生成转基因 伯氏疟原 虫孢子

目前，我们对肝脏疟原虫感染的生物学了解有限。该协议帮助我们产生了许多转基因系，这些系有助于回答有关生物体生物学的一些关键问题。需要对寄生虫及其生物学有基本的了解，才能开发新的工具和方法来对抗疟疾感染。

我们在这里描述的转基因方法帮助我们破译了生物体和宿主的一些关键和复杂的生物学。演示此程序的将是我的实验室经理 Carson Bowers。在产生P.Bergehei感染的小鼠并对其进行安乐死后，在无菌环境中将两只受感染小鼠的两毫升血液收集到五毫升的爱思唯尔溶液中。

在室温下以 450 G 离心血液 8 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10毫升完全RPMI培养基中。再次离心细胞悬液，并将沉淀重悬于25毫升完全RPMI培养基中。

将细胞悬液转移到带有过滤盖的 T75 培养瓶中，并通过轻轻摇动孵育以保持细胞悬浮。在孵育结束时，收集 500 微升样品。离心并将沉淀重新悬浮在10微升完全RPMI培养基中。

接下来，准备薄薄的血涂片。用Giemsa染色剂染色血涂片并确定裂殖症的频率。为了获得最佳转染效率，60%至70%的寄生虫应处于裂殖期。

通过在 50 毫升离心管中复溶 13 毫升密度梯度储备培养基来制备梯度离心缓冲液。将 25 毫升血培养物转移到新鲜的 50 毫升离心管中。然后小心地将 20 毫升梯度离心缓冲液分层到离心管底部，使用窄玻璃移液管创建梯度柱并确保缓冲液和培养基之间的清晰划分。

将制备的缓冲液和培养基以 450 G 离心 20 分钟，在室温下不间断。使用牧场移液器，小心地去除培养基和梯度离心缓冲液界面处的裂殖层。将其放入新的 50 毫升离心管中。

将分离的裂殖体重悬于完整的RPMI培养基中，并将总体积增加到40毫升。离心并弃去上清液后，将裂殖细胞重悬于10毫升完全RPMI培养基中。然后将 1 毫升该溶液转移到 1.5 毫升微量离心管中，用于每次转染，并通过以 16， 000 G 离心 5 秒钟来沉淀感染的细胞。

接下来，在室温下将 100 微升电穿孔缓冲液与 5 微克靶质粒 DNA 混合在 1.5 毫升微量离心管中。离心感染细胞后，除去上清液，小心地将细胞重悬于制备的核电子溶液和质粒DNA中。然后将悬浮液转移到电穿孔、比色皿中，并使用合适的核分子程序进行转染。

接下来，向比色皿中加入 100 微升完整的 RPMI 培养基。将整个溶液转移到1.5毫升微量离心管中，并将其置于冰上。从接种后两天开始每天验证接种转染的裂殖子小鼠的寄生虫血症水平。

一旦确诊感染，开始药物选择，口服药物并随意饮用水。从焦胸胺治疗开始后 6 天开始使用血涂片监测寄生虫血症。当寄生虫血症达到至少1%时，将寄生虫转移到幼稚的B6小鼠身上，以产生血液阶段的寄生虫原液。

一旦寄生虫血症达到 2%-5%，就会产生原液并冷冻保存。在蚊子感染前一天，将装满加热至37摄氏度的水的手套放在装有雄性和雌性蚊子的笼子上，将雌性蚊子分开。使用昆虫吸痰器清除被热源吸引的雌性蚊子，并将它们转移到较小的笼子中进行感染。

在蚊子喂养和感染当天，确定受感染的B6小鼠中的寄生虫血症。2%-5%的寄生虫血症是蚊虫感染的最佳药物。在验证寄生虫血症后，通过将麻醉的小鼠置于胸骨卧位下的笼中雌蚊上，将感染转移到雌性蚊子身上。

手动展开前腿和后腿，为蚊子喂食提供最大的表面积。将受感染的小鼠留在每个笼子中15分钟，每五分钟检查一次以确保小鼠没有醒来。一旦喂养完成并且小鼠被安乐死，请按照机构的指南安全处理它们。

为了验证蚊子内的成功感染，在感染后10天用镊子取出末端腹段，以隔离蚊子的中肠。然后在偏振光下观察中肠，以检测卵囊的存在。在感染后 18 天，解剖 5 至 10 只蚊子以评估存在的孢子数量。

为了分离和计数子孢子，小心地去除蚊子的头部，同时用镊子或细解剖针对胸部施加压力。唾液腺将保持附着在切除的头部上。接下来，从唾液腺中取出任何其他蚊子碎片，并将它们放入含有400微升蚊子解剖培养基的微量离心管中。

然后将分离的唾液腺通过 30 号针头注射器 15 至 20 次来破坏它们，然后，将 10 微升被破坏的唾液腺放入蚊子解剖培养基中并计数。最后，将唾液腺重新悬浮在所需浓度的蚊子解剖培养基或PBS中，以便注射到小鼠体内或长期冷冻保存。与描绘寄生小鼠血培养中成熟和未成熟伯氏疟原虫裂殖片的显微镜图像一样。

就像蚊子头的显微镜图像一样，唾液腺在解剖过程中仍然完好无损，并且显示了在较低和较高放大倍率下解剖的唾液腺。在PB、GFP 11感染的HEPA、GFP中产生绿色荧光信号，GFP的1-10个宿主细胞表明寄生液泡裂解。在不破坏梯度界面的情况下小心地去除沉箱层非常重要。

此外，在孢子光隔离期间，可靠地去除唾液腺和头部需要一些练习。分离后，转基因子孢子可以冷冻保存或新鲜用于体内或体外感染研究。