放置多普勒探头以获得最佳血流信号、滤纸的放置，以及及时终止损伤以取出样本并立即进...

血栓形成是指在血管内形成血凝块，导致血液的自然流动部分或完全受阻。这会引发严重的甚至致命的心血管事件，例如缺血性心脏病和中风。心血管疾病是全球发病率和死亡率的首要原因，导致约四分之一的死亡1,2,3。尽管血栓形成表现为血管系统的功能障碍，但它可能是由潜在的微生物或病毒感染、免疫系统紊乱、恶性肿瘤或代谢性疾病所引起的。血液流动依赖于血管系统中多种组分之间的复杂相互作用，包括内皮细胞、红细胞/白细胞、血小板以及凝血因子4。当血管受损时，血小板会与内皮下基质中的黏附蛋白相互作用，并释放其颗粒内容物，从而募集更多血小板5。同时，凝血级联反应被激活，导致纤维蛋白的形成和沉积。最终形成的血凝块由被纤维蛋白网捕获的血小板和红细胞组成6。尽管已有抗血小板药物和抗凝药物可用于调控血栓形成，但这些疗法仍存在异常出血的主要风险，因此需要精细调整药物剂量和组合方案。因此，发现新的抗血栓药物仍是一项紧迫的需求7。
血栓形成的研究采用多种方法诱导血管损伤：机械性损伤（血管结扎）、热损伤（激光损伤）和化学性损伤（FeCl₃）3/Rose Bengal 应用）。血栓形成的性质因位置（动脉 vs. 静脉）、方法或损伤程度而异。在所有这些类型中，FeCl3诱导的血管损伤是最广泛使用的方法。该方法已应用于小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和狗8,9,10,11,12该方法相对简单，易于操作，若主要参数实现标准化，则在多种血管系统中均具有较高的敏感性和可重复性（例如，动脉[颈动脉和股动脉]、静脉[颈静脉]和微动脉[骨骼肌微动脉和肠系膜微动脉]）。补充表1).
该模型还可用于进一步理解血栓形成的力学机制和形态学特征。该技术的独特优势在于能够在不同流速条件下终止血栓形成过程，从而研究其在发生闭塞前的各个中间阶段。近期血栓研究的进展已利用该模型重点关注非药物性溶栓方法13，或非侵入性递送抗血栓和/或纤溶药物的方法14,15。多个研究团队已证明，当血小板膜被这些治疗药物包被后，可通过热刺激激活药物，以靶向血栓16。本文所述技术可用于此类研究，以在单个血小板水平上验证其研究结果。在本论文中，方案1描述了基本的FeCl3介导的血管损伤操作流程，而方案2则描述了采集和固定血管损伤样本以进行电子显微镜进一步分析的方法。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠溶液&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP358-212</td><td>用于配制0.9%氯化钠溶液的NaCl&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company&amp;nbsp;</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>190 证明乙醇&amp;nbsp;</td><td>KOPTEC</td><td>V1101&amp;nbsp;</td><td>用于配制70%乙醇溶液，以在手术前对小鼠进行消毒处理&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2,2,2 三溴乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48402</td><td></td></tr><tr><td>25 码黑色编织丝线缝合线（5-0）</td><td>DEKNATEL</td><td>136082-1204</td><td></td></tr><tr><td>26G × 3/8 针头&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company&amp;nbsp;</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基-2-丁醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td></td></tr><tr><td>7.5 mL 移液管，刻度至3 mL</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>135010</td><td></td></tr><tr><td>酒精擦拭垫（70% 异丙醇）</td><td>Medline</td><td>MDS090735</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 35 mm × 10 mm&amp;nbsp;</td><td>Corning Incorporated&amp;nbsp;</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型天平&amp;nbsp;</td><td>Ward's Science&amp;nbsp;</td><td>470314-390</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀，12.5 cm 长</td><td>World Precision Instrument</td><td>15922-G</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 活化剂&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>十二烯基琥珀酸酐 / DDSA</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>宠物粪便袋 / 动物尸体处理袋</td><td>Crown Products&amp;nbsp;</td><td>PP-RB-200</td><td></td></tr><tr><td>多普勒血流探头</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>MA0.5PSB</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 树脂&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇，200 证明&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>眼科敷料镊，4&quot; 全弧形，标准型，0.8 mm 宽头</td><td>Integra Miltex</td><td>18-784</td><td></td></tr><tr><td>滤纸&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>28310-106</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀 — 尖头-钝头</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>指环式耳标打孔器&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>纱布海绵 2&amp;rdquo; × 2&amp;rdquo; &amp;ndash; 12 层&amp;nbsp;</td><td>Dukal Corporation</td><td>2128</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛（10% 溶液）</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Integra Miltex 碳钢手术刀片 #10</td><td>Integra&amp;reg; Miltex&amp;reg;</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>三氯化铁&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>刀柄 Miltex&amp;reg; 超细不锈钢 3 号</td><td>Integra Lifesciences&amp;nbsp;</td><td>157510</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma&amp;nbsp;Fisher</td><td>&amp;nbsp;A93100</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铅&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>LEICA S8AP0 显微镜</td><td>LEICA</td><td>不再提供</td><td>公司已不再供货</td></tr><tr><td>LEICA S8AP0 显微镜支架&amp;nbsp;</td><td>LEICA</td><td>10447255</td><td>公司已不再供货</td></tr><tr><td>轻型组织擦拭纸&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖镊；1×2 齿，全弧形；0.8 mm 尖端宽度；4&quot; 长度</td><td>Roboz Surgical Instrument Company</td><td>RS-5157</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 4% 水溶液&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（16% 溶液）</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷，ACS 试剂&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic 移液器 PR-10</td><td>Rainin</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>研究型流量计&amp;nbsp;</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>T402B01481</td><td>型号：T402</td></tr><tr><td>Scotch Magic 透明胶带，3/4&quot; × 1000&quot;，透明</td><td>Scotch&amp;nbsp;</td><td>305289</td><td></td></tr><tr><td>小型动物加热垫</td><td>K&amp;H Manufacturing Inc.</td><td>型号：HM10</td><td></td></tr><tr><td>0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签&amp;nbsp;</td><td>Puritan Medical Products&amp;nbsp;</td><td>25-806 1WC</td><td></td></tr><tr><td>Steromaster 照明器&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-562-21</td><td>公司已不再供货</td></tr><tr><td>外科 Dumont #7 镊子&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>硫羰基肼（TCH）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>通用低吸附移液器吸头补充装（0.1–10 &amp;micro;L）</td><td>VWR</td><td>76323-394</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Electron microscopy Services&amp;nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Veet 凝胶乳霜脱毛膏</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>3116875</td><td></td></tr><tr><td>白色抗静电六角称量皿，中号，64 × 15 × 19 mm</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S38975</td><td></td></tr><tr><td>适用于 Windows 的 WinDAQ/100 软件</td><td>DATAQ Instruments, Inc.</td><td>版本 3.38</td><td>可免费下载。https://www.dataq.com/products/windaq/</td></tr><tr><td>ZEISS AxioCam Icc 1</td><td>ZEISS</td><td>57615</td><td></td></tr></tbody></table>

三氯化铁诱导的动脉血栓形成及用于三维电子显微镜分析的样本采集

Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis

心血管疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因。异常血栓形成是糖尿病和肥胖等全身性疾病以及动脉粥样硬化、癌症和自身免疫性疾病等慢性炎症性疾病的常见特征。当血管受损时，凝血系统、血小板和内皮通常协同作用，在损伤部位形成血凝块以防止出血。该过程的异常可导致过度出血或失控性血栓形成/抗血栓活性不足，进而引起血管闭塞及其继发后果。FeCl₃3-诱导的颈动脉损伤模型是研究血栓形成起始与进展过程的重要工具 体内该模型涉及内皮损伤/剥脱以及损伤部位随后发生的血栓形成，可提供一种高度敏感且定量的检测方法，用于监测不同程度血管损伤所引发的血管损害及血栓形成。经过优化后，该标准技术可用于研究血栓形成背后的分子机制，以及生长中血栓内血小板的超微结构变化。该检测方法还可用于评估抗血栓和抗血小板药物的疗效。本文介绍了如何启动并监测 FeCl₃ 诱导的小鼠颈动脉血栓形成模型。, 颈动脉, 血小板, 血栓形成, 血管损伤, FeCl₃, 动物模型, 血栓, 活体显微镜, 血小板聚集3诱导的动脉血栓形成，以及如何采集样本用于电子显微镜分析。

数据通常以闭塞时间或形成完全闭塞性血栓所需的时间来表示。这些数据可绘制为Kaplan-Meier生存曲线（图4A）19，也可绘制为点图，图中柱状条表示在血流停止或实验终止时的末梢血流水平（图4B），或以折线图形式展示（图4C）。该技术也可用于研究血栓的稳定性。在大多数情况下，经FeCl3损伤后，血栓逐步形成，随着血栓增大，血流逐渐减少，直至血管完全闭塞时血流降至零。在某些情况下，血流在持续数分钟的逐渐下降后突然回升，此现象被解释为生长中血栓的部分脱落，可视为一次栓塞事件（图4D）。此外，也可利用该方法研究闭塞性血栓的形态学特征（图7A）。
表1：FeCl实验中的潜在技术挑战3诱导的...

本方案描述了如何利用三氯化铁（FeCl3）介导的损伤诱导动脉血栓形成，以及如何在血栓形成的各个阶段收集和制备动脉损伤样本，用于电子显微镜分析。

心血管疾病是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因。异常血栓形成是诸如……等全身性疾病的常见特征。

通过该方法，可以确定血小板和止血系统中的哪些组分对血栓形成具有重要作用。此外，该方法还可确定在细胞水平上血栓生长和结构如何受到影响。该技术的主要优势在于，它能够以可重复的方式在结构层面上研究血栓形成的多个阶段。初次使用该技术的人员应避免过度接触手术区域的组织。过度操作可能导致出血，并使颈动脉的辨认变得过于复杂。在暴露颈动脉后，用两条直径为 0.1 毫米的手术线松松地环绕该区域，随后开始标记损伤部位。将探针置于下端结扎线远端的动脉下方。将塑料片置于两条结扎线之间的动脉下方，以标记氯化铁损伤的位置。在实施损伤前记录血流测量值，以获取基础血流量。将浸有氯化铁的滤纸贴于动脉上持续三分钟以造成损伤。三分钟后移除滤纸，以防止损伤程度不一，并便于探头进行血流计数。在损伤部位添加生理盐水，以清除残留的过量氯化铁。监测流速读数。当流速降至初始值的50%以下时，移除探头。迅速擦干该区域，并添加固定剂对外部损伤区域进行固定。接下来，立即用镊子夹住靠近损伤区域的动脉。在下端结扎线的远端和上端结扎线的近端进行剪切。将组织以采集时相同的方位置于塑料组织培养皿中，并加入数滴固定液。使用手术刀清理动脉周围的多余组织。通过将一端横向切割、另一端切成锥形或斜形，以确保记录血流方向。将样本在室温下置于固定液中固定一小时，随后将样本保存在4摄氏度的1%多聚甲醛中，直至置于湿冰上送检进行电子显微镜分析。数据以Kaplan-Meier生存曲线、点图（带状条表示在血流停止或实验终止时的终末血流量）或线图形式绘制。在某些情况下，血流在缓慢下降数分钟后突然增加，提示正在形成的血栓部分脱落，被视为栓塞事件。该方法也用于研究闭塞性血栓的形态学特征。在血栓形成过程中及时采集样本是最重要的步骤，因为该过程的延迟可能导致对我们的结构分析产生误判。

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氯化铁诱导的动脉血栓形成和用于3D电子显微镜分析的样本采集

本文描述了在小鼠中通过FeCl3诱导血栓形成的模型。该方法通过肠系膜血管的活体显微镜观察以及颈动脉血流测量来监测血栓的生长。...

颈动脉和肠系膜血管的氯化铁诱导血栓小鼠模型

我们的目标是设计、制造并测试用于捕获内皮细胞的铁磁性支架。对10个支架进行了断裂测试，另10个支架进行了残余磁性测试。最后，对10个支架进行了测试 体外...

用于内皮细胞捕获与滞留的铁磁性裸金属支架

本方案描述了联合近红外荧光（NIRF）成像与微型计算机断层扫描（microCT）技术用于可视化脑血栓栓塞的应用。该技术可实现对血栓负荷及其演变过程的定量分析。NIRF成像技术可用于观察离体脑组织中荧光标记的血栓，而microCT技术则利用金纳米颗粒在活体动物体内实现血栓的可视化。...

结合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞

我们报道了一种改良的三氯化铁（FeCl3）诱导的颈动脉、肠系膜动脉以及静脉血栓形成模型，该模型可通过活体显微镜高效地监测闭塞性血栓形成的时间。...

氯化铁诱导的小鼠血栓形成模型

本文介绍了对一种已得到充分表征且常用的小动物氯化铁（FeCl3）诱导颈动脉损伤模型进行必要的改进，以适用于大型动物血管损伤模型。该改进后的模型可用于临床前试验，评估预防性和溶栓性药物及机械干预措施的效果。...

氯化铁诱导的犬颈动脉血栓形成：一种血管损伤的大动物模型

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通过光谱学与扫描电子显微镜分析β-淀粉样蛋白诱导的纤维蛋白凝块结构异常

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全面分析脑血栓细胞成分的方法

本文介绍了一种用于止血性血栓形成的穿刺损伤实验方法。所形成的血栓体积较大，直径可达数百微米，因此适用于三维成像技术。我们建议采用拼接的大范围透射电子显微镜成像作为一种分辨率较高且易于广泛获取的技术，并详细描述了相应的样品制备方案。...

穿刺伤止血及用于拼接大范围电子显微镜分析的样品制备

本研究介绍了一种利用氯化铁诱导大鼠上矢状窦血栓形成的可重复、微创动物模型的建立方案，该方法结合丝线结扎技术，并采用激光散斑血流成像和高分辨率超声进行评估。...

改良氯化铁诱导上矢状窦血栓形成模型的建立

我们描述了利用主动脉窦和升主动脉的精密切片，结合组织化学和免疫组织化学分析，对小鼠模型中的动脉粥样硬化病变进行定量和表征的实验方法。...

小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变的定量分析与表征

了解氯化铁诱导动脉血栓形成的方法，用于三维电子显微镜分析样本采集。该技术可研究血栓生长和结构变化的细胞机制，为心血管疾病治疗提供可重复的实验框架。

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