内源性LC3的超微结构定位-截面相关光电子显微镜

几十年来，在细胞超微结构的背景下定位蛋白质一直是一种强大的研究工具。通过该协议，我们扩展了丰度低或难以定位的蛋白质。我们使用荧光显微镜以灵敏和可筛选的方式标记蛋白质，并将其与电子显微镜相结合以重新填充细胞的超微结构。

在这里，我们将展示自噬蛋白的截面CLEM，但它实际上可以应用于任何对细胞超微结构感兴趣的生物学问题，特别是在罕见事件的研究中。与我一起演示该程序的是我们实验室的高级研究技术人员 Tineke Veenendaal。首先，在预热至37摄氏度的PBS中，用1%明胶代替含有0.15%甘氨酸的PBS。

刮取明胶中的细胞并将其转移到微量离心管中。在室温下在微量离心机中以6,000G沉淀细胞一分钟，然后在不干扰沉淀的情况下除去明胶。将加热至37摄氏度的12%明胶加入沉淀中，并用移液器吸头或预热至相同温度的玻璃牧场移液器轻轻重悬。

在 37 摄氏度下孵育 10 分钟，然后在 6， 000 G 下沉淀细胞一分钟。将明胶在冰上凝固 30 分钟。要从试管中取出明胶包埋的细胞，请用剃须刀片将含有沉淀的管端从试管的其余部分切下。

然后用细胞沉淀垂直于第一次切口将管端切成两半。将含有细胞沉淀的两个管端半部分放入 2.3 摩尔蔗糖中，并在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。这导致细胞沉淀的一半略微收缩并从塑料管中脱落。

从蔗糖中取出带有明胶包埋细胞沉淀的管半部分，然后用镊子从塑料管中取出细胞沉淀半部分。用剃须刀片手动将颗粒切成适当大小的块，并在切割过程中使用立体解剖显微镜放大受试者。将细胞块在 4 摄氏度的 2.3 摩尔蔗糖中孵育过夜。

将它们放在铝制样品架销上。在块的边缘留下足够的蔗糖，使其在块和销钉之间形成一个薄环。快速冷冻并将其储存在液氮中。

修剪块的前部以使其表面变平，以获得大约 250 纳米厚的截面。然后用刀角将 50 到 100 微米切入样品块面的侧面，修剪块的侧面。修剪样品块面的四个边将形成一个大约 250 x 375 微米的矩形。

从突出的矩形中切开一条带状，确保切片的厚度在 70 到 90 纳米之间，并具有银金色光泽。用一根棍子上的一根头发引导部分远离金刚石刀的边缘，形成一条长丝带。通过将 3 毫米的拾音环浸入 2.3 摩尔蔗糖和 2% 甲基纤维素的一对一混合物中来拾取色带。

将环插入切片机的冷冻室中，一旦液滴开始冻结，立即将液滴轻轻按压在切片上，将其拾取。从冷冻室中取出环。等到液滴完全解冻，然后将液滴压在准备好的网格上。

将带有切片的网格放在大约 1 毫升的 PBS 中，放入小培养皿或多孔板中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在石蜡膜上处理约75微升液滴上的网格，并在室温下开始PBS甘氨酸洗涤。在室温下，用由 0.1% 牛血清白蛋白 C 和 0.5% 鱼皮明胶制成的封闭缓冲液在 PBS 中孵育网格 10 分钟作为封闭步骤。

在PBS的封闭缓冲液中稀释一抗，并在室温下将网格在约10微升液滴上孵育1小时。在室温下用PBS中的0.1%牛血清白蛋白洗涤网格五次。稀释PBS中封闭缓冲液中的二抗和DAPI。

然后将网格在大约 10 微升液滴上在室温下孵育 30 分钟或更长时间，然后在 PBS 中洗涤网格五次，如前所述。为了安装用于光学显微镜的样品，在室温下将网格浸入蒸馏水中的50%甘油中两次，持续五分钟。在50%甘油中，在载玻片和盖玻片之间放置一个盖玻片，确保各部分朝向盖玻片。

对于光学显微镜，将带有夹层网格的载玻片带到带有自动载物台的宽视场显微镜上。选择一个高放大倍率油物镜，并创建截面带的图像平铺集。接下来，对于拆卸和电子显微镜或电镜对比，在载玻片盖玻片夹层的侧面加入10微升蒸馏水，等待毛细管作用填充玻璃盖玻片夹层界面。

小心地取下盖玻片，不要将浸油混合到甘油中。用镊子取出网格，并在室温下将它们浸入蒸馏水中三次，以洗掉50%的甘油。用无绒纸巾小心地擦干网格的背面，并将网格部分面朝下放在蒸馏水滴上。

为了在电子显微镜下对切片进行染色以进行对比，请在室温下将它们与醋酸铀酰孵育五分钟。通过将液滴放在冰上金属板上的石蜡膜上来冷却醋酸铀酰甲基纤维素溶液。然后用这种冰冷的溶液清洗网格两次，并将它们在溶液中孵育 10 分钟。

通过将网格干燥环插入每个网格下方的醋酸铀酰甲基纤维素液滴中并轻轻提起，直到网格从液滴上拉出，从而将网格拉出网格。要吸干多余的溶液，请以大约 60 度角将环接触到无绒滤纸上，然后沿着滤纸缓慢拖动，直到不再吸收溶液。将带有网格的环放在合适的架子上，并在室温下干燥 10 分钟以上。

使用光学显微镜获得的概览，在透射电子显微镜或TEM中定位成像的感兴趣区域，并在光学显微镜数据集上注释ROI。选择区域后，在 TEM 中获取放大倍率为 20， 000 倍至 50， 000 倍的图像图块。在后处理软件中重建图像图块集。

在电子显微镜下根据DAPI信号和荧光以及核轮廓进行相关性。移动图像以精确叠加它们并准确执行手动关联。肝母细胞瘤衍生的HEPG2细胞在EBSS中饥饿2小时，然后用4%三聚乙醛固定2小时。

切片上 LC3 和 LAMP1 的 IF 成像显示 LC3 点相对较少，并且与 LAMP1 的共定位很少。通过叠加基于DAPI和核轮廓的两种成像模式，将IF的分子信息与电子显微镜中获得的超微结构信息联系起来。LC3阳性细胞器与EM超微结构的相关性表明，不同的点代表自噬的不同阶段。

此处显示了各个LC3标记隔室的超微结构，如图1所示。左图为相关光电子显微镜图像，右图为伪彩色电子显微镜图像。内外自噬体膜由白色和黑色箭头表示。

有趣的是，EM 将相对较弱的荧光斑点鉴定为 LC3 阳性自溶酶体，其特征是内容物密集和腔内囊泡。这揭示了超薄冷冻切片的 IF 中 LC3 可见度极小，这表明尽管存在降解环境，但在稳态自溶酶体中仍可检测到 LC3。然而，LC3阳性点主要代表自噬体，少数代表自溶酶体。

对于想要进行免疫金标记而不是切片 CLEM 的研究人员，此处描述的方案和提示也完全适用于免疫金标记。我们最初将切片CLEM应用于低丰度的内体调节蛋白，并首次显示了它们的内源性超微结构定位。