人诱导性多能干细胞向具有成熟免疫表型的脑微血管内皮样细胞的分化

这是首个能够将人诱导性多能干细胞分化为具有优良屏障特性、成熟紧密连接以及表达介导免疫细胞迁移进入中枢神经系统的内皮细胞黏附分子的脑微血管内皮细胞的实验方案。EECM-BMEC样细胞使得研究人员能够利用来自患者的血脑屏障模型，以完全自体同源的方式研究免疫细胞跨血脑屏障的迁移过程。将多发性硬化症（MS）患者的诱导性多能干细胞分化为EECM-BMEC样细胞，使我们能够在这些MS患者的体外模型中识别出内在的屏障缺陷。

因此，这种培养方法将有助于我们在未来鉴定出导致这些屏障功能受损的分子通路。这些方法可应用于更广泛的一类疾病，其中血清形态以及免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润对疾病发病机制至关重要，例如脑卒中或神经感染。初次尝试该技术时，请使用相同数量的细胞材料。

接种密度是本实验方案成功的关键，需根据所用克隆进行调整。本次操作演示由本实验室助理教授Kinya Matsuo完成。内皮祖细胞培养的第五天，吸去培养孔中的培养基，每孔加入一毫升解离试剂。

将培养板在37摄氏度下孵育六至八分钟。使用微量移液器解离并单细胞化细胞。然后，将细胞悬液通过40微米细胞筛过滤至含有10毫升DMEM/F-12 10培养基的50毫升离心管中。

为终止消化反应，加入 DMEM/F-12 10 培养基至 50 毫升刻度线处。充分吹打混匀后，留取 10 微升用于细胞计数。将 50 毫升离心管在 20 至 25 摄氏度下以 200 ×g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。

离心后，弃去上清液，并用 10 毫升 DMEM/F-12 10 培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移至新的 15 毫升离心管中。在 20 至 25 摄氏度下以 200 ×g 离心 5 分钟，再次收集细胞沉淀。

然后将细胞沉淀重悬于流式缓冲液一中。接着按1:100比例加入FcR封闭试剂，孵育5分钟。随后加入按1:200比例稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD31抗体。

将悬液在20至25摄氏度避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，向样品中加入10毫升流式缓冲液一，并保留10微升悬液用于流式细胞术分析，以确定CD31阳性细胞的比例。在20至25摄氏度下，以200 ×g离心5分钟。

离心后，用流式缓冲液重悬细胞。随后，每100微升细胞悬液中加入5微升FITC分选试剂盒。用移液器充分混匀溶液，并在20至25摄氏度避光孵育15分钟。

接下来，每100微升细胞悬液中加入5微升磁性纳米颗粒。用移液器充分混匀，并在20至25摄氏度避光孵育10分钟。将细胞悬液转移至5毫升流式细胞术管中，并加入流式缓冲液一，使总体积达到2.5毫升。

然后将流式细胞术管放入磁铁中静置五分钟。连续操作，将磁铁和管子倒置，倾倒出含有未标记FITC CD31抗体细胞的细胞悬液。保持磁铁和管子倒置状态两到三秒钟，随后移除剩余液体。

吸净管壁上的液滴后，将离心管恢复至直立位置。从磁架上取下流式细胞管，加入2.5毫升流式缓冲液一，洗涤残留的CD31阳性细胞。轻柔吹打细胞2至3次，使其充分重悬。

然后将流式管放入磁铁中静置五分钟。重复洗涤至少四次，以去除管中未标记的FITC CD31阴性细胞。将流式管从磁铁中取出，用适量适宜的培养基重悬纯化的CD31阳性细胞。

保留两份10微升的悬液，一份用于细胞计数，另一份用于流式细胞术分析，以评估磁性激活细胞分选后样品中CD31阳性细胞的纯度。移除含有内皮细胞和非内皮细胞群体的六孔板中的HECSR培养基，然后向每孔加入1毫升解离试剂。

在显微镜下仔细观察细胞形态。当内皮细胞呈现明亮且圆形时，通常在2至5分钟内，轻敲培养板边缘使细胞脱落。非内皮细胞则仍附着在培养板上。

使用微量移液器小心收集脱离的内皮细胞，避免扰动未脱离的非内皮细胞，并将其转移至含有4毫升DMEM/F-12培养基（每毫升含10单位解离试剂）的15毫升或50毫升离心管中。随后，向仍贴壁的非内皮细胞所在的孔中加入2毫升HECSR培养基，以建立平滑肌样细胞（SMLCs），并将培养板放入培养箱中。将内皮细胞悬液转移至离心管中。

充分混匀，并保留10 µL悬浮液用于细胞计数。将剩余细胞在20至25°C下以200 ×g离心5分钟。然后加入2 mL HECSR培养基。

接下来，从先前准备好的胶原编码六孔板中移除胶原溶液，并向每孔加入2毫升内皮细胞悬液。然后将培养板置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育。通过免疫荧光染色检测EECM-BMEC样细胞的连接分子，包括claudin-5、occludin和VE-cadherin，以评估细胞形态以及是否存在连续且成熟的细胞连接。

用来源于SMLC的条件培养基稀释的促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子α和干扰素γ）刺激接种在腔室载玻片上的EECM-BMEC样细胞，可上调ICAM-1和VCAM-1等黏附分子的表达。此处展示了平滑肌细胞标志物的代表性图像，包括α-平滑肌肌动蛋白、钙调素结合蛋白和平滑肌蛋白22α。用促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子α和干扰素γ）刺激EECM-BMEC样细胞，可上调多种黏附分子（包括ICAM-1、VCAM-1和P-选择素）在细胞表面的表达。

此外，炎症性细胞因子的刺激也上调了内皮黏附分子的表达，并促进了更多免疫细胞黏附于EECM-BMEC样细胞单层。EECM-BMEC样细胞对于深入理解血脑屏障水平的病理生理机制具有重要意义，同时也是开发稳定血脑屏障新治疗靶点的有力工具。