Name: 功能性内胚层肝类器官的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学习快速可重复的内胚层肝类器官生成方案，两周内获得功能性eHEPOs并长期扩增超过一年。该方法为肝脏疾病研究与再生医学提供可靠的三维模型工具。

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本研究由土耳其科学技术研究理事会（TÜBİTAK）资助 通过 项目 SBAG-115S465 和 SBAG-213S182。 图1 使用 BioRender 生成。

<ol><li>Huch, M., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mouse+and+human+development+using+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling mouse and human development using organoid cultures.</a> Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).</li>
<li>Marsee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+consensus+on+definition+and+nomenclature+of+hepatic%2C+pancreatic%2C+and+biliary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+reproducible+production+of+liver+buds+entirely+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+organoids+for+the+analysis+of+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases.</a> JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).</li>
<li>Ramli, M. N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Akbari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((long-term+culture+of+endoderm-derived+hepatic+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).</li>
<li>Meisenheimer, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proluciferin+acetals+as+bioluminogenic+substrates+for+cytochrome+P450+activity+and+probes+for+CYP3A+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition.</a> Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).</li>
<li>Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADME+evaluation%3A+dialing+in+CYP+selectivity+with+luminogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminogenic+cytochrome+P450+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Luminogenic cytochrome P450 assays.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li>
<li>Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+liver+medicine+using+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-generation liver medicine using organoid models.</a> Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+organization+in+hepatocyte+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological organization in hepatocyte organoid cultures.</a> American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).</li>
<li>Shinozawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+drug-induced+liver+injury+screen+using+human+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids.</a> Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+hepatobiliary+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。作者声明无利益冲突。Esra Erdal 是 ORGANO-ID 生物技术公司的联合创始人。

本方案详细描述了一种从诱导性多能干细胞（iPSCs）出发，生成、扩增以及冻存/复苏肝类器官的综合性方法。该方案涵盖了所有步骤，包括在饲养层及无饲养层条件下培养iPSCs、二维内胚层分化、通过流式细胞分选（FACS）富集前体细胞并形成类器官，以及生成获得功能的类器官。此外，还提供了对类器官进行验证和表征的详细操作说明。目前成熟且具有功能的肝细胞广泛应用的主要障碍在于原代肝细胞来源有限、无法实现肝细胞的长期扩增，以及细胞的低温冻存困难15,16。将iPSC技术与类器官技术相结合，为获得无限量的功能性肝细胞提供了强有力的工具。
在该实验方案的前5天，使用Activin A、Wnt3A和R-spo1将iPSCs诱导分化为内胚层细胞。R-spo1作为Wnt信号通路的激动剂蛋白，可促进EpCAM+细胞数量的增加10。当获得的EpCAM+细胞融合度超过60%–70%时，表明内胚层分化效果良好。为实现这一目标，iPSCs的大小和细胞融...

类器官是在三维培养条件下生长的微型器官样结构，能够模拟器官的微环境，并包含器官发育过程中自我组织和自我更新所必需的内在因素。类器官可来源于多能干细胞（PSCs）或成体组织来源的细胞（干细胞或前体细胞）1。尽管其精确的器官样结构和特定器官的功能相似性使其成为疾病建模的重要工具，但在培养标准化方面仍需进一步改进。特别是，目前已发表多种肝脏类器官的构建方案，这些方案在复杂性和可重复性方面存在差异2。例如，Takebe 等人开发的肝芽类器官是由以下诱导性多能干细胞（iPSCs）形成的致密多细胞结构：肝内胚层前体细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和间充质干细胞（MSCs）。然而，这些类器官不具备长期自我更新能力3,4。
从历史角度来看，Huch 等人首次报道了来源于成人组织的人肝上皮类器官的构建，其中细胞具有极性并特化，能够再现天然上皮组织的某些特征5。随后，Guan 等人利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肝类器官建立了Alagille综合征（ALGS）模型，ALGS是一种与肝脏内胆管减少相关的罕见遗传病6。这两种类器官均具备自我更新能力，并可获得成熟肝细胞的功能，例如胆汁和白蛋白分泌、糖原储存以及肝脏特异性的药物解毒功能。在最近的一项研究中，Ramli 等人提出了一种由多能干细胞（PSC）衍生的肝类器官模型，该模型包含极化的肝细胞样细胞（HLCs）之间形成的具有功能的胆小管网络，可将胆汁淤积性药物排入由胆管细胞样细胞（CLCs）构成的胆道样囊泡中7。
本研究介绍了一种独特的培养方法，用于生成由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的内胚层肝类器官，称为eHEPOs。文中逐步描述了iPSC的培养及其向内胚层的分化过程，并展示了从富集的EpCAM+前体细胞生成eHEPOs的方法。最后，阐述了eHEPOs功能特性与结构组织的表征，以及类器官的冷冻保存方法。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴箱</td><td>N&amp;uuml;ve</td><td>210.NB9</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C、5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Memmert</td><td>INCO 153</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 和 40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350/ 352340</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Sigma</td><td>1009832511</td><td></td></tr><tr><td>A1AT</td><td>Abcam</td><td>ab166610</td><td>稀释比例：1/500（IF），1/50（IHC）</td></tr><tr><td>A-83.01（TGF-&amp;beta; 抑制剂）</td><td>Tocris Biosciene</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Isolab</td><td>9,01,026</td><td></td></tr><tr><td>粘附式显微镜载玻片</td><td>Histobond</td><td>C981040</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM-F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>AFP</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>稀释比例：1/25（IHC）</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>EMS</td><td>10200</td><td></td></tr><tr><td>ALB</td><td>Abcam</td><td>ab10241</td><td>稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488（小鼠）</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>稀释比例：1/1000（IF）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488（兔）</td><td>Invitrogen</td><td>A110034</td><td>稀释比例：1/1000（IF）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594（小鼠）</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>稀释比例：1/1000（IF）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594（兔）&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td>稀释比例：1/1000（IF）</td></tr><tr><td>氨检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK-310</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-202936</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂 50x</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>Sakura</td><td>4216</td><td></td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>生物安全二级柜</td><td>Thermo</td><td>SAFE 2020</td><td></td></tr><tr><td>校准移液器</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>胆酰甘氨酰氨基荧光素</td><td>Corning</td><td>451041</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液 pH 6.0</td><td>Bio-optica</td><td>15-M103</td><td></td></tr><tr><td>CK-18</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-51582</td><td>稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）</td></tr><tr><td>CK-19</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6278</td><td>稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>低温操作手套和眼部防护</td><td>Cryokit</td><td>5274</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Roche</td><td>11718096001</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>a5942</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&amp;nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8426</td><td>稀释比例：1/100（IF），1/20（IHC）</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Sigma500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 试剂盒</td><td>Fortis life sciences bethyl</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 包埋试剂盒</td><td>EMS</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>中性树胶（Entellan）</td><td>Merck</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>1% 伊红 Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110332</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>稀释比例：1/11（FACS）</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>1,00,98,32,511</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26010066</td><td></td></tr><tr><td>福斯科林（FSK）</td><td>Tocris Biosciene</td><td>1099</td><td></td></tr><tr><td>冻存容器（Mr. Frosty）</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>冻存培养基</td><td>Gibco</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Isolab</td><td>084.01.001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛，电镜级</td><td>EMS</td><td>16210-1L</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>62-6520</td><td>稀释比例：1/1000（IHC）</td></tr><tr><td>山羊抗兔 HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>稀释比例：1/1000（IHC）</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Gibco</td><td>162-10-072</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>107209</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Millipore</td><td>HX86017674</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Abcam</td><td>ab55223</td><td>稀释比例：1/50（IHC）</td></tr><tr><td>冰和干冰</td><td>自制</td><td>自制</td><td></td></tr><tr><td>65 &amp;deg;C 培养箱</td><td>N&amp;uuml;ve</td><td>EN 400</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>人胃泌素 I（Leu15）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>发光仪</td><td>Berthold Tech</td><td>LB 960</td><td></td></tr><tr><td>预混液&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>43676659</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质，hESC 认证</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质，无酚红</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Axygen</td><td>321-02-501</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>AXIO VERT A1</td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>Feather</td><td>S35, C35</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>sc-05850</td><td></td></tr><tr><td>多孔悬浮培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,21,500</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂 100x</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Tekkim</td><td>TK.60161.05001</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>EMS</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo 检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>V9001</td><td></td></tr><tr><td>Pap-pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Tekkim</td><td>TK.200661.01002</td><td></td></tr><tr><td>PAS 染色试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab150680</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>be17-516</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>磷钨酸</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Axygen</td><td>Motopet-1</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪（varioskan flash）&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>5250040</td><td></td></tr><tr><td>Prolong 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷，电镜级</td><td>EMS</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500 Fast&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>重组人 Activin A</td><td>R&amp;D</td><td>338-Ac-050</td><td></td></tr><tr><td>重组人 BMP7</td><td>Peprotech</td><td>120-03</td><td></td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>Peprotech</td><td>af-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF19</td><td>Peprotech</td><td>100-32</td><td></td></tr><tr><td>重组人 HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Rho 激酶抑制剂 Y-27632 二盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase/DNase 的 1.5 mL 管</td><td>Axygen</td><td>31108101</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase/DNase 的滤芯吸头</td><td>Sarstedt</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>旋转式切片机</td><td>Leica</td><td>RM 2245</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Rspo1 条件培养基</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide master</td><td>Bio-optica</td><td>15-MEQ001</td><td></td></tr><tr><td>Sorenson&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>EMS</td><td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合器</td><td>Thermo</td><td>MY SPIN 6</td><td></td></tr><tr><td>无菌刻度移液管</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Leica</td><td>3802240</td><td></td></tr><tr><td>修块机</td><td>Leica</td><td>EM TRIM2</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Thermo</td><td>88880018</td><td></td></tr><tr><td>Wnt 替代-Fc 融合蛋白</td><td>ImmunoPrecise</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>16446</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td>稀释比例：1/400（IF）</td></tr></tbody></table>

功能性内胚层肝类器官的生成

Generation of Functional Endodermal Hepatic Organoids

类器官技术使我们能够在体外生成多种类似人类器官的微型结构，例如肝脏、大脑和肠道的类器官。in vitro。类器官模型的显著进展最近为疾病建模、发育生物学和药物发现等领域的各种应用开辟了新的实验时代。成体干细胞或诱导&#160;多能干细胞（iPSC）来源的肝类器官可用于生成肝细胞，以满足多种应用需求。本文介绍了一种从多能干细胞生成肝类器官的稳健且可重复的实验方案。该方案适用于健康个体及患者来源的细胞。为获得三维内胚层来源的肝类器官（eHEPOs），首先将iPSC直接分化为内胚层细胞，然后通过FACS富集EpCAM阳性（EpCAM+）细胞，并利用扩增培养基建立肝类器官。我们提供了一种快速高效的方法，可在2周内生成肝类器官。所生成的类器官模拟了肝细胞的关键特性和功能，例如白蛋白分泌、糖原储存以及细胞色素P450酶活性。除了表现出与肝脏特异性基因表达相似的特征外，eHEPOs还包含具有胆小管结构的极化上皮细胞。此外，eHEPOs可在长期（长达1年）内进行扩增和连续传代，同时不丧失其向成熟肝细胞分化的潜能。因此，eHEPOs为功能性肝细胞的获取提供了替代来源。

首先，将人成纤维细胞或外周血单个核细胞（PBMC）进行培养并重编程为诱导多能干细胞（iPSCs） 通过 附加体重编程。新鲜的敲除血清对于获得健康的iPSCs至关重要。随后，将iPSCs以50%-60%的融合度接种至BMM包被的培养板中。保持iPSC克隆处于较小或中等大小有助于提高分化效率。接着，将iPSCs在含有Activin A、Wnt3a和R-spo1因子的培养基中诱导分化为定型内胚层，持续5天。在分化过程中，细胞数量和体积显著增加，因此必须注意及时更换培养基。在内胚层分化结束时，通过荧光激活细胞分选（FACS）方法富集EpCAM+细胞，将分选后的细胞嵌入BMM中，并在扩增培养基（EM）中培养10-14天。类器官形成能力依赖于新鲜的培养基成分和高纯度的细胞群体，因此，成功的细胞分选是关键步骤。当eHEPOs的尺寸大于 100 &#181;m 当细胞融合度达到70%-80%时，进行解离。eHEpO具有长期培养（1年）的能力，所获得的eHEpO可进行冷冻保存。融合度为70%-80%的四个类器官液滴最适合用于冷冻保存。在启动成熟/分化之前进行类器官分割步骤非常关键。大型类器官在分化过程中存活率会下降。本研究中，将所获得的...

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。

类器官技术使我们能够在体外生成多种类似人类器官的微型结构，例如肝脏、脑和肠道的类器官。

我们的研究旨在开发与人体相关的体外肝脏模型，用于药物疗效和安全性测试，在临床前研究中密切模拟健康和患病的肝组织。重现完整的肝脏复杂性、实现长期功能、标准化方案以及扩大高通量应用的类器官生产仍然是类器官研究的主要实验挑战。我们最近从健康的肝脏类器官中模拟了肝纤维化，并从患者来源的细胞中建立了肝罕见病模型，包括瓜氨酸血症和丙酮酸羧化酶缺乏症。与其他方法不同，我们的 eHEPO 方案可快速、大规模地提供功能性肝脏类器官，支持长期功能和来自一个一致起始群体的多种检测。[旁白]首先，将 6 毫升冷 DMEM/F-12 加入 15 毫升锥形管中。立即将 80 微升 FOD 基底膜基质或 BMM 加入试管中并充分混合。在组织培养处理的孔板上涂上 BMM 溶液，然后分配溶液以覆盖孔板表面。将板在 37°C 培养箱中孵育至少一小时。取诱导型多能干细胞或IPSC板并吸出IPSC特异性培养基。用DMEM / F-12或DPBS冲洗板，并将1毫升特定酶加入6孔板的一个孔中。孵育一分钟后，吸出酶并将板在37°C下孵育5至7分钟。接下来，向板中加入 1 毫升预热的 IPSC 培养基，轻轻敲击侧面以将未分化的菌落聚集体从板表面分离。用 5 毫升血清移液器轻轻混合悬浮液，然后将细胞悬液以所需密度接种到 BMM 包被孔上。将细胞在 37°C 下孵育三到五天，以达到 70% 的汇合度。在开始分化之前，用内胚层培养基替换IPSC培养基。细胞在分化后获得尖刺形状，表明细胞间相互作用。用PBS冲洗内胚层细胞。加入 300 微升胰蛋白酶。并将细胞在培养箱中孵育五分钟。向细胞中加入 3 毫升冷 DMEM/F-12，并用 1,000 微升过滤吸头移液以生成单个细胞。将细胞悬液收集在 15 毫升锥形管中，并在室温下以 300 x g 离心细胞 5 分钟。弃去上清液后，用10毫升FACS缓冲液洗涤沉淀。要制作单细胞悬浮液，请用 100 微米网状过滤器过滤细胞，然后用 40 微米网状过滤器过滤细胞，然后将细胞悬液离心五分钟。用 105 微升 FACS 缓冲液重悬 1500 万个细胞，并在悬浮液中加入 45 微升 FcR 和 15 微升 EpCAM 中。将细胞在 4°C 下孵育 10 分钟，保护试管免受光照。然后加入500微升FACS缓冲液洗涤细胞悬液。离心细胞后，将沉淀重悬于500微升FACS缓冲液中，并在细胞悬液中加入0.5微摩尔每毫升DAPI以定量死细胞。细胞分选后，将细胞以 300 x g 离心五分钟。除去上清液。并将 3,000 至 5,000 个细胞重悬于 20 微升 BMM 中。通过向每个 48 孔板的中心添加一滴 BMM 来接种细胞，并在 37°C 下孵育细胞两分钟，直到 BMM 凝固。用膨胀介质覆盖液滴。要分裂类器官液滴，请丢弃类器官培养基并向孔中加入 500 微升冷 Ad-DMEM/F-12。使用 1,000 微升过滤吸头用力移液 BMM 液滴。将最多 10 个 BMM 液滴收集到 15 毫升锥形管中，并加入 5 毫升冷 Ad-DMEM/F-12。将试管放在冰上三到五分钟。在4°C下以200×g离心细胞5分钟，然后弃去上清液，直到剩余1毫升上清液。使用 200 微升过滤吸头用力移液细胞沉淀 30 至 40 次。机械解离后，加入 5 毫升冷 Ad-DMEM/F-12，然后离心细胞 5 分钟。弃去上清液。并将悬浮液放在冰上。接种 50 微升 BMM 液滴。并在膨胀介质中加入25纳克/毫升BMP7。培养三天后，用分化培养基替换培养基，并将细胞培养至少14天。进行免疫染色分析以验证源自 EpCAM+ 细胞的类器官是否致力于肝谱系。CK19+ 和 HNF4ɑ+ 细胞的存在表明类器官中存在肝母细胞和胆管祖细胞。此外，表达上皮组织标记物的类器官，例如 E-CAD+ 细胞和表达 ZO-1 的立方体或多面体上皮细胞，表明细胞之间存在紧密连接。免疫组化显示，E-CAD+细胞呈现多边形上皮结构，反映肝细胞样表型。eHEPO的透射电子显微镜图像如下所示。白色圆圈表示细胞间连接复合物。黑色箭头显示顶端表面分化。红色箭头显示微绒毛的横截面。qPCR分析显示，类器官获得了成熟的肝细胞标志物，如ALB、A1AT、CYP3A4和CYP3A7。PAS染色中的粉红色染色区域表示类器官的糖原储存能力。此外，我们的分析表明，类器官能够将ALB分泌到培养基中，消除培养基中的氨，CYP3A4酶活性和胆汁酸转运能力。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

功能性内胚层肝类器官的产生

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。...

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

本方案描述了小鼠肝外胆管三维类器官系统的构建方法。这些胆管类器官可在体外培养中维持生长，用于研究胆管上皮细胞的生物学特性。胆管类器官表达胆管前体细胞和成熟胆管细胞的标志物，并由具有极性的上皮细胞组成。...

从小鼠肝外胆管生成类器官

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。...

生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin...

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

本文详细描述了人多能干细胞来源的小肠和结肠类器官的生成、维持及表征方法。这些方法旨在提高实验可重复性，扩大可扩展性，并减少类器官接种和传代所需的工作时间。...

人多能干细胞来源的肠道和结肠类器官的生成、维持与表征

本文介绍一种非遗传学方法，利用从稳态外周血中分离的单个核细胞生成人自体肝类球体。...

用于肝脏疾病研究的外周血来源人肝类球体

我们对现有的肝细胞癌（HCC）类器官培养方案进行了全面概述和优化，涵盖了类器官培养的各个阶段。该体系可作为识别潜在治疗靶点和评估药物候选物有效性的有力模型。...

人肝细胞癌患者来源类器官模型的建立与优化用于潜在靶点识别及药物发现

类器官技术革新了器官发育、药物发现和疾病研究中的个性化组织建模。类器官工程正朝着构建复杂合成组织的方向发展。其目标是整合形态发生、类组装体技术与生物基质，以推动组织工程的进步。本实验方案有助于模拟肝脏器官发生过程，并为合成组织的构建建立指导性规范。...

利用人类细胞系进行肝脏器官发生建模、类组装体构建及合成组织设计的体外培养技术

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

学习快速可重复的内胚层肝类器官生成方案，两周内获得功能性eHEPOs并长期扩增超过一年。该方法为肝脏疾病研究与再生医学提供可靠的三维模型工具。

功能性内胚层肝类器官的生成

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