从人瘢痕疙瘩组织中分离、培养和鉴定原代真皮成纤维细胞

分离和培养源自瘢痕疙瘩组织的原代成纤维细胞是进一步研究瘢痕疙瘩的基础。通过本方案可轻松获取瘢痕疙瘩组织中的成纤维细胞，为瘢痕疙瘩研究在实验室中提供充足且稳定的细胞来源。首先使用无菌镊子将瘢痕疙瘩组织放入含有10至25毫升添加了1% PSA的PBS的50毫升无菌离心管中。

同时，向六孔板的每个孔中加入四毫升 PBS PSA 溶液。现在将组织从管中取出，用 PBS PSA 溶液洗涤两次。使用无菌镊子，将组织依次从一个孔转移到下一个孔。

然后用手术剪除去脂肪层和表皮层，保留真皮层不受损伤。用剪刀将修剪好的真皮组织剪成3至5平方毫米大小的组织块，用无菌镊子将组织块转移至下一个孔中。用PBS PSA溶液清洗组织块。

使用灭菌镊子将10至30个真皮组织小块以小于5毫米的间距放置于培养皿中。将培养皿倒置放入培养箱，直至组织块干燥并粘附于皿底。随后加入7毫升添加了10% FBS和1% PSA的DMEM培养基，并按此前条件继续孵育培养皿。

三天后，用完全培养基更换一半的上清液。每天在40倍显微镜放大下观察成纤维细胞。当成纤维细胞达到90%融合度时，移除培养基中的组织块。

用 PBS 清洗成纤维细胞，加入 2 mL 无菌胰蛋白酶 EDTA 溶液。将细胞在湿润培养箱中孵育后，轻轻敲击培养皿，并在显微镜下观察。当大部分细胞脱落时，加入 2 mL 完全培养基终止消化。

现在将细胞悬液转移至一个15毫升无菌离心管中，在室温下以300G离心3分钟。小心弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。将成纤维细胞接种至一个9厘米的细胞培养皿中，在湿润的培养箱中孵育。

在成纤维细胞于圆形盖玻片上培养并经一抗和二抗孵育后，进行免疫荧光分析时，向载玻片上加入50微升DAPI溶液以染色细胞核。用镊子将洗涤后的盖玻片放置于载玻片上。最后，将样品转移至湿盒中的避光暗盒内，用于荧光显微镜观察。

在处理后第5天观察到组织出现成纤维细胞的外延生长。成纤维细胞表现出较高的增殖速率，并在10天后达到汇合状态。这些成纤维细胞具有细长的纺锤形细胞体，在高密度汇合时呈束状排列。

免疫荧光染色结果显示成纤维细胞呈现阳性红色荧光，细胞核呈现蓝色荧光。流式细胞术检测显示几乎所有成纤维细胞均表达CD90。本研究描述了一种优化的方法，并提供了清晰的操作步骤，以解决现有难题，提高瘢痕疙瘩成纤维细胞分离与培养的成功率。