Name: 生成转基因 伯氏疟原 虫孢子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学习利用转基因技术制备伯氏疟原虫孢子，通过电穿孔转染和蚊媒感染建立稳定转基因株系。该方法为疟疾疫苗研发及宿主-寄生虫相互作用研究提供关键技术平台。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目AI168307（SPK 获得）支持。&#160; 我们感谢佐治亚大学CTEGD流式细胞术核心实验室和佐治亚大学CTEGD显微成像核心实验室。我们还感谢Ash Pathak、Anne Elliot以及佐治亚大学Sporocore团队在优化本实验方案过程中所做出的贡献。我们特别感谢Daichi Kamiyama博士提供的宝贵见解、讨论以及含有GFP11和GFP1-10的母体质粒。同时，我们也要感谢Kurup实验室成员始终如一的支持、耐心与鼓励。

本实验室所有涉及脊椎动物的研究均按照乔治亚大学动物使用指南和方案进行。
1. 伯氏疟原虫（P. berghei）感染小鼠的制备
<ol>
	<li>使用野生型P. berghei寄生虫在6至8周龄的雄性或雌性C57BL/6（B6）小鼠中启动血液阶段感染。具体操作为：将冻存的P. berghei感染血液（含2 × 105个感染红细胞），用400 µL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬后，通过腹腔内（i.p.）注射方式接种至一只或两只供体小鼠。</li>
	<li>在感染后第5天（d.p.i.），通过眶后采血法采集供体小鼠的新鲜血液，并将其转移至两只未经感染的B6小鼠体内。具体操作为：采集200 µL血液，加入300 µL PBS重悬，随后向每只受体小鼠腹腔内注射200 µL。确保此时供体小鼠的寄生虫血症水平为2%–5%19,20。</li>
	<li>从受体小鼠感染后第2天（d.p.i.）开始，按照先前描述的方法监测寄生虫血症19,20。当寄生虫血症达到3%–5%（约在感染后第5天）时，实施安乐死并经心脏穿刺或眶后采血收集血液。安乐死方法可采用二氧化碳吸入后行颈椎脱位，或依照机构相关规定执行。 
	&#8203;注意：一旦寄生虫血症超过5%，由于多重感染红细胞的比例增加，转染效率可能降低。</li>
</ol>
2. 体外培养裂殖子的制备
<ol>
	<li>在无菌环境下，从步骤1.3中的感染小鼠采集血液（两只小鼠共约2 mL），加入5 mL阿氏液（见材料表）。步骤2.1至3.12均需在无菌条件下进行。 
	注意：无菌条件包括佩戴手套、用70%乙醇擦拭手套和操作表面、使用无菌耗材和试剂，并在生物安全柜内操作。</li>
	<li>将血液在室温下以450 × g 离心8分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL完全RPMI培养基中（RPMI 1640，含20%胎牛血清[FBS]和1%青霉素-链霉素，v/v）。</li>
	<li>在室温下以450 × g 离心8分钟。将沉淀重悬于25 mL完全RPMI培养基中，转移至带滤膜盖的T75培养瓶中。</li>
	<li>置于36.5 °C、5% CO2 的培养箱中，轻轻振荡以保持细胞悬浮，培养16小时。</li>
	<li>在培养16小时时，检查裂殖体发育情况。取500 µL样品，以450 × g 离心8分钟，将沉淀重悬于10 µL完全RPMI培养基中，制备薄血涂片。用吉姆萨染液19（见材料表）染色血涂片，并确定裂殖体的频率（图1）。</li>
	<li>为获得最佳转染效率，应有60%–70%的寄生虫处于裂殖体阶段。若低于此阈值，则继续按步骤2.4进行培养，并每小时检查一次，确保达到上述阈值后再进行后续操作。</li>
</ol>
3. 转染Plasmodium裂殖体
<ol>
	<li>通过在50 mL离心管中将13 mL密度梯度储存液（参见材料表）与1.44 mL 1.5 M NaCl和5.6 mL 0.15 M NaCl混合，配制梯度离心缓冲液。</li>
	<li>将25 mL血液培养物转移至一个新的50 mL离心管中。使用细口玻璃移液管，小心地将20 mL梯度离心缓冲液沿管壁缓慢加入离心管底部，形成梯度层。注意不要扰动液体层及界面，确保缓冲液与培养基之间有清晰的分界。</li>
	<li>在室温下以450 × g 离心20分钟，不启用刹车。使用巴斯德移液管小心吸取位于培养基与梯度离心缓冲液界面处的裂殖体层15，并将其转移至一个新的50 mL离心管中。</li>
	<li>用完全RPMI培养基重悬分离得到的裂殖体，并将总体积调至40 mL。在室温下以450 × g 离心8分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL完全RPMI培养基重悬裂殖体。然后，为每次转染分别取1 mL该悬液加入1.5 mL微量离心管中，并以16,000 × g 离心5秒，使感染的红细胞沉淀。以上述方法从两只小鼠获得的感染红细胞可用于最多10次独立的转染实验。</li>
	<li>在室温下，为每次转染分别在独立的1.5 mL微量离心管中将100 µL电穿孔缓冲液（电穿孔试剂盒中的核转染溶液；参见材料表）与5 µg环状或线性化目标质粒DNA（体积不超过10 µL）混合。每次实验必须设置一个&#34;无质粒&#34;对照样本，用于转染和抗生素筛选的对照。</li>
	<li>离心后弃去步骤3.5中的上清液，小心地将感染的红细胞重悬于已配制好的核转染溶液+质粒DNA（来自步骤3.6）中。</li>
	<li>将悬液（核转染溶液 + 质粒 + 裂殖体；最大体积110 µL）转移至电穿孔比色皿中。使用合适的核转染程序（U-033，参见材料表）进行转染。 
	注意：确保步骤3.8至3.10在室温下操作。</li>
	<li>向比色皿中加入100 µL完全RPMI培养基，将全部溶液（总体积现为200 µL）转移至1.5 mL微量离心管中，并在室温下保存。</li>
	<li>将200 µL转染后的寄生虫溶液经尾静脉（i.v.）注射入小鼠体内，操作过程中应尽量缩短从转染完成到注射结束的时间。 
	&#8203;注意：为最大限度提高实验效率，转染后的裂殖体应在电穿孔后5分钟内注射入小鼠体内。</li>
</ol>
4. 转染寄生虫的筛选
<ol>
	<li>从接种后第2天开始，每天检测接种了转染裂殖体的小鼠的寄生虫血症水平，以确认感染情况。</li>
	<li>一旦确认感染，即开始通过饮水口服给药的方式进行药物筛选，提供含药物的饮用水 随意摄取. 
	注意：本实验使用乙胺嘧啶作为质粒的可筛选药物标记。在此情况下，将17.5 mg乙胺嘧啶加入250 mL洁净水中（终浓度为70 mg/L）。此外，向该水中加入10 g蔗糖，以促进小鼠充分摄入含乙胺嘧啶的饮水。</li>
	<li>从乙胺嘧啶处理开始后的第6天起，每隔两天使用5 µl血液制备血涂片，监测寄生虫血症。若15天后仍未检测到寄生虫，则表明转染失败；此时应从步骤1.1重新开始，进行新一轮尝试。</li>
	<li>当寄生血症达到至少1%时，将寄生虫转移至 naive B6 小鼠，以建立血液期寄生虫种子库。在新感染的小鼠中继续筛选，直至寄生血症达到2%–5%，此时制备种子库并进行冷冻保存21.</li>
</ol>
5. 蚊子感染转基因品系
<ol>
	<li>通过尾静脉注射，用含有选定寄生虫的200 µL血液感染B6小鼠（每只小鼠接种2 × 105个感染红细胞）。在蚊子饲喂和感染当天测定这些小鼠的寄生虫血症水平。2%–5%的寄生虫血症水平最适合蚊子感染。确认后，立即按照步骤5.2–5.4将感染转移至雌性Anopheles stephensi蚊子。 
	注意：用于感染蚊子的培养箱应维持在20.5 °C、80%湿度，并保持12小时光照/12小时黑暗的循环（光照时间为上午07:00至晚上07:00）。</li>
	<li>在蚊子感染前一天，通过在同时饲养雄性和雌性蚊子的笼子上方放置热源（例如装有加热至37 °C水的薄塑料袋或手套）来分离雌性蚊子。使用昆虫吸虫器移除被热源吸引的雌性蚊子，并将其转移到另一个较小的独立笼子中用于感染。 
	注意：雄性蚊子可通过其略小的体型和羽状触角与雌性蚊子区分。</li>
	<li>给感染的小鼠注射全身麻醉剂（例如2%三溴乙醇/阿佛丁）。通过用力捏压每只小鼠的足垫来确认是否完全麻醉。若小鼠无反应，则表明已充分镇静，可进行蚊子感染操作。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠腹侧朝下放置在装有雌性蚊子（来自步骤5.2）的笼子上方。手动分开小鼠的前后肢，以提供最大的蚊子取食表面积。每笼小鼠放置15分钟，每隔5分钟检查一次，确保小鼠未苏醒。取食完成后，采用颈椎脱臼法或根据机构动物使用规程对小鼠实施安乐死，并安全处理尸体。</li>
</ol>
6. 子孢子的收集
<ol>
	<li>在感染后约10天检查蚊子中肠中的卵囊，以确认感染成功及发育情况 疟原虫 在蚊虫体内，用镊子去除腹部末端节段，从腹部分离出蚊虫中肠。在偏振光下观察中肠，检查是否存在卵囊。22.</li>
	<li>野生型子孢子预计在蚊子吸食感染小鼠血液后18至21天出现在其唾液腺中。在第18天，解剖5至10只蚊子以评估子孢子数量。 
	注意：蚊子用乙醇清洗并处死。随后，将死亡的蚊子用PBS洗涤两次，以在解剖前去除碎片。</li>
	<li>为了分离并计数子孢子，使用镊子或细解剖针轻轻按压蚊子的胸部，同时小心移除蚊子头部。唾液腺将随被移除的头部一起取出。图2).</li>
	<li>去除唾液腺上的其他蚊虫碎片，将其放入含有 400 µL 蚊子解剖液（DMEM 培养基 [Dulbecco's modified Eagle medium]，添加 1% 小鼠血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的微量离心管中；参见 材料表).</li>
	<li>将分离的唾液腺通过30 G针头注射器反复推注15–20次以破碎组织。取10 µL破碎后的唾液腺悬液加入蚊子解剖液，置于血细胞计数板中进行计数。根据实验需要，用适当浓度的蚊子解剖液或PBS重悬，用于注射小鼠、接种细胞培养或长期冷冻保存。23,24.</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

我们已在实验室中使用上述方案构建了多个转基因品系 P. berghei 寄生虫。尽管已针对 P. berghei，我们还成功地利用该方案制备了转基因 P. yoelii 子孢子。将转染的裂殖体注射入小鼠后，通常在感染后3天内即可在所有组别（包括无质粒对照组）检测到寄生虫。只有在检测到寄生虫血症后才开始药物筛选，以确保电穿孔后寄生虫的存活能力。此外，在进行药物筛选前，可能需要用盐酸酸化饮水，使pH降至4，以确保乙胺嘧啶充分溶解。&#160;我们预期无质粒对照组小鼠体内的寄生虫将被完全清除，而转染组小鼠则持续保持感染状态。对照组小鼠体内的寄生虫通常在开始乙胺嘧啶治疗后5至8天内被清除。值得注意的是，感染了 P. berghei 可能出现实验性脑型疟疾的体征并死亡（应根据人道终点标准进行处理）&#160;机构动物使用指南），通常在感染后6-12天进行。通过在TCRaKO小鼠中对转染子实施药物筛选可避免此问题。25，或通过将感染后第5天正在接受筛选的寄生虫转移至新的B6受体小鼠，并在后者中继续筛选。转基因技术在 疟原虫...

尽管在药物研发以及疟疾预防和治疗研究方面已取得进展，全球疟疾的疾病负担仍然很高。每年有超过50万人死于疟疾，其中死亡率最高的是生活在疟疾流行地区（如撒哈拉以南非洲）的儿童1疟疾由疟原虫寄生虫引起 疟原虫，通过雌性蚊虫叮咬传播给人类 按蚊属 唾液腺中携带寄生虫的蚊子。该寄生虫的感染阶段 疟原虫子孢子在吸血过程中被注入脊椎动物宿主的皮肤，随后经血液循环迁移至肝脏细胞并建立感染，在此经历必需的发育阶段（即疟疾的红细胞前体期），之后再感染红细胞。红细胞的感染标志着疟疾血液期的开始，并导致该疾病相关的全部发病与死亡。2,3.
红细胞前阶段发育的专性特性 疟原虫 使其成为预防性疫苗和药物研发的有吸引力靶点4研究红细胞前疟疾生物学以及开发靶向肝期的疫苗或药物，其前提是能够获得 疟原虫 子孢子。此外，我们能够产生基因修饰的 疟原虫 子孢子在这些研究工作的成功中起到了关键作用5,6,7,8,9转基因 疟原虫 表达荧光或生物发光报告蛋白的细胞系使我们能够追踪其发育过程 体内 和 体外10,11. 通过缺失多个基因而产生的遗传减毒寄生虫（GAPs）， 疟原虫，也是最有希望的疫苗候选者之一12,13.
啮齿类和非人灵长类疟疾模型帮助我们理解了人类疟疾中宿主与寄生虫相互作用的机制，这得益于不同疟原虫在生物学特性与生活史上的相似性 疟原虫 物种14的使用 疟原虫 感染啮齿类动物但不感染人类的物种（例如， P. berghei可在生物安全等级1的受控环境中维持疟原虫完整的生活周期，并产生具有感染性的子孢子，用于肝期疟疾的研究。目前已存在多种独立的实验方案，用于转基因红内期疟原虫的制备 疟原虫 寄生虫15，蚊虫感染16和子孢子的分离17在此，我们概述了一种综合性的实验方案，结合上述方法以生成并分离转基因个体 P. berghei 子孢子，利用新型转基因菌株 PbGFP11 例如.&#160;PbGFP11 转运超折叠绿色荧光蛋白（GFP）的第11个β-链，GFP11,&#160;进入宿主肝细胞内形成的寄生泡（PV）。 PbGFP11&#160;与表达构成GFP 1-10片段（GFP1-10) 在细胞质中（Hepa GFP1-10 细胞） PbGFP11 通过自互补作用及功能性GFP的重新形成，在宿主肝细胞中报告PV裂解并产生绿色荧光信号18值得注意的是，GFP11 以七段串联序列的形式编码 PbGFP11&#160;以增强最终的荧光信号。染色后 PbGFP11&#160;用细胞质染料CellTrace Violet（CTV）标记子孢子后，可对寄生虫进行追踪。此类经CTV染色的细胞内寄生虫发生裂解时，CTV会释放到宿主细胞胞质中，从而标记宿主细胞。此外，该方法还可用于观察和区分寄生虫的裂解过程 疟原虫 PV和/或宿主肝细胞中的寄生虫，该系统可被可靠地用于通过遗传学或治疗性干预这些通路的分子组分，来研究负责上述任一过程的免疫通路。

<table><tbody><tr><td>30 G x 1/2&quot; 注射器针头</td><td>Exel international</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>Alsever溶液</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>A3551-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa 基本寄生虫核转染试剂盒 2</td><td>Lonza</td><td>VMI-1021</td><td></td></tr><tr><td>Avertin（2,2,2-三溴乙醇）</td><td>TCI America</td><td>T1420</td><td></td></tr><tr><td>血液采集管</td><td>BD bioscience</td><td>365967</td><td>用于血清采集</td></tr><tr><td>C-Chip 一次性血细胞计数板</td><td>INCYTO</td><td>DHC-N01-5</td><td></td></tr><tr><td>CellVeiw 细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627860</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5425</td><td>Eppendorf</td><td>5405000107</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5910R</td><td>Eppendorf</td><td>5910R</td><td>用于梯度离心</td></tr><tr><td>Delta Vision II - 倒置显微镜系统</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D5879-500ml</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GenClone</td><td>25-525</td><td></td></tr><tr><td>GFP11 质粒</td><td>Kurup Lab</td><td>pSKspGFP11</td><td>由 PL0017 质粒构建</td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>48900-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>Hepa GFP1-10 细胞</td><td>Kurup Lab</td><td>Hepa GFP1-10</td><td>由 Hepa 1-6 细胞（ATCC 目录号 CRL-1830）构建</td></tr><tr><td>小鼠血清</td><td></td><td></td><td>用于蚊子解剖培养基</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SX0420-5</td><td>用于 Percoll 溶液的 1.5 M 和 0.15 M 溶液</td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems (Lonza)</td><td></td><td>使用程序 U-033 进行红细胞电穿孔</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll（密度梯度储备液）</td><td>Cytivia</td><td>17-0891-02</td><td>详见实验方案</td></tr><tr><td>PL0017 质粒</td><td>BEI Resources</td><td>MRA-786</td><td></td></tr><tr><td>乙胺嘧啶（口服给药）</td><td>Sigma</td><td>46706</td><td>配制说明：将 17.5 mg 乙胺嘧啶加入 2.5 mL DMSO 中。必要时涡旋以完全溶解；用 HCl 将 225 mL 的 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 调至 pH 4；将 DMSO 中的乙胺嘧啶加入水中并定容至 250 mL；加入 10 g 糖以促进小鼠规律饮用含药水。乙胺嘧啶对光敏感。处理小鼠时应使用棕色瓶或铝箔包裹的瓶子。</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SoftWoRx 显微成像软件</td><td>Applied Precision</td><td>v6.1.3</td><td></td></tr></tbody></table>

生成基因修饰的plasmodium berghei子孢子

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

疟疾是一种由寄生虫引起的致命疾病 疟原虫 并通过雌性蚊虫的叮咬传播 按蚊属 蚊子。疟原虫的子孢子阶段 疟原虫 由蚊子注入脊椎动物宿主皮肤的疟原虫会在肝脏中经历一个必需的发育阶段，之后才会引发临床疟疾。我们对这一阶段的生物学特性知之甚少。 疟原虫 肝脏中的发育；获取子孢子阶段以及能够对这些子孢子进行遗传修饰是研究其生物学特性的重要工具 疟原虫 感染及其在肝脏中引发的免疫反应。在此，我们提供了一种转基因小鼠制备的全面方案 疟原虫伯氏疟原虫 子孢子。我们对裂殖体阶段进行基因改造 P. berghei 并使用此形式进行感染 按蚊属 蚊虫吸血时。在转基因寄生虫于蚊体内发育后，我们从蚊子的唾液腺中分离出寄生虫的子孢子阶段，用于后续研究。 体内 和 体外 实验。我们通过产生一种新型菌株的子孢子来验证该方案的有效性 P. berghei 表达绿色荧光蛋白（GFP）亚基11（GFP11，并展示其在肝期疟疾生物学研究中的应用。

确定裂殖体的频率及其发育状态对于确保有足够数量且处于最佳转染阶段的活性寄生虫至关重要。未成熟的裂殖体与完全成熟的裂殖体可通过其内部裂殖子数量来区分：未成熟裂殖体所含裂殖子较少，且未充满红细胞内的全部空间（图1B）。需要注意的是，在从培养血液制备血涂片时，感染的红细胞可能会破裂，导致在血涂片中观察到游离的细胞外裂殖子（图1）。此类裂殖子不应计入步骤2.5中裂殖体频率的评估。
对于不熟悉蚊子生理结构或微型解剖操作的研究人员而言，从蚊子中分离唾液腺可能具有挑战性。在分离蚊子唾液腺时，应注意唾液腺呈半透明状，可借此将其与不透明的蚊体碎片区分开来（图2）。在破坏唾液腺后计数子孢子时，使用400倍放大倍数最为高效，而采用相差显微镜则有助于在计数板中更清晰地识别子孢子。
我们已证明，肝细胞中超过90%的Plasmodium可能通过细胞内在免疫机制...

疟疾通过子孢子阶段的接种传播 疟原虫 通过感染的蚊子传播。转基因 疟原虫 使我们能够更深入地理解疟疾的生物学特性，并直接推动了疟疾疫苗的研发工作。在此，我们描述了一种简化的转基因制备方法 疟原虫伯氏疟原虫 子孢子

生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

疟疾是一种由疟原虫（Plasmodium）引起的致命性疾病，通过雌性按蚊的叮咬传播。疟原虫的生活史中，子孢子阶段……

目前，我们对疟原虫肝脏感染的生物学机制了解仍然有限。本实验方案帮助我们构建了大量转基因品系，从而解答了有关该生物体生物学的一些关键问题。要开发出对抗疟疾感染的新工具和新方法，必须首先深入理解该寄生虫及其生物学特性。我们在此描述的转基因方法帮助我们解析了该生物体以及宿主的一些关键且复杂的生物学特性。本实验操作将由我的实验室主管Carson Bowers进行演示。在制备伯氏疟原虫（P. Berghei）感染小鼠并实施安乐死后，于无菌环境中从两只感染小鼠收集两毫升血液，加入含有五毫升Elsevier溶液的容器中。在室温下以 450 ×g 离心血液 8 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 毫升完全 RPMI 培养基中。再次离心细胞悬液，并将沉淀重悬于 25 毫升完全 RPMI 培养基中。将细胞悬液转移至带有滤膜瓶盖的T75培养瓶中，在轻度振荡条件下孵育以保持细胞悬浮状态。孵育结束后，收集500 µL样品。离心后将沉淀重悬于10 µL完全RPMI培养基中。接下来，制备薄血涂片。用吉姆萨染液对血涂片进行染色，并确定裂殖体的出现频率。为获得最佳转染效率，应有60%至70%的寄生虫处于裂殖体阶段。通过在50毫升离心管中将13毫升密度梯度储备液重新配制，制备梯度离心缓冲液。将25毫升血液培养物转移至一个新的50毫升离心管中。然后使用窄口玻璃移液管，小心地将20毫升梯度离心缓冲液沿离心管底部缓慢加入，形成梯度层，确保缓冲液与培养基之间有清晰的分界。将配制好的缓冲液和培养基在室温下以450 × g离心20分钟，离心过程中不刹车。使用巴斯德吸管，小心吸取培养基与梯度离心缓冲液界面处的裂殖体层，并将其转移至一个新的50毫升离心管中。将分离的裂殖体重悬于完全RPMI培养基中，并将总体积增加至40毫升。离心后弃去上清液，再将裂殖体重悬于10毫升完全RPMI培养基中。然后，将该溶液每1毫升转移至1.5毫升微量离心管中，用于每次转染，并在16,000 G离心5秒以沉淀感染的细胞。接下来，将100 µL室温的电穿孔缓冲液与5 µg目的质粒DNA在1.5 mL微量离心管中混合。感染细胞离心后，弃去上清液，并将细胞小心地重悬于已配制好的核转染溶液加质粒DNA的混合液中。然后将细胞悬液转移至电穿孔比色皿中，使用合适的核转染程序进行转染。接下来，向电穿杯中加入 100 微升完全 RPMI 培养基。将全部溶液转移至 1.5 毫升微量离心管中，并置于冰上。从接种后两天开始，每天检测接种了转染裂殖体小鼠的寄生虫血症水平。一旦确认感染，通过口服给药并自由提供饮水的方式开始药物筛选。从吡罗米胺治疗开始后的第六天起，利用血涂片监测寄生虫血症。当寄生虫血症达到至少1%时，将寄生虫转移至未经处理的B6小鼠，以建立红细胞期寄生虫储备株。当寄生血症达到2%至5%时，制备菌种并进行冷冻保存。在蚊虫感染前一天，通过将装有37摄氏度温水的手套放置在含有雄性和雌性蚊虫的笼子上方，分离雌性蚊虫。使用昆虫吸虫器收集被热源吸引的雌性蚊虫，并将其转移到较小的笼子中用于感染。在蚊虫喂食与感染当天，测定感染的B6小鼠的寄生虫血症水平。寄生虫血症水平在2%至5%之间最适合蚊虫感染。确认寄生虫血症水平后，将麻醉的小鼠仰卧置于装有雌蚊的笼子上方，使雌蚊叮咬小鼠，从而完成感染转移。手动展开小鼠的前腿和后腿，以提供最大的表面积供蚊子吸血。将感染的小鼠留在每个笼子中15分钟，每隔5分钟检查一次，确保小鼠未清醒。吸血过程完成后，对小鼠实施安乐死，并按照所在机构的指导方针安全处理尸体。为验证蚊虫感染是否成功，可在感染后10天用镊子去除蚊虫的末端腹部节段，分离其中肠组织。随后在偏振光下观察中肠，以检测卵囊的存在。在感染后18天，解剖5至10只蚊虫，评估其中存在的子孢子数量。为了分离并计数子孢子，用镊子或精细解剖针轻轻按压蚊子的胸部，同时小心地移除其头部。唾液腺将随被移除的头部一起取出。接着，清除唾液腺上的其他蚊体残渣，并将其置于含有400 µL蚊子解剖液的微量离心管中。然后用30号针头的注射器将分离的唾液腺反复推注15至20次以进行破碎。随后，取10 µL破碎后的唾液腺悬液加入蚊子解剖液中，滴加至血细胞计数板进行计数。最后，将唾液腺重新悬浮于所需浓度的蚊子解剖液或PBS中，用于注射小鼠或长期冷冻保存。同时提供了显微镜图像，显示感染小鼠血液培养物中成熟与未成熟的P. berghei裂殖体。显示了蚊子头部的显微镜图像，其中在解剖过程中唾液腺仍保持完整，以及在低倍和高倍放大下的解剖后唾液腺。PB中绿色荧光信号的产生，GFP 11感染的HEPA GFP 1至10宿主细胞表明了寄生泡的裂解。重要的是要小心去除chaisson层，而不破坏梯度界面。此外，熟练地在分离子孢子时可靠地去除与头部相连的唾液腺需要一定的练习。分离后，转基因子孢子可冷冻保存，或直接用于体内或体外感染研究。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

生成转基因 伯氏疟原 虫孢子

斯氏按蚊是分布在印度及整个亚洲的疟疾传播媒介。本视频展示了对该蚊种进行显微注射的技术，通过导入可使蚊子对疟疾产生抗性的外源基因。本视频所展示的大部分方法同样适用于其他蚊种的显微注射技术。...

显微注射斯氏按蚊胚胎以培育抗疟疾蚊子

通过将两种基因型不同的寄生虫喂给蚊子，可实现啮齿类疟原虫的遗传杂交。在允许蚊子叮咬感染小鼠后，从小鼠血液中分离并克隆重组子代。本视频展示了如何对Plasmodium...

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在本视频中，我们介绍了核转染技术，这是一种基于电穿孔的转染方法，用于将编码荧光报告蛋白的质粒DNA导入鸡艾美球虫（Eimeria）的子孢子阶段寄生虫中。...

寄生虫形态的核转染：一种基于电穿孔的转染方法将编码荧光蛋白的质粒导入子孢子细胞核

本视频展示了脑型疟疾小鼠实验模型的建立。从感染疟原虫的按蚊中分离出的子孢子被用于感染小鼠，以模拟人类脑型疟疾的病理过程。 疟原虫伯氏疟原虫将感染的雌性蚊子注入被固定的实验小鼠尾静脉，可导致血脑屏障破坏和脑部炎症，从而引发脑型疟疾。该感染小鼠模型为研究脑型疟疾提供了重要的工具 体内...

利用宿主蚊媒来源的子孢子建立小鼠实验性脑型疟疾模型

本视频展示了一种使用减毒子孢子对小鼠模型进行免疫的实验方法。将经辐射减毒的疟原虫子孢子注射至小鼠耳背部。在双耳多个位点完成注射后，让小鼠恢复。...

小鼠模型中使用减毒活子孢子进行皮内免疫

本文介绍了一种从小鼠皮肤及引流淋巴结中分离髓系细胞的实验方案，该方法适用于在皮肤内注射疟原虫（Plasmodium）子孢子后的情况。对所获取细胞进行流式细胞术分析，可可靠地检测皮肤及引流淋巴结对寄生虫引发的炎症反应特征。...

小鼠皮肤及引流淋巴结中髓系细胞的分离——基于活体减毒疫苗皮内免疫后 疟原虫 子孢子

我们描述了一种实验性脑型疟疾的小鼠模型，并展示了如何追踪炎症和微血管病理变化 体内 使用磁共振成像。...

体内追踪实验性脑型疟疾模型中水肿发展及微血管病理变化的磁共振成像研究

由于啮齿类疟原虫在生命周期和生物学特性上与人类疟原虫具有显著相似性，啮齿类疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的工具。本文中，我们对野生型和转基因啮齿类疟原虫进行表型分析时所使用的一些最重要技术进行了标准化。...

啮齿类疟原虫无性与有性血液阶段及蚊期阶段的表型分析

我们描述了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在Plasmodium...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

化学遗传学涉及在靶位点处将看门残基替换为含有不同侧链的氨基酸。在此，我们构建了一种含有cdpk1功能低下等位基因的突变寄生虫，并鉴定了该突变背景下寄生虫所采用的补偿性通路。...

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

疟原虫的有性发育发生在蚊子的中肠内。靶向寄生虫的有性阶段是阻断传播的一种有前景的策略。我们开发了Ookluc，这是一种在合子形成后表达纳米荧光素酶的转基因P.

Ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的Plasmodium berghei菌株

学习利用转基因技术制备伯氏疟原虫孢子，通过电穿孔转染和蚊媒感染建立稳定转基因株系。该方法为疟疾疫苗研发及宿主-寄生虫相互作用研究提供关键技术平台。

生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

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