Name: 使用组合的 Cre-LoxP、CRISPR-Cas9 和腺相关病毒单向导 RNA 系统生成棕色脂肪特异性敲除小鼠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 58 s
Description: 学习利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒单导RNA系统生成棕色脂肪组织特异性敲除小鼠的方法。该技术通过手术显微注射实现快速组织特异性基因编辑，无需选择性育种即可研究能量代谢调控机制。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01DK122808、R01DK102898 和 R01DK132469（授予 Y.-H.T.），以及 P30DK036836（授予乔斯林糖尿病中心糖尿病研究中心）。T. T. 获得了SUNSTAR研究奖学金（Hiroo Kaneda 奖学金，Sunstar 基金会，日本）和美国心脏协会资助项目 903968 的支持。Y. Z. 获得了查尔斯·A·金信托奖学金的支持。我们感谢 Sean D. Kodani 对手稿的仔细校对。

所有动物实验和护理程序均经乔斯林糖尿病中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 在培养细胞中筛选有效的单导向RNA
注意：为了降低检测成本，在将sgRNA包装成AAV颗粒之前，建议先在培养细胞中测试不同的sgRNA 通过 基于慢病毒的 Cas9/sgRNA 表达系统图1）并筛选出敲低效率最高的sgRNA 体内 实验。
<ol>
	<li>CRISPR-Cas9 sgRNA设计
	<ol>
		<li>使用在线工具（如 Broad sgRNA 设计工具，https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）设计 sgRNA20,21，CRISPOR 在线工具（http://crispor.tefor.net/）22及其他可用工具。</li>
		<li>在基因名称框中输入基因名称或DNA靶序列，并选择 NGG 作为SpCas9生成潜在sgRNA序列的原间隔序列邻近基序（PAM）。</li>
		<li>选择具有高预测靶向效率和低脱靶活性的sgRNA。例如，建议使用CRISPOR输出结果中特异性评分至少为50的sgRNA。在通过筛选的特异性sgRNA中，选择效率评分较高的序列23. 
		注意：通常选择三到四个单导向RNA（sgRNA），以确保鉴定出有效的sgRNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CRISPR-Cas9 sgRNA 质粒的构建
	<ol>
		<li>合成编码20个核苷酸（nt）靶向序列的sgRNA寡核苷酸对，其两端（5'和3'）带有来自BsmBI限制性酶切位点的突出端表1）通过DNA合成平台。</li>
		<li>使用BsmBI线性化的lentiCRISPR v2载体连接退火的寡核苷酸对。</li>
		<li>将连接产物转化至 Stbl3 感受态细胞中 大肠杆菌 品系，并使用U6正向引物通过Sanger DNA测序确认sgRNA插入。 
		注意：请参见 Addgene 公司的实验方案《LentiCRISPRv2 和 lentiGuide-Puro：慢病毒 CRISPR/Cas9 与单导向 RNA》中详细的克隆步骤24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生产慢病毒颗粒
	<ol>
		<li>转染前约24小时，将7 x 105 6 cm 组织培养板中含 4 mL 完全生长培养基的 HEK-293 细胞。</li>
		<li>加入15 &#181;L的LT1转染试剂加入250 &#181;L 无血清培养基，室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>为每种sgRNA配制转染混合液 表2 在250 &#181;L 无血清培养基中。将步骤 1.3.2 中配制的转染试剂与质粒混合物混合，室温孵育 20–30 分钟。</li>
		<li>将完全培养基替换为 3.5 mL 新鲜的 HEK-293 细胞培养基，然后将 DNA 转染试剂混合物逐滴加入培养在 3.5 mL 新鲜培养基中的 HEK-293 细胞中。</li>
		<li>转染后12-15小时，更换培养基以去除转染试剂，并加入4 mL新鲜生长培养基。</li>
		<li>孵育24小时后，收集含有慢病毒颗粒的细胞培养基，并通过0.45 μm滤膜过滤培养基。 &#181;m 滤器去除任何 HEK-293 细胞。病毒可在 4 &#176;C下保存数天。对于长期储存，病毒应于−80 &#176;C. 
		注意：制备慢病毒颗粒时应遵循生物安全指南，并在适合处理慢病毒的环境（如生物安全二级或以上实验室）中进行操作。慢病毒的详细制备步骤请参见Addgene发布的《pLKO.1 - TRC克隆载体操作指南》（https://www.addgene.org/protocols/plko/#G）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>棕色前脂肪细胞的感染及sgRNA介导的敲低效果检测
	<ol>
		<li>1 x 10 孔板6 1 mL 含 8 的新鲜培养基中的小鼠永生化棕色前脂肪细胞 &#181;每孔加入含聚凝胺（polybrene）g/mL的溶液，置于6孔板中。 
		注意：本研究中，永生化的棕色前脂肪细胞是使用SV40 T抗原建立的25棕色前脂肪细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。</li>
		<li>从步骤1.3中加入1 mL慢病毒颗粒溶液以感染细胞。同时平行培养一孔未感染的细胞，作为抗生素筛选对照。</li>
		<li>感染后24小时更换为新鲜培养基。加入相应的抗生素（例如，嘌呤霉素，终浓度为1 &#181;g/mL）加入培养基中，以杀死未感染的细胞并筛选出感染成功的细胞。每隔一天更换一次含有筛选抗生素的新鲜培养基，直至所有未感染的对照细胞完全死亡。</li>
		<li>收集病毒感染细胞的蛋白质，通过蛋白质印迹分析测定sgRNA的敲低效率。参照Eslami和Lujan提供的详细蛋白质印迹实验步骤进行操作。26由于不同蛋白质的 turnover 速率存在差异，应检测多个时间点（例如病毒转染后第6天至第12天），以观察蛋白质信号的丢失情况。 
		注意：如果无法获得识别目的基因所编码蛋白的抗体，可 alternatively 使用 Sanger 测序来确定每种 sgRNA 的基因组编辑效率。简言之，使用位于 sgRNA 靶向区域侧翼的引物扩增基因组 DNA，以生成长度约为 700 bp 的 PCR 扩增子。预计的断裂位点应位于测序起始位点下游约 200 bp 处。随后，对 PCR 产物进行 Sanger 测序。利用在线分析工具（如通过分解追踪插入缺失突变（TIDE））分析测序结果，以确定每种 sgRNA 在细胞群体中产生小片段插入缺失突变的频率。27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. AAV-sgRNA 质粒的构建
注意：在此步骤中，从上述筛选中鉴定出的有效sgRNA被克隆至pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP载体中28（图2）。同时，将一个不靶向任何序列的sgRNA（例如TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29），即不识别小鼠基因组中任何序列的非靶向sgRNA，也克隆到相同载体中，作为未编辑对照。
<ol>
	<li>使用 BbsI 线性化 pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP 载体，该酶可产生与合成的 sgRNA 寡核苷酸相同的黏性末端。</li>
	<li>将退火后的寡核苷酸双链与线性化的 pAAV 载体进行连接，并按照步骤 1.2 中所述方法确认 sgRNA 插入正确。 
	&#8203;注意：lentiCRISPRv2-sgRNA 的克隆流程同样适用于 AAV-sgRNA 质粒的构建。</li>
</ol>
3. AAV 包装
<ol>
	<li>将第2节中产生的AAV载体包装为AAV血清型8。根据先前的方案制备高滴度AAV。30，或向病毒核心实验室或商业服务机构申请 AAV 包装服务。将病毒滴度稀释至 1 x 1013 基因组拷贝数/mL 
	&#8203;注意：表达单导向RNA的改造型AAV2基因组被包装至AAV8血清型中。选择该血清型是因其对脂肪组织具有高效转导效率。18,31为防止细胞碎片和少量培养基成分等污染物引发免疫反应，需要使用超纯化的 AAV 在体 注射。通过碘克沙醇梯度和超速离心可实现超纯化。30.</li>
</ol>
4. Ucp1 Cre/Cas9 小鼠的准备
<ol>
	<li>购买在 Ucp1 启动子控制下表达 Cre 重组酶的 Ucp1-Cre 小鼠品系（参见材料表）。购买纯合的 Rosa26-floxed STOP-Cas9 基因敲入小鼠32（参见材料表），其中 Cas9 的表达受 Cre 重组酶依赖性调控。</li>
	<li>如先前所述16,17，将上述品系杂交以获得 Ucp1-Cre/Cas9 小鼠。将所有小鼠饲养于温湿度受控的环境中（23 °C，30% 湿度），维持 12 小时光照-黑暗循环（光照时间：上午 6:30 至下午 6:30），并可自由摄取普通饲料和饮水。</li>
	<li>通过下述方法，用携带对照 sgRNA 或靶向目的基因的 sgRNA 的 AAV 处理所获得的 Ucp1-Cre/Cas9 小鼠。本研究中使用约 30 g 重的 12–15 周龄雄性 Ucp1-Cre/Cas9 小鼠。</li>
</ol>
5. 小鼠棕色脂肪组织AAV注射手术
<ol>
	<li>使用2.5%异氟烷持续吸入麻醉，对小鼠进行诱导和维持麻醉。</li>
	<li>润滑双眼以防止干燥。然后，给予镇痛药（氟尼辛葡甲胺，2.5 mg/kg 体重 [BW]，皮下注射，参见 材料表)以尽量减少和预防术后疼痛与不适。</li>
	<li>使用剃毛器剃除小鼠肩胛间区的毛发，并用碘伏或氯己定消毒液与70%乙醇交替擦拭至少三遍，对手术区域进行消毒。然后，在切口周围铺放无菌手术巾。</li>
	<li>切开皮肤&#160;肩胛骨之间&#160;使用解剖刀图3A- B），然后用手术剪将剃毛后的皮肤剥离，以暴露颈部的脂肪组织&#160;(图3C- D切口的大小取决于动物体型，但通常切口应约为2厘米，以暴露肩胛间区域的脂肪组织。</li>
	<li>使用单一切口，在脂肪组织远端区域与肌肉交界处切割脂肪组织。图3E-F切口大小应约为1厘米，仅需打开足以插入手术剪以进行脂肪组织钝性剥离的入口。</li>
	<li>用惯用手持手术剪，钝性并垂直剥离脂肪组织以暴露棕色脂肪组织，同时用非惯用手捏住包括棕色脂肪组织在内的脂肪组织。图3G以Sultzer静脉作为解剖标志，确定棕色脂肪组织（BAT）的精确位置。 
	注意：棕色脂肪组织（BAT）在 图3H&#160;为拍摄图片演示而完全暴露组织。过度解剖可能损伤周围棕色脂肪组织（BAT）的神经。手术剪方向错误可能损伤周围肌肉及引流BAT的Sultzer静脉，导致过度出血。</li>
	<li>每只小鼠注射40 &#181;将 AAV 缓慢注入两侧 BAT 叶（每侧 20 微升） &#181;L 每个 BAT 叶）使用锐利针头（32 G，参见 材料表) 连接到一个汉密尔顿注射器（100 &#181;L，参见 材料表; 图3I通过观察腺相关病毒（AAV）给药期间注射部位无液体渗漏，判断注射是否成功。 
	注意：在暴露过程中，无法在不造成组织过度损伤的情况下精确定位棕色脂肪组织（BAT）。 图3I&#160;完全暴露以进行图片展示。注射到棕色脂肪组织（BAT）叶中的AAV溶液体积由受体小鼠BAT的大小决定。我们已确定20 &#181;对于一只体重约30 g的普通C57BL/6J小鼠，每片约0.05 g的棕色脂肪组织（BAT）小叶使用L量的AAV溶液是合适的。如有必要，可能需要浓缩病毒溶液以达到所需体积。</li>
	<li>确认注射的棕色脂肪组织（BAT）或周围组织无出血。用浸有双氧水溶液的纱布按压（参见 材料表) 用于出血部位以止血。</li>
	<li>将暴露的脂肪组织复位至正常位置。使用5-0可吸收单股缝线缝合脂肪组织与肌肉边缘。图3J用5-0涂层未染色编织薇乔线缝合开放的皮肤图3K-L). 
	注意： 图4 描述了缝合剥离后的脂肪组织与肌肉的步骤。</li>
	<li>手术后将动物置于加热垫上直至完全恢复。为动物提供食物、饮水以及充足的垫料用于筑巢。在实验开始前，对动物进行为期7天的恢复期观察，定期监测其是否有任何痛苦或疾病的迹象。</li>
	<li>通过蛋白质印迹分析确认从小鼠分离的棕色脂肪组织中靶基因删除的效率，如Sugimoto等所述。16.</li>
</ol>

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<li>Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV-mediated+gene+delivery+to+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).</li>
<li>Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+efficient+gene+knockout+and+overexpression+in+mouse+interscapular+brown+adipocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101895(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

现有的关于通过腺相关病毒（AAV）介导将基因递送至肩胛间棕色脂肪组织（BAT）的方法，均未包含详细描述手术技术及直接向BAT注射AAV操作过程的图片和视频。在大多数已发表的方法中33,34，将AAV注射到肩胛间棕色脂肪组织（BAT）周围的脂肪组织中，而非直接注射到BAT本身。因此，本实验方案中有多个关键步骤决定了研究的成败，包括sgRNA的设计、AAV的包装与浓缩、BAT特异性Cas9小鼠的构建以及手术操作。完成该过程需要精细且高超的外科手术技能 体内 操作步骤。特别是，在暴露棕色脂肪组织（BAT）和注射腺相关病毒（AAV）时，尽量减少组织损伤至关重要。由于多种遗传和环境因素（如饲养温度、运动训练和饮食），围绕BAT的白色脂肪体积以及BAT本身的组成在不同动物之间可能存在差异。例如，肥胖小鼠的BAT周围存在大量白色脂肪组织，而在热中性环境（30 °C）下饲养的小鼠则表现出BAT的“白色化”。因此，在不切开皮肤的情况下，精确确定BAT的三维位置具有挑战性。在AAV注射过程中，尽可能小范围地暴露BAT是一项...

肥胖在全球范围内以显著速度增长，导致一系列代谢性疾病1,2,3脂肪组织在这些病理过程中起着关键作用。目前已知存在两种功能不同的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT），负责储存多余热量；棕色脂肪组织（BAT）及其相关的米色/类棕色脂肪（beige/brite fat），则通过产热作用耗散能量。尽管BAT的能量耗散功能已被广泛认知，但它同时也具有内分泌功能。 通过 在远端器官中调控代谢的生物活性分子的产生4,5大量啮齿类动物研究表明，增加棕色脂肪或米色脂肪的数量或活性可提高能量消耗，并改善胰岛素敏感性。在人类中，可检测到棕色脂肪组织（BAT）的人群，其心脑血管代谢性疾病的患病率显著较低。6因此，BAT 对肥胖相关的代谢后遗症具有良好的治疗潜力7,8,9.
为了研究棕色脂肪组织（BAT）发育与功能的生理学及病理生理学机制，并阐明参与这些过程的分子机制，BAT特异性的转基因小鼠模型是首选方法10。Cre-LoxP重组系统是通过编辑小鼠基因组来构建条件性基因敲除小鼠最常用的方法11。该系统能够以组织/细胞特异性的方式对目的基因进行修饰（过表达或敲除）。此外，该系统也可用于通过表达特异性荧光报告基因来标记特定类型的细胞。
近年来，Cre-LoxP 系统通过与 CRISPR-Cas9 技术及腺相关病毒（AAV）单导向 RNA（sgRNA）系统相结合而得到了进一步发展12。CRISPR-Cas9 系统是一种特异性强且高效的基因编辑工具，可用于修饰、调控或靶向基因组的特定区域13。基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑能够快速操纵基因组位点，因为它无需依赖基因靶向载体进行同源重组。结合使用 Cre-LoxP、CRISPR-Cas9 和 AAV-sgRNA 技术，研究人员可在特定时间对特定组织或细胞中目标基因的功能进行研究，从而更精确地理解基因功能。此外，这些联合技术减少了构建转基因小鼠所需的时间和工作量；若使用可诱导的 Cre 品系，还可实现对小鼠体内 CRISPR-Cas9 活性的时空调控，从而进行可诱导的基因组编辑14。
AAV 载体安全且有效 体内 基因递送系统。然而，靶向脂肪组织的AAV在应用上落后于其他组织（如脑、心脏、肝脏和肌肉）中的应用15由于天然血清型载体的转导效率相对较低且具有嗜性限制，腺相关病毒介导的基因递送在脂肪组织中的应用仍然具有挑战性15近五年来，我们及其他研究者已成功建立了高效且微创的腺相关病毒（AAV）介导基因递送方法，将基因靶向递送至脂肪组织，并构建了小鼠模型，使我们能够深入了解参与棕色脂肪组织（BAT）功能调控的相关基因。16,17,18,19例如，通过使用 AAV8 递送靶向 sgRNA Alox12，该基因编码12-脂氧合酶（12-LOX），我们发现激活的棕色脂肪组织可产生12-LOX代谢物，即12-羟基二十碳五烯酸（12-HEPE）和13R,14S-二羟基二十二碳六烯酸（maresin 2），分别用于调节葡萄糖代谢和缓解肥胖相关的炎症16,17在此，我们提供了一套逐步的技术操作方案，重点介绍通过直接向棕色脂肪组织（BAT）小叶微注射AAV-sgRNA的手术步骤，以利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9与AAV-sgRNA联合系统构建BAT特异性基因敲除小鼠。

<table><tbody><tr><td>化学试剂、多肽与重组蛋白</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM 无血清培养基</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene 感染/转染试剂</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1 转染试剂</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>重组DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2 载体&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP</td><td>Addgene</td><td>89060</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 包装质粒</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 包装质粒</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>实验模型：细胞系</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK-293 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>WT-1 细胞</td><td>Tseng 实验室构建</td><td>PMID: 14966273</td><td></td></tr><tr><td>实验模型：生物体/品系</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cas9 基因敲入小鼠</td><td>Jackson 实验室</td><td>24857</td><td></td></tr><tr><td>Ucp1-CRE 小鼠</td><td>Jackson 实验室</td><td>24670</td><td></td></tr><tr><td>其他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banamine</td><td>Patterson</td><td>07-859-1323</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>Model 710 RN Syringe</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Hamilton</td><td>32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2</td><td></td></tr><tr><td>缝合线 5-0 Unify PCL25 P-3 无色 18 英寸 单股 12/盒</td><td>Henry Schein</td><td>1273504</td><td></td></tr><tr><td>缝合线 5-0 Unify 丝线 P-3 黑色 18 英寸 12/盒</td><td>Henry Schein</td><td>1294522</td><td></td></tr></tbody></table>

利用cre-loxp、crispr-cas9与腺相关病毒单导向rna系统联合构建棕色脂肪特异性基因敲除小鼠

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

棕色脂肪组织（BAT）是一种专门用于能量耗散的脂肪储存库，也可通过分泌生物活性分子作为内分泌器官。via 利用Cre-LoxP系统进行基因靶向的传统策略一直是构建组织特异性基因敲除小鼠的主要方法。然而，该方法耗时且繁琐。本文介绍了一种结合Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统的快速高效敲除BAT中目标基因的实验方案。肩胛间BAT位于肌肉深层之间，因此必须暴露BAT，以便在视野范围内精确且直接地将AAV注射到BAT中。适当的外科操作至关重要，以避免损伤支配BAT的交感神经和血管（例如连接BAT的Sultzer静脉）。为最大限度减少组织损伤，必须充分理解BAT的三维解剖位置以及技术操作所需的手术技能。本方案重点阐述了关键的技术步骤，包括靶向目标基因的sgRNA设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及通过直接显微注射将AAV注入双侧BAT叶以构建BAT特异性基因敲除小鼠的手术操作，该方法可广泛应用于研究基因在BAT中的生物学功能。

在整个上述操作过程中，将AAV-sgRNA精确递送至棕色脂肪组织（BAT）对于本实验方案的成功至关重要。为了最大化AAV-sgRNA的作用效果并尽量减少手术过程中的组织损伤，必须充分了解BAT的三维（3D）解剖位置。如图所示 图3E，如果不暴露组织，很难确定棕色脂肪组织（BAT）的精确位置。然而，过度暴露BAT可能会损伤组织图3H，I）；因此，应通过操作将AAV溶液注射至有限的解剖空间内（图 3G). 图 5A 对于确保AAV注射的成功以及小鼠术后快速恢复至关重要。 图5B-D 表明可能导致注射失败的潜在缺陷。这些缺陷包括将AAV溶液注射到错误的区域（图5B），针头穿透组织（<strong class="xf...

在本实验方案中，我们描述了利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统相结合的技术，构建脂肪组织特异性敲除小鼠的方法。所述步骤包括sgRNA的设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及将AAV显微注射至棕色脂肪组织（BAT）叶中的操作。

利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9与腺相关病毒单导向RNA系统联合构建棕色脂肪特异性基因敲除小鼠

棕色脂肪组织（BAT）是一种专门用于能量耗散的脂肪储存库，也可通过分泌生物活性物质作为内分泌器官……

本方案利用 Cre-LoxP、CRISPR-Cas9 及腺相关病毒单导向 RNA 系统，制备褐色脂肪特异性基因敲除小鼠。方案包含一项手术技术，可安全地将 AAV 注射至褐色脂肪组织。该技术的主要优势在于，无需选择性育种即可快速获得组织特异性的基因敲除小鼠。如果根据靶器官调整腺相关病毒（AAV）注射的手术操作，该构建组织特异性基因敲除或基因敲低的方法可适用于其他组织。首先，对已麻醉的UCP1 Cre Cas9小鼠皮下注射镇痛剂，以减轻并预防术后疼痛和不适。随后使用剃毛器剃除小鼠肩胛间区域的毛发，并使用碘伏或氯己定类消毒剂进行至少三轮交替消毒，每轮消毒后用70%乙醇擦拭。使用手术刀，在肩胛骨之间棕色脂肪组织上方的皮肤上做一个两厘米长的切口，以暴露肩胛间脂肪。完成单一切口后，沿脂肪组织远端区域与肌肉的边界剪开脂肪组织。然后用主手持手术剪，钝性并垂直剥离脂肪组织，同时用非主手捏住包括棕色脂肪组织在内的脂肪组织，以暴露棕色脂肪组织。利用Sulzer静脉作为解剖标志，以确定棕色脂肪组织的精确位置。随后，对每只小鼠，使用连接至100 µL Hamilton注射器的锋利32号针头，将20 µL的腺相关病毒（AAV）缓慢注射至两块棕色脂肪组织的每个叶中。在AAV注射过程中，若注射部位无液体渗漏，则表明注射成功。在确保稳态后，将暴露的脂肪组织复位至正常位置，使用5-0可吸收单股缝线缝合脂肪组织边缘与肌肉。最后，使用5-0未染色涂层编织VICRYL缝线缝合皮肤切口。棕色脂肪组织的精确位置在未暴露时无法识别，但应避免过度暴露造成组织损伤。可能导致注射失败的潜在缺陷包括将AAV溶液注射到错误区域、针头穿透组织以及因AAV溶液体积过大导致的组织膨胀。将AAV单导向RNA精确递送至棕色脂肪组织对实验方案的成功至关重要。暴露棕色脂肪组织时成功的关键在于手术剪刀技术，包括剪刀的方向、深度以及Hamilton注射器的位置。该技术通过构建具有负荷生成能力的组织特异性基因敲除动物，以研究棕色脂肪相关能量代谢的分子调控机制。

generation-brown-fat-specific-knockout-mice-using-combined-cre-loxp

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用组合的 Cre-LoxP、CRISPR-Cas9 和腺相关病毒单向导 RNA 系统生成棕色脂肪特异性敲除小鼠

本视频介绍了一种在小鼠模型中通过腹腔注射他莫昔芬，利用他莫昔芬诱导型Cre重组酶系统实现目的基因敲除的实验方法。...

基于CreER-LoxP系统的靶基因失活：一种在小鼠模型中实现靶基因敲除的他莫昔芬诱导型Cre重组酶系统

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus...

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本方案描述了将多个单导向RNA克隆到一个导向RNA串联载体中的步骤，该方法特别适用于利用CRISPR/Cas9技术创建多基因敲除。文中以肠道类器官中双基因敲除的构建为例，展示了该方法的一种可能应用。...

利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

在此，我们提供了一项详细的实验方案，用于执行 体内...

腺相关病毒介导的 CRISPR 心脏基因编辑在小鼠中的应用

本研究介绍了一种分离小鼠棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析的新方法。...

从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析

本方案描述了Gja1基因中一个M213L突变，该突变可维持全长连接蛋白43的正常生成，但阻止较小的GJA1-20k内部翻译异构体的翻译。...

在保留全长蛋白表达的同时移除 mRNA 中的内部翻译起始位点

本方案介绍了如何从设计向导RNA开始，到细胞克隆及基因敲除克隆的鉴定，利用CRISPR/Cas9技术生成敲除型成肌细胞。...

利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除肌肉细胞系

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

本方案介绍了在脂肪细胞中使用CRISPR SunTag-p65-HSF1（AdipoSPH）作为研究米色脂肪生物学的一种替代腺相关病毒（AAV）的策略。 在体 注射携带靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA 的 AAV...

利用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学与代谢

基因组编辑改进效率 通过 输卵管核酸递送（I-GONAD）方法与传统显微注射技术相当，后者需要从供体雌性动物中收集受精卵，并将其移植到假孕雌性动物体内。本方案通过引入CRISPR/Cas9诱导的突变，证明了该方法的有效性 ROSA26...

基因组编辑技术的改进 通过 基于输卵管核酸递送的 在体 内 电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

学习利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒单导RNA系统生成棕色脂肪组织特异性敲除小鼠的方法。该技术通过手术显微注射实现快速组织特异性基因编辑，无需选择性育种即可研究能量代谢调控机制。

利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9与腺相关病毒单导向RNA系统联合构建棕色脂肪特异性基因敲除小鼠

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