功能性内胚层肝类器官的生成

我们的研究旨在开发与人体相关的体外肝脏模型，用于药物疗效和安全性测试，在临床前研究中密切模拟健康和患病的肝组织。重现完整的肝脏复杂性、实现长期功能、标准化方案以及扩大高通量应用的类器官生产仍然是类器官研究的主要实验挑战。我们最近从健康的肝脏类器官中模拟了肝纤维化，并从患者来源的细胞中建立了肝罕见病模型，包括瓜氨酸血症和丙酮酸羧化酶缺乏症。与其他方法不同，我们的 eHEPO 方案可快速、大规模地提供功能性肝脏类器官，支持长期功能和来自一个一致起始群体的多种检测。

[旁白]首先，将 6 毫升冷 DMEM/F-12 加入 15 毫升锥形管中。立即将 80 微升 FOD 基底膜基质或 BMM 加入试管中并充分混合。在组织培养处理的孔板上涂上 BMM 溶液，然后分配溶液以覆盖孔板表面。将板在 37°C 培养箱中孵育至少一小时。取诱导型多能干细胞或IPSC板并吸出IPSC特异性培养基。用DMEM / F-12或DPBS冲洗板，并将1毫升特定酶加入6孔板的一个孔中。孵育一分钟后，吸出酶并将板在37°C下孵育5至7分钟。接下来，向板中加入 1 毫升预热的 IPSC 培养基，轻轻敲击侧面以将未分化的菌落聚集体从板表面分离。用 5 毫升血清移液器轻轻混合悬浮液，然后将细胞悬液以所需密度接种到 BMM 包被孔上。将细胞在 37°C 下孵育三到五天，以达到 70% 的汇合度。在开始分化之前，用内胚层培养基替换IPSC培养基。细胞在分化后获得尖刺形状，表明细胞间相互作用。用PBS冲洗内胚层细胞。加入 300 微升胰蛋白酶。并将细胞在培养箱中孵育五分钟。向细胞中加入 3 毫升冷 DMEM/F-12，并用 1,000 微升过滤吸头移液以生成单个细胞。将细胞悬液收集在 15 毫升锥形管中，并在室温下以 300 x g 离心细胞 5 分钟。弃去上清液后，用10毫升FACS缓冲液洗涤沉淀。要制作单细胞悬浮液，请用 100 微米网状过滤器过滤细胞，然后用 40 微米网状过滤器过滤细胞，然后将细胞悬液离心五分钟。用 105 微升 FACS 缓冲液重悬 1500 万个细胞，并在悬浮液中加入 45 微升 FcR 和 15 微升 EpCAM 中。将细胞在 4°C 下孵育 10 分钟，保护试管免受光照。然后加入500微升FACS缓冲液洗涤细胞悬液。离心细胞后，将沉淀重悬于500微升FACS缓冲液中，并在细胞悬液中加入0.5微摩尔每毫升DAPI以定量死细胞。细胞分选后，将细胞以 300 x g 离心五分钟。除去上清液。并将 3,000 至 5,000 个细胞重悬于 20 微升 BMM 中。通过向每个 48 孔板的中心添加一滴 BMM 来接种细胞，并在 37°C 下孵育细胞两分钟，直到 BMM 凝固。用膨胀介质覆盖液滴。要分裂类器官液滴，请丢弃类器官培养基并向孔中加入 500 微升冷 Ad-DMEM/F-12。使用 1,000 微升过滤吸头用力移液 BMM 液滴。将最多 10 个 BMM 液滴收集到 15 毫升锥形管中，并加入 5 毫升冷 Ad-DMEM/F-12。将试管放在冰上三到五分钟。在4°C下以200×g离心细胞5分钟，然后弃去上清液，直到剩余1毫升上清液。使用 200 微升过滤吸头用力移液细胞沉淀 30 至 40 次。机械解离后，加入 5 毫升冷 Ad-DMEM/F-12，然后离心细胞 5 分钟。弃去上清液。并将悬浮液放在冰上。接种 50 微升 BMM 液滴。并在膨胀介质中加入25纳克/毫升BMP7。培养三天后，用分化培养基替换培养基，并将细胞培养至少14天。进行免疫染色分析以验证源自 EpCAM+ 细胞的类器官是否致力于肝谱系。CK19+ 和 HNF4ɑ+ 细胞的存在表明类器官中存在肝母细胞和胆管祖细胞。此外，表达上皮组织标记物的类器官，例如 E-CAD+ 细胞和表达 ZO-1 的立方体或多面体上皮细胞，表明细胞之间存在紧密连接。免疫组化显示，E-CAD+细胞呈现多边形上皮结构，反映肝细胞样表型。eHEPO的透射电子显微镜图像如下所示。白色圆圈表示细胞间连接复合物。黑色箭头显示顶端表面分化。红色箭头显示微绒毛的横截面。qPCR分析显示，类器官获得了成熟的肝细胞标志物，如ALB、A1AT、CYP3A4和CYP3A7。PAS染色中的粉红色染色区域表示类器官的糖原储存能力。此外，我们的分析表明，类器官能够将ALB分泌到培养基中，消除培养基中的氨，CYP3A4酶活性和胆汁酸转运能力。