生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

目前，我们对疟原虫肝脏感染的生物学机制了解仍然有限。本实验方案帮助我们构建了大量转基因品系，从而解答了有关该生物体生物学的一些关键问题。要开发出对抗疟疾感染的新工具和新方法，必须首先深入理解该寄生虫及其生物学特性。

我们在此描述的转基因方法帮助我们解析了该生物体以及宿主的一些关键且复杂的生物学特性。本实验操作将由我的实验室主管Carson Bowers进行演示。在制备伯氏疟原虫（P. Berghei）感染小鼠并实施安乐死后，于无菌环境中从两只感染小鼠收集两毫升血液，加入含有五毫升Elsevier溶液的容器中。

在室温下以 450 ×g 离心血液 8 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 毫升完全 RPMI 培养基中。再次离心细胞悬液，并将沉淀重悬于 25 毫升完全 RPMI 培养基中。

将细胞悬液转移至带有滤膜瓶盖的T75培养瓶中，在轻度振荡条件下孵育以保持细胞悬浮状态。孵育结束后，收集500 µL样品。离心后将沉淀重悬于10 µL完全RPMI培养基中。

接下来，制备薄血涂片。用吉姆萨染液对血涂片进行染色，并确定裂殖体的出现频率。为获得最佳转染效率，应有60%至70%的寄生虫处于裂殖体阶段。

通过在50毫升离心管中将13毫升密度梯度储备液重新配制，制备梯度离心缓冲液。将25毫升血液培养物转移至一个新的50毫升离心管中。然后使用窄口玻璃移液管，小心地将20毫升梯度离心缓冲液沿离心管底部缓慢加入，形成梯度层，确保缓冲液与培养基之间有清晰的分界。

将配制好的缓冲液和培养基在室温下以450 × g离心20分钟，离心过程中不刹车。使用巴斯德吸管，小心吸取培养基与梯度离心缓冲液界面处的裂殖体层，并将其转移至一个新的50毫升离心管中。

将分离的裂殖体重悬于完全RPMI培养基中，并将总体积增加至40毫升。离心后弃去上清液，再将裂殖体重悬于10毫升完全RPMI培养基中。然后，将该溶液每1毫升转移至1.5毫升微量离心管中，用于每次转染，并在16,000 G离心5秒以沉淀感染的细胞。

接下来，将100 µL室温的电穿孔缓冲液与5 µg目的质粒DNA在1.5 mL微量离心管中混合。感染细胞离心后，弃去上清液，并将细胞小心地重悬于已配制好的核转染溶液加质粒DNA的混合液中。然后将细胞悬液转移至电穿孔比色皿中，使用合适的核转染程序进行转染。

接下来，向电穿杯中加入 100 微升完全 RPMI 培养基。将全部溶液转移至 1.5 毫升微量离心管中，并置于冰上。从接种后两天开始，每天检测接种了转染裂殖体小鼠的寄生虫血症水平。

一旦确认感染，通过口服给药并自由提供饮水的方式开始药物筛选。从吡罗米胺治疗开始后的第六天起，利用血涂片监测寄生虫血症。当寄生虫血症达到至少1%时，将寄生虫转移至未经处理的B6小鼠，以建立红细胞期寄生虫储备株。

当寄生血症达到2%至5%时，制备菌种并进行冷冻保存。在蚊虫感染前一天，通过将装有37摄氏度温水的手套放置在含有雄性和雌性蚊虫的笼子上方，分离雌性蚊虫。使用昆虫吸虫器收集被热源吸引的雌性蚊虫，并将其转移到较小的笼子中用于感染。

在蚊虫喂食与感染当天，测定感染的B6小鼠的寄生虫血症水平。寄生虫血症水平在2%至5%之间最适合蚊虫感染。确认寄生虫血症水平后，将麻醉的小鼠仰卧置于装有雌蚊的笼子上方，使雌蚊叮咬小鼠，从而完成感染转移。

手动展开小鼠的前腿和后腿，以提供最大的表面积供蚊子吸血。将感染的小鼠留在每个笼子中15分钟，每隔5分钟检查一次，确保小鼠未清醒。吸血过程完成后，对小鼠实施安乐死，并按照所在机构的指导方针安全处理尸体。

为验证蚊虫感染是否成功，可在感染后10天用镊子去除蚊虫的末端腹部节段，分离其中肠组织。随后在偏振光下观察中肠，以检测卵囊的存在。在感染后18天，解剖5至10只蚊虫，评估其中存在的子孢子数量。

为了分离并计数子孢子，用镊子或精细解剖针轻轻按压蚊子的胸部，同时小心地移除其头部。唾液腺将随被移除的头部一起取出。接着，清除唾液腺上的其他蚊体残渣，并将其置于含有400 µL蚊子解剖液的微量离心管中。

然后用30号针头的注射器将分离的唾液腺反复推注15至20次以进行破碎。随后，取10 µL破碎后的唾液腺悬液加入蚊子解剖液中，滴加至血细胞计数板进行计数。最后，将唾液腺重新悬浮于所需浓度的蚊子解剖液或PBS中，用于注射小鼠或长期冷冻保存。同时提供了显微镜图像，显示感染小鼠血液培养物中成熟与未成熟的P. berghei裂殖体。

显示了蚊子头部的显微镜图像，其中在解剖过程中唾液腺仍保持完整，以及在低倍和高倍放大下的解剖后唾液腺。PB中绿色荧光信号的产生，GFP 11感染的HEPA GFP 1至10宿主细胞表明了寄生泡的裂解。重要的是要小心去除chaisson层，而不破坏梯度界面。

此外，熟练地在分离子孢子时可靠地去除与头部相连的唾液腺需要一定的练习。分离后，转基因子孢子可冷冻保存，或直接用于体内或体外感染研究。