Name: 人瘢痕疙瘩组织中原代真皮成纤维细胞的分离、培养和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 学习从人瘢痕疙瘩组织中分离、培养和表征原代真皮成纤维细胞的优化方案。该方法可提供高活力、稳定的细胞来源，用于研究瘢痕疙瘩的形成机制及开发潜在治疗方法。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号 81903189 和 82073418）以及广州市科技计划项目（项目编号 202102020025）的资助。

本研究经南方医科大学皮肤病医院伦理审查委员会批准（批准号：2020081）。在采集个体组织样本前，已获得患者的知情同意。
1. 准备
注意：以下操作应在生物安全柜内的无菌环境中进行。
<ol>
	<li>通过向高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液（PSA），配制完全培养基。</li>
	<li>通过向 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 1% PSA，配制含 PSA 的 PBS 溶液；通过向 1× PBS 中加入 1% FBS，配制含 FBS 的 PBS 溶液。</li>
	<li>通过高压灭菌法准备若干灭菌的剪刀、镊子和手术刀。</li>
</ol>
2. 获取移除的组织
<ol>
	<li>通过手术获取瘢痕疙瘩患者的组织。将新鲜的瘢痕疙瘩组织收集到无菌包装袋或无菌离心管中，并尽快转移至实验室的生物安全柜中。 
	&#8203;注意：在本方案中，所获取的瘢痕疙瘩组织大小约为 ~20 x 20 x 10 mm3，具体尺寸可能因手术情况而异。</li>
</ol>
3. 分离
<ol>
	<li>用无菌镊子取出瘢痕疙瘩组织，放入含有10-25 mL添加1% PSA的PBS的50 mL无菌离心管中，浸泡10分钟。然后准备一块6孔板，每孔加入4 mL含1% PSA的PBS。用无菌镊子取出组织，用含1% PSA的PBS洗涤两次。使用无菌镊子将组织依次从一个孔转移到下一个孔。</li>
	<li>使用手术剪刀或手术刀去除脂肪和表皮层，保留真皮层不受损伤。用剪刀将真皮层修剪并分割成3-5 mm2大小的组织块，用无菌镊子将这些组织块转移至下一孔中，并再次用含1% PSA的PBS溶液洗涤。</li>
</ol>
4. 培养
<ol>
	<li>使用无菌镊子将真皮组织块放入培养皿中；确保组织块数量在10至30块之间，每块之间的距离&#62;5 mm。将培养皿倒置，置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育30–60分钟，直至组织块略微干燥并粘附于培养皿底部。随后加入含10% FBS和1% PSA的DMEM完全培养基，并小心将培养皿放回37 °C、含5% CO2的培养箱中。 
	注意：成纤维细胞是一类在形态和功能上均具有异质性的细胞群体。鉴于其复杂性，组织分离与培养操作需格外谨慎；应均匀选取瘢痕疙瘩真皮组织块，并在放入培养皿前充分混匀。</li>
	<li>3天后，更换一半上清液为完全培养基。此后每2–3天更换一次培养基。每天在40倍显微镜下观察成纤维细胞生长情况。 
	注意：所有操作均应轻柔进行。组织分离后前2天内避免移动培养皿，以便组织块有足够时间牢固粘附于培养皿表面。</li>
	<li>当围绕组织块生长的成纤维细胞融合度达到约90%时，移除组织块及培养基。用无菌1×PBS洗涤细胞，每孔加入2 mL无菌1×胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养皿置于37 °C、湿润的5% CO2培养箱中孵育约3–5分钟。轻轻敲击培养皿，于显微镜下观察；当大部分细胞从培养皿表面脱落时，立即加入2 mL完全培养基终止消化反应。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，在室温下以300 × g离心3分钟。小心弃去上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀。将成纤维细胞接种至9 cm细胞培养皿中，置于37 °C、湿润的5% CO2培养箱中继续培养。</li>
</ol>
5. 维持与保存
<ol>
	<li>大约3-4天后，当成纤维细胞生长至80%融合度时，重复步骤4.2-4.4，并以1:3的比例传代成纤维细胞。使用传代后的成纤维细胞进行后续实验。 
	&#8203;注意：成纤维细胞培养传代次数不应超过10代，因为细胞可能开始表现出与原始细胞不同的特性。</li>
	<li>将P1-P3代的传代细胞用液氮冻存，以备后续使用。
	<ol>
		<li>重复步骤4.2-4.3。将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，在300 × g 条件下离心3分钟。小心弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL细胞冻存液（含90% FBS和10% DMSO）中，然后将悬液转移至细胞冻存管中。</li>
		<li>将冻存管放入冻存盒中，随后将冻存盒置于−80 °C冰箱中。24小时后，将细胞转移至液氮中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 通过免疫荧光染色鉴定成纤维细胞
<ol>
	<li>将圆形盖玻片放入24孔板中，以1 × 104 个细胞/孔的浓度接种传代的成纤维细胞。当成纤维细胞融合度达到60%时，吸除培养基。加入1 mL 4%多聚甲醛，在室温下固定成纤维细胞20分钟，随后用PBS洗涤3次，每次1分钟。 
	注：使用血细胞计数板在显微镜下或使用自动细胞计数仪对细胞数量进行计数。</li>
	<li>吸除PBS，加入0.5% Triton X-100孵育20分钟以通透细胞膜，然后用PBS洗涤3次，每次1分钟。加入含0.5%牛血清白蛋白的PBS，浸泡30分钟。随后吸除溶液，加入以抗体稀释液按1:1,000比例稀释的PDGFR-α/vimentin一抗。4 °C条件下孵育过夜。</li>
	<li>次日，吸除一抗，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟，然后加入以抗体稀释液按1:200比例稀释的Alexa Fluor-555标记的山羊抗兔IgG二抗，浸泡孵育1小时。</li>
	<li>吸除二抗，用PBS洗涤细胞3次。用镊子取出圆形盖玻片，置于载玻片上，每张盖玻片上加50 µL浓度为5 µg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液，染色细胞核。将样品置于湿润避光盒中，于激光共聚焦荧光显微镜下观察。 
	&#8203;注：设置不加一抗但加二抗的阴性对照组，以排除非特异性染色。</li>
</ol>
7. 通过流式细胞术鉴定成纤维细胞
<ol>
	<li>将细胞沉淀收集至1.5 mL无菌离心管中，加入含1% FBS的PBS 50 µL重悬。避光孵育抗CD90抗体30分钟，并在对照组中加入抗IgG同型对照抗体。随后加入含1% FBS的PBS 200 µL，于4 °C、300 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入含1% FBS的PBS 200 µL。重悬细胞后经细胞筛（70 µm）过滤。向滤液中按1:100比例加入终浓度为5 µg/mL的DAPI储存液，然后进行流式细胞术检测。以正向散射光（FSC）为横坐标，侧向散射光（SSC）为纵坐标，圈选主要细胞群。选定该细胞群后，以藻红蛋白（phycoerythrin）为横坐标，细胞数量为纵坐标进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
<li>Feng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+regulatory+factors+and+therapeutic+targets+in+keloid+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).</li>
<li>Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keloid+disorder%3A+Genetic+basis%2C+gene+expression+profiles%2C+and+immunological+modulation+of+the+fibrotic+processes+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+the+selection+of+adjuvant+radiotherapy+regimens+for+keloid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid.</a> Frontiers in Medicine. 9, 1043840(2022).</li>
<li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars%3A+A+critically+appraised+topic%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li>
<li>Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo%2C+and+in+vivo+approaches+for+investigation+of+skin+scarring%3A+Human+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models.</a> Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).</li>
<li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li>
<li>Künzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic-augmented+primary+adult+fibroblast+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59858(2019).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+explants+culture+method%3A+Sustainable+isolation+of+keloid+fibroblasts+with+primary+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cosmetic+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics.</a> Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).</li>
<li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+single-cell+transcriptional+profiling+identifies+functionally+distinct+human+dermal+fibroblast+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+suppresses+skin+fibroblast+proliferation+via+oxidative+stress+alleviation+and+necroptosis+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition.</a> Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).</li>
<li>Zhou, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nintedanib+inhibits+keloid+fibroblast+functions+by+blocking+the+phosphorylation+of+multiple+kinases+and+enhancing+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).</li>
<li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+regulates+cell+growth%2C+apoptosis%2C+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+%28TGF-beta%29%2FSMAD+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li>
<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

不存在任何利益冲突需要声明。

从瘢痕疙瘩组织中获取原代成纤维细胞是进一步研究的关键基础。迄今为止，获取原代成纤维细胞的方法主要有两种：酶消化法和组织块培养法11,12,13,14。然而，这两种传统方法均存在局限性，例如易受污染、混入其他类型细胞、培养周期较长以及成功率较低15,16。本研究介绍了一种优化的方法，并提供了明确的操作步骤，以解决现有难题，提高瘢痕疙瘩成纤维细胞分离与培养的成功率。
微生物污染的可能性是获取原代成纤维细胞过程中的主要问题之一。所有器械和溶液都必须经过灭菌处理，并在整个实验方案的各个步骤中严格执行无菌操作技术。本方案中包含保持无菌操作的提示，以降低污染风险。第一个关键步骤是组织分离过程；将组织浸泡在添加了1% PSA的...

瘢痕疙瘩是一种纤维增生性疾病，表现为斑块持续生长，常侵入周围正常皮肤，且无自限性，给患者带来不同程度的瘙痒、疼痛以及外观和心理负担1。成纤维细胞是瘢痕疙瘩中的主要细胞，在该疾病的发生和发展中起关键作用，其特征为过度增殖、细胞外基质过度产生以及胶原排列紊乱2,3。然而，其潜在的发病机制尚不明确，目前仍缺乏有效的治疗方法，因此迫切需要进一步开展相关研究4,5。
由于目前尚无理想的瘢痕疙瘩研究动物模型 体内6,7，构建一个 体外 通过获取瘢痕疙瘩组织中的原代成纤维细胞建立模型，可为瘢痕疙瘩研究提供可行性和可靠性2,6原代细胞是从活体组织直接分离的细胞，通常认为与细胞系相比，这些细胞更能接近多个个体的生理状态和遗传背景8,9培养原代细胞为研究细胞的生长、代谢及其他细胞表型提供了有力手段。
目前，获取原代成纤维细胞的方法主要有两种：酶消化法和组织块培养法。然而，在获取原代成纤维细胞的过程中已发现若干障碍，例如存在多种细菌或真菌污染的风险, 与其他不易去除的细胞类型混合, 培养周期长，以及细胞特性相较于原始细胞发生的后续变化等9因此，建立一种可行且高效的方法来获取原代成纤维细胞，是进一步研究与应用的基础。本研究描述了一种优化的从瘢痕疙瘩组织中提取原代成纤维细胞的方案，可有效且稳定地获得纯度高、活性好的成纤维细胞。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 无菌离心管</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 无菌离心管</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>50 mL 无菌离心管</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>放置瘢痕疙瘩组织</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 山羊抗兔 IgG&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Alexa&amp;nbsp;Fluor&amp;nbsp;555&amp;nbsp;</td><td>免疫荧光染色实验的二抗</td></tr><tr><td>抗人 CD90 抗体</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>鉴定成纤维细胞纯度</td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 系列 A2</td><td>细胞分离与培养</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>aladdin</td><td>B265993</td><td>免疫荧光染色实验的封闭</td></tr><tr><td>二氧化碳培养箱</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>细胞冻存管</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>低温保存细胞</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>弃去上清液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>用于细胞保存</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>培养基溶液</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td>BD FACSCelesta</td><td>观察细胞特性</td></tr><tr><td>冻存盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>&amp;nbsp;5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>激光共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>观察免疫荧光染色结果</td></tr><tr><td>PDGFR-&amp;alpha; 抗体</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>免疫荧光染色实验的一抗</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-氨苄溶液</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>加入培养基溶液中以防止污染</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>培养成纤维细胞</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>培养基溶液</td></tr><tr><td>兔（DAIE）单克隆 IgG XR（R）同型对照（PE）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5742S</td><td>作为流式细胞术的对照</td></tr><tr><td>圆形盖玻片</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>在细胞膜上打孔</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>用于细胞传代</td></tr><tr><td>波形蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>免疫荧光染色实验的一抗</td></tr></tbody></table>

从人瘢痕疙瘩组织中分离、培养和鉴定原代真皮成纤维细胞

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

成纤维细胞是瘢痕疙瘩组织中的主要细胞类型，在其形成与发展过程中发挥着关键作用&#160;瘢痕疙瘩。分离和培养源自瘢痕疙瘩组织的原代成纤维细胞，是进一步研究瘢痕疙瘩生物学功能与分子机制以及开发新型治疗策略的基础。传统的原代成纤维细胞获取方法存在诸多局限性，如细胞状态不佳、混杂其他类型细胞以及易受污染等。本文介绍一种经过优化且易于重复的实验方案，可有效减少获取成纤维细胞过程中可能出现的问题。在本方案中，分离后5天即可观察到成纤维细胞，培养10天后细胞融合度可达近80%。随后对细胞进行传代，并利用PDGFRα和vimentin抗体进行免疫荧光检测，以及CD90抗体进行流式细胞术鉴定。综上所述，该方案可简便地获得瘢痕疙瘩组织来源的成纤维细胞，为瘢痕疙瘩研究在实验室中提供充足且稳定的细胞来源。

该实验方案的时间线总结于图1A中。图中还展示了分离过程的一些代表性图像（图2）；表皮层和脂肪层被小心去除后，将真皮层剪切成3-4 mm2的小片段，并接种至培养皿中。
如图3A所示，在组织块处理后第5天，显微镜下可观察到多个组织块出现成纤维细胞的迁出。如图3B所示，成纤维细胞增殖迅速，10天后达到较高的融合度。这些成纤维细胞呈细长的梭形细胞体，在达到较高融合度时排列成束状。按照本方案操作，成纤维细胞可在2–3周内传代并扩增至所需数量。
为验证成纤维细胞的身份和纯度，采用免疫荧光染色法检测成纤维细胞特异性标志物 PDGFRα10 和波形蛋白（vimentin）。如预期所示，图 4A 和 <strong class="x...

本研究描述了一种优化的从瘢痕疙瘩组织中建立原代成纤维细胞的实验方案，可有效且稳定地提供纯净且具有活性的成纤维细胞。

成纤维细胞是瘢痕疙瘩组织中的主要细胞类型，在瘢痕疙瘩的形成与发展过程中发挥关键作用。成纤维细胞的分离与培养……

分离和培养源自瘢痕疙瘩组织的原代成纤维细胞是进一步研究瘢痕疙瘩的基础。通过本方案可轻松获取瘢痕疙瘩组织中的成纤维细胞，为瘢痕疙瘩研究在实验室中提供充足且稳定的细胞来源。首先使用无菌镊子将瘢痕疙瘩组织放入含有10至25毫升添加了1% PSA的PBS的50毫升无菌离心管中。同时，向六孔板的每个孔中加入四毫升 PBS PSA 溶液。现在将组织从管中取出，用 PBS PSA 溶液洗涤两次。使用无菌镊子，将组织依次从一个孔转移到下一个孔。然后用手术剪除去脂肪层和表皮层，保留真皮层不受损伤。用剪刀将修剪好的真皮组织剪成3至5平方毫米大小的组织块，用无菌镊子将组织块转移至下一个孔中。用PBS PSA溶液清洗组织块。使用灭菌镊子将10至30个真皮组织小块以小于5毫米的间距放置于培养皿中。将培养皿倒置放入培养箱，直至组织块干燥并粘附于皿底。随后加入7毫升添加了10% FBS和1% PSA的DMEM培养基，并按此前条件继续孵育培养皿。三天后，用完全培养基更换一半的上清液。每天在40倍显微镜放大下观察成纤维细胞。当成纤维细胞达到90%融合度时，移除培养基中的组织块。用 PBS 清洗成纤维细胞，加入 2 mL 无菌胰蛋白酶 EDTA 溶液。将细胞在湿润培养箱中孵育后，轻轻敲击培养皿，并在显微镜下观察。当大部分细胞脱落时，加入 2 mL 完全培养基终止消化。现在将细胞悬液转移至一个15毫升无菌离心管中，在室温下以300G离心3分钟。小心弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。将成纤维细胞接种至一个9厘米的细胞培养皿中，在湿润的培养箱中孵育。在成纤维细胞于圆形盖玻片上培养并经一抗和二抗孵育后，进行免疫荧光分析时，向载玻片上加入50微升DAPI溶液以染色细胞核。用镊子将洗涤后的盖玻片放置于载玻片上。最后，将样品转移至湿盒中的避光暗盒内，用于荧光显微镜观察。在处理后第5天观察到组织出现成纤维细胞的外延生长。成纤维细胞表现出较高的增殖速率，并在10天后达到汇合状态。这些成纤维细胞具有细长的纺锤形细胞体，在高密度汇合时呈束状排列。免疫荧光染色结果显示成纤维细胞呈现阳性红色荧光，细胞核呈现蓝色荧光。流式细胞术检测显示几乎所有成纤维细胞均表达CD90。本研究描述了一种优化的方法，并提供了清晰的操作步骤，以解决现有难题，提高瘢痕疙瘩成纤维细胞分离与培养的成功率。

isolation-culture-characterization-primary-dermal-fibroblasts-from

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

人瘢痕疙瘩组织中原代真皮成纤维细胞的分离、培养和表征

介绍了一种从人皮肤中快速、高效分离活体成年上皮干细胞的方法。该方法利用酶消化皮肤胶原基质，随后拔取毛囊，并分离单细胞悬液或组织碎片用于细胞培养。...

从成人皮肤中分离和培养表皮干细胞

通过人皮肤钻孔活检样本进行成纤维细胞组织块培养的实验方案是一种技术上稳健且简单的方法，可在4-8周内获得皮肤细胞，并以较低的传代次数保存约1500万至2000万个细胞。...

皮肤穿孔活检组织块培养法获取原代人成纤维细胞

本视频展示了一种从人皮肤组织中分离和培养施万细胞的实验方案。人皮肤组织包含多种细胞类型，包括成纤维细胞和施万细胞。分离后，细胞经抗有丝分裂试剂处理，以清除增殖的成纤维细胞，从而获得纯化的施万细胞培养物。...

从人真皮中分离和培养原代施万细胞

我们报道了一种从原代人成纤维细胞培养物中分离出原始多能皮肤来源前体（SKP）细胞的方法。我们证明，这些源自成纤维细胞培养物的SKP细胞与直接从人皮肤活检组织中获得的SKP细胞具有相似的干细胞特性。这些细胞表达神经嵴标志物nestin，以及OCT4和Nanog等多能性标志物。...

从原代人成纤维细胞培养物中分离未分化的成体干细胞

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in...

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

本文介绍一种从成人皮肤组织中高效分离原代人角质形成细胞的方案。该方法通过在接种培养基中使用ROCK抑制剂Y-27632，使表皮细胞与真皮细胞自发分离，从而简化了传统操作步骤。...

一种简化且高效的人类原代角质形成细胞从成人皮肤组织中的分离方法

本文描述了一种基于流式细胞术（FACS）的方案，用于从人皮肤中分离乳头层和网状层成纤维细胞。该方法避免了传统通过组织块培养进行细胞分离时不可避免的体外培养过程。所获得的成纤维细胞亚群在功能上具有差异，并在真皮层内表现出不同的基因表达模式和空间定位。...

通过荧光激活细胞分选法从人皮肤中分离乳头层和网状层成纤维细胞

细胞重编程需要导入关键基因，这些基因调控并维持多能细胞状态。本方案描述了一种非病毒、非整合的方法，通过使用未修饰RNA（NM-RNA）并结合免疫逃逸因子以降低细胞防御机制，从而实现由人皮肤成纤维细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）克隆。...

从腹部皮肤分离成人人类真皮成纤维细胞及使用非整合方法生成诱导性多能干细胞

本实验方案描述了从小鼠成年腭部分离和培养口腔角质形成细胞的方法。同时报道了一种使用免疫染色进行评估的方法。...

从小鼠成年腭部分离和培养原代口腔角质形成细胞

本文介绍了一种基于组织块培养的方法，用于分离和培养原代的、患者特异性的许多人主动脉平滑肌细胞和皮肤成纤维细胞。此外，还提出了一种测量细胞收缩及进行后续分析的新方法，可用于研究这些细胞在不同患者间的特异性差异。...

分离患者特异性原代主动脉平滑肌细胞及半定量实时收缩测量 体外

研究与肌肉骨骼损伤相关的伤口愈合通常需要评估施万细胞（SCs）、角质形成细胞和成纤维细胞之间的体外相互作用。本方案描述了从人包皮中分离、培养和鉴定这些原代细胞的方法。...

人包皮来源的施万细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的分离、培养与鉴定

学习从人瘢痕疙瘩组织中分离、培养和表征原代真皮成纤维细胞的优化方案。该方法可提供高活力、稳定的细胞来源，用于研究瘢痕疙瘩的形成机制及开发潜在治疗方法。

从人瘢痕疙瘩组织中分离、培养和鉴定原代真皮成纤维细胞

探索更多视频