Name: 高速磁镊，用于力敏元件的纳米力学测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 了解高速磁镊技术用于力敏生物分子的纳米力学测量方法。该技术以1.2 kHz速率实时监测DNA发夹和SNARE复合物的动态结构变化，为研究机械生物学机制提供高分辨率数据。

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本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助，资助资金来自韩国政府（MSIT）（NRF-2022R1C1C1012176、NRF-2021R1A4A1031754 和 NRF-2021R1A6A1A10042944）。S.-H.R. 获得了NRF基金（2021R1C1C2009717）的支持。

作者声明无利益冲突。

在本研究中，我们介绍了一种单分子力谱装置，可高时空精度地观测生物大分子的结构变化。所采用的高速CMOS相机每秒可采集1,200帧图像。−1 分辨率为1280 × 1024，可实现1.2 kHz的微珠追踪。然而，目前测量速度受限于微珠追踪软件，因此在高速测量中通常将感兴趣区域（ROI）缩小至更小范围。SLD的高输出功率提供了明亮的照明，这对于达到数千赫兹带宽的快速微珠成像至关重要。此外，光束的空间相干性在微珠周围产生高对比度的同心衍射环图1A（插图），可通过其对称性精确定位微珠位置。
可通过测量拴系微珠的布朗波动来确定作用在微珠-拴系结构上的磁力35,37,38。由于实时力分析计算量较大，通常使用参考结构预先测量所施加的力。例如，将待用的磁性微珠通过长（>5 kbp）双链DNA片段进行拴系，并测量微珠位置的热波动随磁铁...

细胞能够主动感知并响应机械刺激。在此过程中，许多生物分子表现出依赖于力的特性，从而实现动态的结构变化。典型的例子包括机械敏感性离子通道和细胞骨架元件，它们为细胞提供来自周围环境的关键力学信息。
此外，在更广泛的意义上，那些表现出独特受力特性的分子也可被视为力敏性分子。例如，核酸双链的局部形成与解链，以及G-四链体等高级结构，在复制、转录、重组以及近年来的基因组编辑中发挥着关键作用。此外，一些参与突触通讯的神经元蛋白通过产生超过典型分子间相互作用水平的物理力来执行其功能。无论研究哪一类实例，以高时空精度研究相关生物分子的纳米力学特性，对于揭示相应力学生物学过程的分子机制都具有重要意义1,2,3。
单分子力谱方法已被用作研究生物大分子力学性质的有力工具2,4,5,6它们可以在施加力的同时监测核酸和蛋白质的结构变化，从而研究力依赖性特性。两种广为人知的装置是光镊和磁镊（MTs），二者均利用微米级小球来操控分子。5,6,7,8在这些平台中，聚苯乙烯微球（用于光镊）或磁珠（用于磁镊）被连接至目标分子（如核酸和蛋白质） 通过 分子 &#34;手柄&#34;，通常由短片段的双链DNA（dsDNA）制成。随后移动磁珠以施加力，并通过成像追踪其位置，从而报告目标分子的结构变化。光镊和磁镊在其应用中基本可互换，但在力的控制方式上存在重要差异。光镊本质上是位置钳制装置，可将磁珠固定在特定位置，因此当目标分子构象发生变化时，施加的力会发生波动；例如，延伸长度增加（如因去折叠）会使连接链松弛并降低张力， 反之亦然尽管可以通过主动反馈来控制光镊中的力，但磁镊则天然地作为力钳装置运行，利用永磁体产生的稳定远场磁力，从而能够耐受环境扰动。
尽管磁镊（MTs）具有悠久的历史和简单的结构设计，但由于快速磁珠追踪方面的技术挑战，其在高精度测量中的应用一直落后于光镊。然而，近年来多个研究团队共同推动了磁镊仪器在硬件和软件方面的多方面改进2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。本文介绍了一种运行频率达1.2 kHz的高分辨率磁镊装置实例，并详细描述了如何利用该装置对受力敏感的生物大分子进行纳米力学测量。以DNA发夹结构和神经元SNARE复合物作为模型体系，研究其在皮牛顿力范围内的快速结构变化。DNA发夹在明确的力范围内表现出简单的两态跃迁20,21，因此可作为验证磁镊系统性能的理想模型。SNARE蛋白可组装成一种对力敏感并驱动膜融合的复合物22，也已被广泛应用于单分子力谱研究14,23,24,25。本文同时介绍了标准的数据分析方法，以及提取热力学和动力学有用信息的流程。我们希望本文能够促进高精度磁镊在力学生物学研究中的广泛应用，并激励读者探索各自感兴趣的力敏感体系。

高速磁镊技术用于力敏感元件的纳米力学测量

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

单分子磁镊（MTs）作为一种强大的工具，可通过施加外力来研究生物大分子（如核酸和蛋白质），因此在力学生物学领域具有广阔的应用前景。由于该方法通常依赖基于图像的磁珠追踪技术，图像记录与分析的速度限制以及磁珠的热涨落长期以来制约了其在观测靶分子微小且快速的结构变化中的应用。本文详细描述了高分辨率磁镊装置的构建与操作方法，该系统能够解析生物大分子及其复合物在纳米尺度、毫秒级时间分辨率下的动态行为。作为应用实例，本文展示了DNA发夹结构和SNARE复合物（介导膜融合的分子机器）的实验，重点说明如何在皮牛顿量级的外力条件下检测其瞬时状态及状态间的转换。我们预期，高速磁镊技术将继续推动对细胞内感知、传递和产生力学信号的分子进行高精度的纳米力学测量，从而加深我们在分子水平上对力学生物学的理解。

力的校准 
两种力测量方法（磁珠的横向位移方差和功率谱分析）的结果差异为 0–2 pN（图 2G）。根据图 2F中的结果，使用常规钕磁铁可稳定达到高达 30 pN 的力。
8 bp DNA 发夹结构的两态转变 
我们首先研究了一种短DNA发夹结构的纳米力学特性（图5）。DNA发夹结构已被传统单分子力谱技术广泛表征，因此可参考的文献资料极为丰富。短发夹的解链过程通常是可逆的，因此其重新折叠事件也在与解链相同的力范围内被观察到（图5A）。通过施加从0 pN到20 pN的力斜坡（图5B），验证了该发夹结构在受力作用下的伸长行为符合WLC模型，该模型完全归因于DNA手柄的弹性（<strong class="xfig"...

本文介绍了一种高速磁镊装置，可在最高达 1.2 kHz 的采样速率下对受力敏感的生物分子进行纳米力学测量。我们以 DNA 发夹结构和 SNARE 复合物作为模型体系展示了该装置的应用，但该系统也可适用于研究其他参与力学生物学过程的分子。

单分子磁镊（MTs）作为一种强大工具，可对核酸和蛋白质等生物大分子施加外力并进行研究，因此在力学生物学领域具有重要应用前景。由于该方法通常依赖基于图像的磁珠追踪技术，长期以来，图像采集与分析的速度限制以及磁珠的热涨落问题，阻碍了其在观测目标分子微小且快速结构变化中的应用。本文详细描述了一种高分辨率磁镊装置的构建与操作方法，该装置能够解析生物大分子及其复合物在纳秒尺度、毫秒时间分辨率下的动态行为。作为应用实例，本文展示了DNA发夹和SNARE复合物（膜融合机制）的实验，重点说明如何在皮牛顿量级外力存在的情况下检测其瞬态结构及构象转变。我们预期，高速磁镊技术将继续推动对细胞内感知、传递和产生力学信号的分子进行高精度纳米力学测量，从而加深我们对力学生物学分子机制的理解。

生物分子通常会在受力时发生微小而快速的结构变化。高分辨率磁镊技术能够在生理相关力的条件下探究这些动态过程。由于该方法具有纳米级空间和毫秒级时间分辨率，因此可实时监测核酸和蛋白质的细微变化。首个轴承和机械敏感蛋白的功能障碍可能导致心血管和肌肉骨骼系统疾病。磁镊技术可为研究这些蛋白的工作机制提供洞察。该系统必须经过正确对准和校准，才能获得良好的分辨率。此外，在制备和鉴定用于测量的分子构建体时必须格外小心。首先将倒置显微镜安装在防振光学平台上，然后安装高速CMOS相机和图像采集卡。将一个行程长度超过20毫米的电动线性平台垂直安装在手动XY平台上，以构建用于磁体三维操控的平移平台。接着，安装一个旋转步进电机以及皮带和滑轮系统，以实现磁体的旋转。将磁体安装在一个亚克力支架上，支架内相同且平行的磁体之间间距为1毫米。调整平移台的垂直位置，使磁铁底面在平移台最低位置时与样品平面齐平。使用低倍物镜，将磁铁对准视野中心。检查磁铁的旋转情况，确保磁铁对中心的位移受到限制。安装一个超发光二极管用于微珠照明。使光束穿过磁铁间隙，确保光束准直适当，能够适配间隙，且照明不被磁铁遮挡。现在在物镜转盘上安装压电镜头扫描器，并安装一个数值孔径为1.5的100倍油浸物镜用于微珠追踪。确保在磁铁移动过程中照明均匀，以避免珠子追踪中可能出现的伪影。最后，将光线调节至最大亮度，但不得引起像素饱和。首先，取两张玻璃盖玻片用于细胞的顶部和底部。将盖玻片在1 M氢氧化钾溶液中超声处理30分钟以进行清洗。随后用蒸馏水冲洗盖玻片，并保持其浸没在水中。对底部盖玻片进行聚乙二醇化处理，并于-20摄氏度保存，直至后续使用。实验当天，使用氮气枪吹干聚乙二醇化盖玻片。为制作简单的通道，准备宽度约为两毫米的双面胶条，并在底部盖玻片上平行放置四条，彼此间隔五毫米。然后将顶部盖玻片置于底部盖玻片的中央位置，短边两侧各留出约五毫米空间，作为通道的进样口和出样口。使用镊子轻轻按压顶部盖玻片的背面，以牢固密封通道。修剪200微升移液器吸头的边缘，并从较宽的开口处剪下约10毫米，使其能够容纳超过200微升的溶液。准备三根适合注射泵管路的注射器针头。使用聚乙烯管将流动池通道出口处的针头连接至注射泵。用 PBS 平衡各通道。通过涡旋振荡珠子溶液使珠子聚集体重悬。然后通过泵吸依次将所需溶液引入通道中。在施加0.1皮牛顿力的同时，洗去未结合的磁珠。在流动池通道表面，识别与DNA构建体单分子相连的磁珠。在附近找到一个参考微珠。旋转候选微珠，检查其是否可自由旋转。再旋转微珠数圈，估算其旋转半径，并选择旋转半径较小的微珠。将力从零增加至五个皮牛顿，通过观察五千亿碱基对连接链拉伸引起的磁珠衍射图案显著变化，来识别连接良好的单个磁珠。使用 PCR 方法制备一端标记生物素、另一端标记叠氮的五千亿碱基对双链 DNA 片段。在制备含有 PCR 产物的流动池

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

高速磁镊，用于力敏元件的纳米力学测量

本文中，我们描述了使用磁力镊子以高度可并行的方式在单分子水平上研究力对酶促蛋白水解作用的影响。...

使用磁镊进行多重单分子力促蛋白水解测量

我们通过在轴突膜上附着的光镊探针同时进行力谱测量，检测了使用激光显微切割仪部分损伤的轴突中的张力释放。该实验方案用于评估轴突与培养基底之间的黏附性。...

利用激光诱导轴突损伤过程中张力释放的测量，在皮牛顿和毫秒分辨率下评估轴突与基底的黏附力

磁镊是一种强大的单分子操控技术，可通过自由旋转磁镊配置直接测量生物大分子的扭转，或通过磁扭矩镊配置直接测量其扭矩。本文提供了进行此类测量的指导，包括在DNA及相关核蛋白丝研究中的应用。...

用于测量扭转与扭矩的磁力镊子

本文报道了一种用于操控G-四链体的单分子磁镊平台，该平台可用于研究G4的稳定性及其受多种蛋白质调控的机制。...

利用磁镊对G-四链体进行单分子操控

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

磁力显微镜（MFM）利用垂直磁化的原子力显微镜探针，以纳米级分辨率测量样品的表面形貌和局部磁场强度。优化MFM的空间分辨率和灵敏度需要在降低抬升高度与增大驱动（振荡）幅度之间取得平衡，并且在惰性气氛手套箱中操作可带来优势。...

优化磁力显微镜分辨率与灵敏度以观测纳米级磁畴

本方案展示了如何利用单分子磁镊技术研究端粒DNA结合蛋白（端粒重复序列结合因子1 [TRF1] 和...

使用单分子磁镊分析端粒蛋白- DNA 相互作用

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

本文介绍一种简单的方法，可快速制备数百个线虫生长培养基琼脂96孔培养板，每孔中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

一种在Caenorhabditis elegans中进行高通量化学筛选的简单方法

本文介绍了一种全细胞电化学实验方案，用于研究质子传递对Shewanella oneidensis...

电化学检测Shewanella oneidensis MR-1中胞外电子传递的氘动力学同位素效应

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高速磁镊技术用于力敏感元件的纳米力学测量

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