微凝胶-细胞外基质复合支撑材料用于人源神经组织嵌入式三维打印

在SHAPE复合材料内进行嵌入式3D打印，突破了传统生物制造的局限性，能够在模拟天然细胞外环境的水凝胶内部精确构建对力学敏感的组织结构。SHAPE工具箱依赖于模块化的生物材料设计，可轻松调整打印支撑体系的配方。此外，该方法采用低成本材料和易于获取的设备，便于其他研究团队简便地进行推广应用。

该方法可用于构建空间定义的人类神经组织模型，以研究帕金森病等神经退行性疾病中的神经元发育与通讯。首先，在超纯水中配制浓度为每毫升2毫克的碳酸钙溶液。将其与海藻酸盐溶液等比例混合，并在室温下以650转/分钟的转速磁力搅拌一小时。

然后按1:500的比例向该混合物中加入乙酸，再次搅拌过夜。第二天，使用匀浆器在15,000 RPM条件下将凝胶状海藻酸钠溶液机械剪切10分钟，使其断裂成微粒。随后离心以收集微粒。

小心弃去上清液，并将颗粒重悬于含有2 mM氢氧化钠和1%青霉素-链霉素的DMEM中。悬液颜色应恢复为红色。将悬液在4°C下孵育过夜。

孵育后，在15,000 RPM下将悬浮液匀浆3分钟，并在18,500 ×g下离心10分钟。离心后，弃去上清液，观察沉淀中是否形成紧密聚集的海藻酸盐微粒。为制备SHAPE复合物，将海藻酸盐微粒沉淀与稀释并中和后的胶原按2:1的比例混合，在冰上反复吹打混匀。

将制备的复合材料转移至预冷的24孔板中。打印前，使用0.025%胰蛋白酶溶液在37摄氏度下消化先前培养的人神经干细胞（hNSCs）5分钟，随后用生长培养基中和胰蛋白酶，并在室温下以400 ×g离心细胞悬液5分钟。

去除上清液后，将细胞沉淀重悬于两到三毫升培养基中。使用21号钝头金属针，将100微升紧密聚集的海藻酸盐微粒加入注射器中。然后将制备好的细胞悬液装入另一注射器。

打印时，将装样针头更换为27号钝头金属针头。使用参考软件设计好待打印结构后，点击“生成”以产生G代码。将装有细胞的注射器插入基于挤出的生物打印机的体积挤出头中，并点击“开始针头长度测量过程”以记录针头长度。

然后将载有 SHAPE 复合材料的 24 孔板放置到打印机上，单击 SHM 以测量空孔的表面高度。选择 pH 2，然后点击扳手图标。接着在参数设置中，将体积流速更改为 3.6 微升每秒，点击应用参数，然后点击保存并完成。

通过点击打开 G 代码的图标，将 G 代码加载到打印机用户界面中。选择运行程序图标以启动打印过程。打印完成后，立即将 SHAPE 凝胶在 37 摄氏度下孵育 30 分钟以进行退火。

然后轻轻将生长培养基加入退火的 SHAPE 凝胶支架中。进行免疫染色时，从凝胶上移除多余的培养基，并使用刮铲将凝胶转移至含有 DPBS 的容器中。待培养板置于通风橱内后，移除 DPBS。

用4%甲醛溶液覆盖凝胶，并在室温下孵育一小时。用DPBS洗涤后，向凝胶中加入封闭液。轻轻摇动培养板，在室温下孵育六小时，以防止非特异性结合。

去除封闭液后，加入一抗至凝胶中，并轻轻振荡。在4°C条件下孵育48小时。用DPBS洗涤后，将凝胶同样置于二抗溶液中处理24小时。

将染色后的凝胶用刮勺转移至具有薄层成像底的孔板中，再进行成像。在本研究中，人神经干细胞墨水打印出的细胞丝状结构直径约为200微米。打印出的细丝含有大量活细胞，且形态接近正常。

经过30天的打印后，细胞表现出神经元形态，具有较小的胞体和细长的突起，表明人神经干细胞（hNSCs）成功分化。通过βIII微管蛋白染色，可观察到具有保持几何结构的神经网络。在分化过程中，细胞未从打印的丝状结构中迁移出去。

SHAPE 复合材料可通过打印牺牲性油墨而非细胞来生成可灌注的通道。此外，该支撑材料可包含对氧敏感的微珠，用于监测3D打印结构在时间和空间上的氧张力。