利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9与腺相关病毒单导向RNA系统联合构建棕色脂肪特异性基因敲除小鼠
2023年3月24日
在本实验方案中，我们描述了利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统相结合的技术，构建脂肪组织特异性敲除小鼠的方法。所述步骤包括sgRNA的设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及将AAV显微注射至棕色脂肪组织（BAT）叶中的操作。
本方案利用 Cre-LoxP、CRISPR-Cas9 及腺相关病毒单导向 RNA 系统，制备褐色脂肪特异性基因敲除小鼠。方案包含一项手术技术，可安全地将 AAV 注射至褐色脂肪组织。该技术的主要优势在于，无需选择性育种即可快速获得组织特异性的基因敲除小鼠。
如果根据靶器官调整腺相关病毒（AAV）注射的手术操作，该构建组织特异性基因敲除或基因敲低的方法可适用于其他组织。首先，对已麻醉的UCP1 Cre Cas9小鼠皮下注射镇痛剂，以减轻并预防术后疼痛和不适。随后使用剃毛器剃除小鼠肩胛间区域的毛发，并使用碘伏或氯己定类消毒剂进行至少三轮交替消毒，每轮消毒后用70%乙醇擦拭。
使用手术刀，在肩胛骨之间棕色脂肪组织上方的皮肤上做一个两厘米长的切口，以暴露肩胛间脂肪。完成单一切口后，沿脂肪组织远端区域与肌肉的边界剪开脂肪组织。然后用主手持手术剪，钝性并垂直剥离脂肪组织，同时用非主手捏住包括棕色脂肪组织在内的脂肪组织，以暴露棕色脂肪组织。
利用Sulzer静脉作为解剖标志，以确定棕色脂肪组织的精确位置。随后，对每只小鼠，使用连接至100 µL Hamilton注射器的锋利32号针头，将20 µL的腺相关病毒（AAV）缓慢注射至两块棕色脂肪组织的每个叶中。在AAV注射过程中，若注射部位无液体渗漏，则表明注射成功。
在确保稳态后，将暴露的脂肪组织复位至正常位置，使用5-0可吸收单股缝线缝合脂肪组织边缘与肌肉。最后，使用5-0未染色涂层编织VICRYL缝线缝合皮肤切口。棕色脂肪组织的精确位置在未暴露时无法识别，但应避免过度暴露造成组织损伤。
可能导致注射失败的潜在缺陷包括将AAV溶液注射到错误区域、针头穿透组织以及因AAV溶液体积过大导致的组织膨胀。将AAV单导向RNA精确递送至棕色脂肪组织对实验方案的成功至关重要。暴露棕色脂肪组织时成功的关键在于手术剪刀技术，包括剪刀的方向、深度以及Hamilton注射器的位置。
该技术通过构建具有负荷生成能力的组织特异性基因敲除动物，以研究棕色脂肪相关能量代谢的分子调控机制。
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概述
本方案描述了一种利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA技术相结合的方法，以生成棕色脂肪组织（BAT）特异性的基因敲除小鼠。通过使用这些方法，研究人员能够快速构建组织特异性的基因敲除模型，而无需进行选择性育种。
关键研究组成部分
研究领域
- 遗传学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- 棕色脂肪组织对能量代谢至关重要。
- 构建组织特异性基因敲除模型有助于理解生物学过程。
- 该方法有望被改造用于其他组织。
使用的方法
- Cre-LoxP 和 CRISPR-Cas9 技术的应用。
- 使用的小鼠模型：UCP1 Cre Cas9 小鼠。
- 通过手术显微注射给予 AAV-sgRNA。
主要结果
- 成功靶向并敲除棕色脂肪组织。
- 证实了腺相关病毒（AAV）在组织特异性基因编辑中的有效性。
- 验证了实现精确定位递送的关键外科技术。
结论
- 本研究展示了一种快速构建与棕色脂肪代谢相关的基因敲除模型的技术。
- 该技术有助于深入理解能量代谢中的分子调控机制。
常见问题
行业应用价值
利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和AAV-sgRNA技术相结合，可快速生成棕色脂肪组织（BAT）特异性基因敲除小鼠，从而加速代谢研究中的功能基因组学研究。该方法简化了与能量调控相关基因的靶点验证和机制性风险排除，相较于传统育种方式显著缩短了实验周期。该技术通过提供对早期发现和转化研究连续性至关重要的组织特异性信息，支持项目组合决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够直接探究棕色脂肪组织（BAT）中基因功能，以获得明确的机制性认识。
- 通过在与疾病相关的组织中分离基因效应，支持生物学层面的风险降低。
- 有助于提高针对代谢类疾病靶点选择的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的基因敲除模型，用于下游表型筛选。
- 标准化遗传背景，以实现可重复的定量检测结果。
- 通过绕过漫长的繁育周期，加速检测方法的开发。
转化与临床前研究
- 通过特异性编辑棕色脂肪组织（BAT）基因，将临床前模型与人类代谢疾病机制相匹配。
- 通过明确基因对能量代谢的贡献，实现基于风险评估的推进。
- 支持代谢研究从发现到临床前验证的连续性。
流程与工作流整合
该方法整合于早期发现和靶点验证阶段，为代谢和内分泌研究领域的临床前模型开发提供桥梁。
- 发现生物学：支持在棕色脂肪组织介导的能量调节中进行假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复的基因敲除模型，用于定量表型分析。
- 分析：能够在体内检测基因特异性效应对代谢输出的影响。
- 转化研究：促进临床前模型与人类棕色脂肪组织生物学的对接。
- 企业级复用：通过调整腺相关病毒递送方式，该方案可适用于其他组织，支持更广泛的研发生态应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：通过标准化、可重复的流程简化模型构建。
- 战略价值：加快“推进/终止”决策进程，实现资本高效资源配置。
- 项目组合影响：支持对代谢和内分泌靶点进行基于风险调整的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备手术显微注射和棕色脂肪组织解剖定位的专业技术。
- 需要具备腺相关病毒（AAV）制备和CRISPR-Cas9基因编辑技术的基础设施。
- 要求跨团队严格标准化操作以确保可重复性。
- 若需靶向其他组织或器官，必须对实验方案进行相应调整。
- 实验成功依赖于精确的AAV递送以及组织损伤的最小化。
