Name: 灵长类动物脑类器官的靶向显微注射和电穿孔用于基因修饰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学习灵长类脑类器官的靶向显微注射和电穿孔技术，实现精准的基因修饰。该方法利用方波电穿孔仪和低成本培养皿电极室，为研究大脑发育和神经进化提供高效可靠的实验手段。

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由于篇幅限制，未能引用所有相关研究人员的工作，我们对此表示歉意。感谢DPZ技术服务中心的Ulrich Bleyer以及MPI-CBG车间的Hartmut Wolf协助构建了培养皿电极室；感谢Stoyan Petkov和Rüdiger Behr提供了人源（iLonza2.2）、恒河猴（iRh33.1）和狨猴（cj_160419_5）的诱导多能干细胞（iPSCs）；感谢Sabrina Heide完成了冷冻切片和免疫荧光染色实验；感谢Neringa Liutikaite和César Mateo Bastidas Betancourt对稿件的审阅与批评建议。W.B.H.实验室的工作得到了ERA-NET NEURON（MicroKin）项目的资助。M.H.实验室的工作得到了欧洲研究理事会启动基金（101039421）的资助。

1. 灵长类 iPSC 的培养
注意：由于该方法具有较强的稳健性，可应用于任何灵长类诱导多能干细胞（iPSC）系。本文描述了利用人源（iLonza2.2）29、黑猩猩（Sandra A）30、恒河猴（iRh33.1）29,&#160;和普通狨猴（cj_160419_5）31 的iPSC系进行脑类器官的制备。培养条件总结于表1中。有关本实验方案所用全部材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>培养相应的iPSC时，应遵循最初描述的培养条件。通常情况下，为成功生成和电转染脑类器官，应使用传代次数不超过90代的iPSC细胞系。此外，在开始生成脑类器官时，需确保iPSC具有多能性特征，且无任何分化迹象。</li>
</ol>
2. 利用灵长类动物诱导多能干细胞生成脑类器官
注意：脑类器官生成方案基于原始脑类器官方案10,34的改良版本28,30,32,33，并进行了一些物种特异性的修改（详见下文）。
<ol>
	<li>诱导多能干细胞接种以生成拟胚体（EBs）
	<ol>
		<li>当诱导多能干细胞（iPSCs）达到80%–90%融合度时，用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞，然后加入500 µL重组胰蛋白酶替代物或1 mL蛋白水解和胶原水解混合酶溶液。 
		注意：通常将iPSCs培养在60 mm细胞培养皿中，以获得约900,000个细胞，足以生成96个脑类器官。可根据所需类器官数量调整细胞数目。需注意，并非所有生成的脑类器官都适用于电穿孔。</li>
		<li>在37 °C下孵育培养皿2分钟，以解离细胞。 
		注意：根据所使用的iPSC细胞系或酶的不同，可能需要额外在37 °C孵育最多2分钟。建议在显微镜下观察培养皿，以确保细胞已开始脱落。</li>
		<li>加入1.5 mL预热（37 °C）的iPSC培养基以终止反应，用移液器上下吹打7–10次（不超过10次），使细胞从培养皿上解离，从而获得单细胞悬液 单细胞悬液.</li>
		<li>将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，于200 × g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>吸弃上清液，将沉淀重悬于2 mL iPSC培养基中，培养基中添加50 µM Y27632或50 µM促存活化合物。</li>
		<li>使用10 µL细胞悬液，用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>使用添加了50 µM Y27632或50 µM促存活化合物的iPSC培养基，将细胞悬液调整至每150 µL含9,000个细胞（即60,000个细胞/mL）。</li>
		<li>为了生成拟胚体（EBs），将150 µL细胞悬液接种至超低吸附96孔板的每孔中。移液时， 轻轻摇动试管 防止细胞沉降，以保持细胞悬浮状态。</li>
		<li>在含5% CO₂的湿润环境中培养EBs2 37 °C、95% 空气接种后第0天 [dps]）。接种后的最初24小时内不要扰动胚胎小体（EBs）。 
		注意：由绒猴iPSCs生成的EBs需在低氧条件（5% CO₂）下的加湿环境中培养2, 5% O₂2，以及90% N2在37 °C下。</li>
		<li>约 48 小时后（2 天后受精），更换为iPSC培养基 不含Y27632/促存活化合物每孔移除 100 µL 培养基，每孔加入 150 µL 预热（37 °C）的新鲜培养基（不含 Y27632）。逐行操作。</li>
		<li>每隔一天更换一次培养基；从每个孔中移除150 µL培养基，并向每孔加入150 µL预热（37 °C）的新鲜培养基，不含Y27632/促存活化合物。 
		注意：在……之后 4-5 天后受精类胚体的周边应变得半透明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经外胚层诱导 
	注意：通常情况下，高质量的EBs应具有 平滑的轮廓和半透明的边界 在此阶段，不同灵长类物种及iPSC细胞系之间的神经诱导时间点略有差异。本实验所用细胞系的情况（见第1节） 材料表），神经诱导用于 狨猴EBs 通常需要启动 在4天后，用于 5 dpi 的恒河猴，以及用于 4-5 天人和黑猩猩的胚胎体 (图1A），具体取决于拟胚体（EBs）的状态（见上文）。
	<ol>
		<li>从96孔板第一行的每个孔中移除150 µL培养基，并加入150 µL预热（37 °C）的 神经诱导培养基 （参见 表 2每孔（同一行）</li>
		<li>继续按照上述方法逐行更换整个96孔板的培养基。每隔一天更换一次神经诱导培养基（NIM），从每孔中移除150 µL NIM，并加入150 µL预热至37 °C的新鲜NIM。 
		注意：从此时起，狨猴EBs应与其他灵长类EBs在相同条件下培养（5% CO₂的加湿 atmosphere）2 37 °C、95% 空气条件下</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在基底膜基质中包埋 
	注意：一旦胚状体表面形成明显、透明且呈放射状排列的神经上皮，就需要为其发育出类似脑室的结构提供结构支持。这可通过将胚状体包埋于基底膜基质中来实现。由于不同胚状体的发育速度存在差异， 狨猴和恒河猴的EBs 已准备好进行包埋 在7天后，而 人类和黑猩猩的EBs 通常被包埋在 8-9 天后受精为简便起见，本方案中基底膜基质仅指 Matrigel。然而，Geltrex 可作为替代品使用。
	<ol>
		<li>为包埋做准备，在超净台内用紫外灯对剪刀、镊子、0.2 mL离心管架以及3至6块经70%（体积/体积）乙醇处理的Parafilm膜照射灭菌15分钟。将基底膜基质置于冰上数小时使其解冻（通常1.5 mL基底膜基质足以用于96个类胚体）。 
		注意： 始终 将基底膜基质置于冰上。</li>
		<li>在Parafilm上创建一个4 × 4的凹穴网格。将Parafilm网格放置在0.2 mL管架上，使包有纸张的一面朝上，然后用戴着手套的手指轻轻按压管架上的每个孔。</li>
		<li>移除纸张，使用剪刀将凹坑网格从石蜡膜方片上剪下，调整其大小以适配60 mm细胞培养皿。将带有凹坑的石蜡膜放回0.2 mL离心管架上，作为基底膜基质液滴生成的支撑基础。</li>
		<li>使用经剪切的200 µL枪头，用移液器将培养皿孔中的拟胚体逐个小心转移至石蜡膜凹槽内。</li>
		<li>将16个EB转移至载网后，更换新的200 µL移液枪头，吸除凹孔中残留的培养基。</li>
		<li>在每个含有一个拟胚体的凹槽中加入一滴基底膜基质（约15 µL）。</li>
		<li>取一支10 µL移液器吸头 迅速地 将EBs移至每个液滴的中心，同时避免扰动液滴边界。</li>
		<li>将带有基底膜基质液滴的有凹痕帕拉菲尔膜放入60 mm细胞培养皿中，在37 °C孵育15–30分钟，使基质聚合。</li>
		<li>为使嵌入基质的EBs从石蜡膜上脱离，加入5 mL 不含维生素A的分化培养基（DM） （参见 表2用镊子将封口膜翻转，使含有胚状体（EBs）的一侧朝向培养皿底部。</li>
		<li>小心晃动培养皿，使含有拟胚体的基底膜基质液滴从Parafilm上脱落。如果仍有部分附着，可用镊子夹住Parafilm方块的一边，迅速多次向培养皿中心卷起。</li>
		<li>在5% CO₂的湿润环境中，将脑类器官置于轨道摇床上以55 rpm培养2 37 °C、95% 空气条件下培养。保持其在 不含维生素A的DM 每隔一天更换一次培养基。为诱导神经元生成，转换至 含维生素A的DM （视黄酸，RA）处理后 狨猴和恒河猴脑类器官为13天，人和黑猩猩脑类器官为14-15天 (图1A从此时起，每隔3-4天更换一次培养基。 
		注意：为了支持神经元存活，自第40天起，可在含维生素A的DM中补充20 µg/mL人神经营养因子3（NT3）、20 µg/mL脑源性神经营养因子（BDNF）和1 µL/mL基底膜基质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 灵长类脑类器官的电穿孔
注意：从技术角度来看，一旦脑类器官中出现足够明显的脑室样结构，即可对其进行电穿孔操作，以便通过显微注射进行靶向。最佳电穿孔时间窗口取决于具体的研究问题以及目标细胞群体。例如，若主要靶向的是顶端前体细胞（APs），则约30天的脑类器官已适用于实验；若主要靶向的是基底前体细胞（BPs）或神经元，则应使用超过50天的较老脑类器官（参见例如Fischer等人的研究28）。
<ol>
	<li>电穿孔装置的准备 
	注意：电穿孔效率受电穿孔质粒的大小和浓度显著影响（详见讨论部分）。
	<ol>
		<li>为对照组和目的基因（GOI）准备足量的电穿孔混合液，例如，每种条件（对照组和GOI）各准备10 µL电穿孔混合液，用于转染约30个脑类器官。 
		注意：电穿孔混合液的组成参见表3。</li>
		<li>将（非无菌）Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）和含维生素A的DM预热至37 °C。准备小刮铲、精细剪刀和普通剪刀，并用70%（体积比）乙醇喷洒器械。 
		注意：由于DM中含有抗生素（参见表2），以下步骤可在无菌或非无菌条件下进行。根据我们的经验，缺乏无菌操作从未引起任何污染。</li>
		<li>准备35 mm细胞培养皿，并将培养皿电极室连接至电穿孔仪。 
		注意：培养皿电极室可商业购买，但也可低成本自行制备（参见补充文件1）。</li>
		<li>使用微加载吸头，将每种电穿孔混合液各8 µL装入显微注射针中。首次使用前用精细剪刀剪去针尖末端，以获得稳定流速。但仅剪去针尖极小部分，因为钝而宽的针尖会严重损伤类器官。 
		注意：显微注射针可直接购买预拉制产品，或在实验室中使用拉针仪自行制备（如有设备）。请遵循拉针仪制造商的说明，制备具有长锥度且针尖直径为10 µm的显微注射针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微注射与电穿孔
	<ol>
		<li>在显微镜下选择五个边界光滑且脑室样结构清晰可见的脑类器官，使用剪去尖端的1,000 µL移液枪头将其转移至含有预热（37 °C）DMEM/F12的35 mm细胞培养皿中。 
		注意：应选择脑室样结构明显且易于接近的脑类器官（参见图1B）。</li>
		<li>为注射脑室样结构，小心将针头穿过其壁，注入电穿孔混合液直至肉眼可见充满。避免对脑室样结构施加过大压力，以防破裂。以相同方式对每个脑类器官的六至八个脑室样结构进行操作。 
		注意：若显微注射过程中针头堵塞，需轻微修剪针尖。</li>
		<li>用少量DMEM/F12将一个已完成显微注射的脑类器官转移至培养皿电极室中。调整类器官位置，使显微注射的脑室样结构表面朝向连接电穿孔仪正极的电极。 
		注意：以这种方式定向可确保细胞在未受邻近结构影响的一侧实现转染。</li>
		<li>使用以下参数逐一进行电穿孔：施加5次脉冲，电压为80 V，脉冲持续时间为50 ms，间隔为1 s。将电穿孔后的类器官转移至新制的、盛有预热（37 °C）DMEM/F12的35 mm细胞培养皿中。 
		注意：电穿孔参数可能取决于所用方波电穿孔仪的具体型号。上述参数针对所引用的电穿孔系统进行了优化。提高电压可能导致细胞移位。</li>
		<li>使用第二种电穿孔混合液（例如GOI）以相同方式处理接下来的五个脑类器官。 
		注意：重复步骤3.2.1–3.2.5，直至达到所需数量的电穿孔脑类器官。</li>
		<li>若显微注射和电穿孔在非无菌条件下进行，则应在超净工作台中将电穿孔后的类器官转移至无菌35 mm细胞培养皿，同时尽量减少DMEM/F12的转移量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑类器官的后续培养与固定
	<ol>
		<li>将电穿孔后的类器官置于含维生素A的DM中，在37 °C、5% CO2和95%空气的湿润环境中，以55 rpm的转速在摇床上继续培养。</li>
		<li>电穿孔次日，在常规倒置荧光显微镜下检查脑类器官的电穿孔效果。 
		注意：根据电穿孔后继续培养的时间长短，脑类器官内受影响的细胞群体可能不同（亦见代表性结果部分）。</li>
		<li>根据研究关注的生物学问题，将电穿孔后的脑类器官培养适当时间后，进行后续实验操作。 
		注意：电穿孔后的脑类器官可用于多种下游应用（例如，固定后进行免疫荧光染色，或速冻用于RNA提取和qRT-PCR）。本文描述的是电穿孔脑类器官的固定方法。</li>
		<li>使用剪去尖端的1,000 µL移液枪头将电穿孔后的类器官转移至15 mL锥形离心管中，并去除多余培养基。</li>
		<li>加入足量的4%多聚甲醛（PFA）DPBS溶液（pH 7.5），室温孵育30分钟。 
		警告：PFA被归类为人类致癌物，可能导致不可逆的健康损害。强烈建议采取额外防护措施，包括佩戴腈手套和护目镜。</li>
		<li>吸除PFA溶液，加入5 mL DPBS，轻轻振荡后吸除DPBS。重复此步骤两次。将类器官保存在4 °C的DPBS中，直至后续使用。 
		注意：本方案可在此处暂停，因经PFA固定的脑类器官可在4 °C保存数月。PFA固定的电穿孔类器官可通过冷冻切片结合免疫荧光染色10,28，或整体染色与透明化处理35,36进行分析。示例图像参见代表性结果部分（抗体详细信息见表4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Genetic Modification of Primate Cerebral Organoids

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文所述方法代表了一种统一的实验方案，用于通过靶向电穿孔技术从不同灵长类物种生成脑类器官。该方法可在模拟灵长类（包括人类）新皮层（病理）生理发育的模型系统中实现目的基因（GOI）的异位表达。这一用于生成灵长类脑类器官的统一方案，在所涉及的四种灵长类物种中均使用相同的材料（如培养基）和操作步骤。不同物种间的发育差异通过调整关键步骤的时间节点来应对（即神经诱导及在基底膜基质中的包埋；见上文）。这可能大致反映了 体内 这些物种之间神经发育的时间差异，构成了一个值得进一步研究的有趣课题。
该方法基于先前一篇关于脑类器官的电穿孔实验研究所描述的技术10。然而，正如Lancaster及其同事所指出的，这些实验受限于严重的细胞凋亡现象，这是由于绿色荧光蛋白（GFP）浓度过高所致，并导致表达强GFP信号的电穿孔细胞被排除10。在我们的实验中，我们发现最终总质粒浓度（例如，编码EGFP的质粒浓度加上编码目的基因的质粒浓度）以1,000 ng/µL为最佳。...

研究大脑皮层的（病理）生理发育与进化是一项艰巨的任务，其进展受到缺乏合适模型系统的限制。以往，此类研究局限于二维细胞培养模型（如原代神经前体细胞或神经元细胞培养）以及进化上相距较远的动物模型（如啮齿类动物）1,2。尽管这些模型在回答某些问题方面具有价值，但它们在模拟健康和疾病状态下发育中人类新皮层的复杂性、细胞类型组成、细胞结构以及基因表达模式方面存在局限性。这些局限性导致例如小头畸形等人类疾病的小鼠模型难以有效转化为人类实际情况，正如某些研究案例所述（如 Zhang 等人3）。近年来，转基因非人灵长类动物因其在进化、功能和形态上更接近人类新皮层发育过程，逐渐成为研究焦点4,5,6,7,8，能够克服基于细胞培养和啮齿类动物模型的诸多局限。然而，非人灵长类动物在科研中的使用不仅成本高昂且耗时漫长，还引发伦理方面的担忧。最近，脑类器官技术的发展9,10成为一种极具前景的替代方案，可解决先前多种模型存在的诸多局限11,12,13,14,15,16。
脑类器官是三维（3D）多细胞结构，可在特定的发育时间窗口内模拟一个或多个脑区的主要细胞结构特征和细胞类型组成11,12,13,14,17。这些三维结构可通过诱导性多能干细胞（iPSCs）生成，或在目标物种可获得的情况下，通过胚胎干细胞（ESCs）生成。根据所使用的方法，通常可将脑类器官分为两类：非定向类器官和区域化（定向）类器官18。在生成后一类类器官时，会添加小分子或因子，以引导多能干细胞向特定脑区的类器官（例如前脑类器官）分化18。相比之下，非定向类器官的分化不依赖于外源小分子的添加，而是完全依赖iPSCs/ESCs的自发分化。由此产生的脑类器官包含代表不同脑区的细胞类型（例如大脑类器官）18。只要能够获得iPSCs或ESCs，脑类器官便可相对低成本且高效地从任何目标物种中生成，并整合了脑发育的诸多关键特征11,12,13,14。这使得脑类器官成为多种神经生物学研究的优秀模型，研究范围涵盖进化与发育问题，到疾病建模和药物筛选15,16。然而，利用脑类器官开展此类研究在很大程度上依赖于多种基因编辑技术的可及性。
研究新皮层（病理）生理发育及其进化的一个关键方面是对基因及基因变异的功能分析。这通常通过基因的（异位）表达和/或基因的敲低（KD）或敲除（KO）来实现。这类遗传修饰可分为稳定的遗传修饰和瞬时遗传修饰，也可根据其是否具有时间和空间上的限制性进行分类。稳定的遗传修饰是指将遗传改变引入宿主基因组中，并可传递给所有后续细胞世代。根据遗传修饰发生的时间点不同，其可能影响类器官中的所有细胞，也可能仅局限于特定的细胞群体。最常见的是，在诱导性多能干细胞（iPSC）或胚胎干细胞（ESC）水平上，利用慢病毒、转座子样系统以及CRISPR/Cas9技术对脑类器官实现稳定的遗传修饰（参见Fischer等17、Kyrousi等19和Teriyapirom等20的综述）。这种方法的优势在于，脑类器官中的所有细胞均携带该遗传修饰，且不受时间和空间的限制。然而，构建和鉴定这些稳定的iPSC/ESC细胞系非常耗时，通常需要数月时间才能开始分析首批经修饰的脑类器官（参见Fischer等17、Kyrousi等19或Teriyapirom等20的综述）。
相比之下，瞬时基因修饰是指递送不整合到宿主基因组中的遗传物质（例如，基因表达质粒）。虽然原则上这种修饰可传递至后续的细胞世代，但所递送的遗传物质会随着每次细胞分裂而逐渐被稀释。因此，这类基因修饰通常在时间和空间上均受到限制。脑类器官中的瞬时基因修饰可通过腺相关病毒或电穿孔实现（例如，Fischer 等人17、Kyrousi 等人19 和 Teriyapirom 等人20 已对此进行综述），其中后者在本文中将被详细描述。与稳定的基因修饰相比，该方法具有快速且成本效益高的优势。事实上，电穿孔操作可在数分钟内完成，且根据靶向的细胞群体不同，经电穿孔处理的类器官可在数天内即可用于分析（例如，Fischer 等人17 和 Kyrousi 等人19 已对此进行综述）。然而，由于此类基因修饰在时间和空间上的局限性，无法通过该方法检测脑类器官的整体形态学变化，例如大小差异。这种局限性在某些情况下也可能成为优势，例如用于研究类器官内特定细胞群体，或在特定发育时间点研究对脑类器官的影响（例如，Fischer 等人17 和 Kyrousi 等人19 已对此进行综述）。
研究基因功能在大脑发育和进化过程中的经典方法是 在子宫内 电穿孔 在子宫内 电穿孔是一种将基因表达载体导入啮齿类动物的常用且有效的技术21,22,23 和雪貂24,25 大脑。首先，将含有目的表达载体的溶液通过子宫壁显微注射至胚胎大脑的特定脑室中，具体注射的脑室取决于目标区域。第二步，施加电脉冲以转染直接毗邻目标脑室的细胞。该方法不仅可用于基因的异位表达或过表达，还可通过显微注射短发夹RNA（shRNA）或CRISPR/Cas9系统（以表达质粒或核糖核蛋白复合物[RNPs]形式）分别实现基因敲低（KD）或基因敲除（KO）研究。26,27。然而， 在子宫内 小鼠、大鼠和雪貂胚胎的电穿孔具有与上述这些动物模型所述相同的局限性。
理想情况下，人们希望直接在灵长类动物体内进行in utero电穿孔。虽然从原则上讲这在技术上是可行的，但由于伦理问题、高昂的动物饲养成本以及较小的每胎数量，in utero电穿孔并未在灵长类动物中实施。对于某些灵长类动物，例如类人猿（包括人类），这种方法完全不可行。然而，这些灵长类动物在研究人类（病理）生理性的新皮层发育及其进化方面具有最大的潜力。解决这一困境的一个方案是将电穿孔技术应用于灵长类动物脑类器官28。
本文介绍了一种针对灵长类脑类器官（即灵长类大脑类器官）进行电穿孔的实验方案。该方法可快速、经济地对类器官中类似脑室结构内的细胞群体进行遗传学改造。具体而言，我们描述了一种统一的实验流程，用于从人（Homo sapiens）、黑猩猩（Pan troglodytes）、恒河猴（Macaca mulatta）和普通狨猴（Callithrix jacchus）的诱导多能干细胞（iPSCs）生成灵长类大脑类器官。此外，我们详细阐述了显微注射与电穿孔技术，并提供了进行灵长类大脑类器官电穿孔的&#34;可行&#34;与&#34;不可行&#34;判断标准。该方法是一种有效的工具，可用于研究新皮质在生理和病理条件下的发育过程及其演化机制，且该模型尤其接近人类的真实情况。

<table><tbody><tr><td>20 &amp;micro;L 微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Merck</td><td>8.05740.0005</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养皿</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-3359</td><td></td></tr><tr><td>激活素 A（Activin A）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3003</td><td></td></tr><tr><td>AOC1</td><td>Selleckchem</td><td>S7217</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 倒置荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>可由性能相当的荧光显微镜替代</td></tr><tr><td>AZD0530</td><td>Selleckchem&amp;nbsp;</td><td>S1006</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（含维生素 A（视黄酸，RA））（50x）</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（不含维生素 A）（50x）</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM 830 方波电穿孔系统</td><td>BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>CGP77675</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0314</td><td></td></tr><tr><td>黑猩猩诱导多能干细胞系 Sandra A</td><td></td><td></td><td>doi: 10.7554/elife.18683&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>普通狨猴诱导多能干细胞系 cj_160419_5</td><td></td><td></td><td>doi: 10.3390/cells9112422</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物 F-12（DMEM/F12）</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>pH 7.0&amp;minus;7.3；使用前恢复至室温</td></tr><tr><td>快绿染料（Fast Green）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林（Forskolin）</td><td>Selleckchem</td><td>2449</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂（100x）</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>谷氨酰胺替代添加剂</td></tr><tr><td>肝素（1 mg/mL 储存液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>人诱导多能干细胞系 iLonza2.2</td><td></td><td></td><td>doi: 10.3390/cells9061349</td></tr><tr><td>人神经营养因子-3（NT-3）</td><td>PeproTech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>Leica MS5 体视显微镜（MDG 17 透射光底座）</td><td>Leica</td><td>10473849</td><td>可由性能相当的体视显微镜替代</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277/354234</td><td>基底膜基质；也可使用 Geltrex（ThermoFisher Scientific，A1413302）</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100x）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂（100x）</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>因具有致癌性，操作时需谨慎</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL）</td><td>PanBiotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>培养皿电极室</td><td>自制（见补充文件1）</td><td></td><td>也可商业购买</td></tr><tr><td>预拉制玻璃移液管</td><td>WPI</td><td>TIP10LT</td><td>长锥形硼硅酸盐玻璃移液管，尖端直径 10 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>促存活化合物（Pro-Survival Compound）</td><td>MerckMillipore</td><td>529659</td><td></td></tr><tr><td>重组人/小鼠/大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）</td><td>PeproTech</td><td>AF-450-02</td><td></td></tr><tr><td>恒河猴诱导多能干细胞系 iRh33.1</td><td></td><td></td><td>doi: 10.3390/cells9061349</td></tr><tr><td>StemMACS iPS-Brew XF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-104-368</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>蛋白水解和胶原水解酶混合物</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td>重组胰蛋白酶替代物；使用前恢复至室温</td></tr><tr><td>超低吸附 96 孔板</td><td>Costar</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72305</td><td></td></tr></tbody></table>

靶向显微注射与电穿孔法对灵长类大脑类器官进行遗传修饰

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

大脑皮层是最外层的脑结构，负责感觉输入和运动输出的处理；它被认为是哺乳动物，尤其是灵长类动物高级认知功能的中枢。由于技术和伦理原因，在灵长类动物大脑中研究基因功能具有挑战性，但脑类器官技术的建立使得在传统灵长类模型（如恒河猴和普通狨猴）以及此前实验难以触及的灵长类物种（如大型类人猿）中，能够在符合伦理且技术要求较低的体系下研究脑发育过程。此外，人类脑类器官还允许对神经发育障碍和神经系统疾病进行深入研究。
由于脑类器官能够重现大脑发育的诸多过程，因此它们也成为在进化背景下识别不同物种脑发育遗传决定因素差异并进行功能比较的有力工具。使用类器官的一大优势在于可以引入遗传修饰，从而实现基因功能的检测。然而，此类修饰的引入过程繁琐且成本较高。本文介绍了一种快速且经济高效的遗传修饰方法，可用于灵长类脑类器官——一种脑类器官亚型——中类似脑室结构内的细胞群体。该方法结合了改良后的人源、黑猩猩源、恒河猴源和普通狨猴源诱导性多能干细胞（iPSCs）脑类器官稳定生成方案，以及显微注射与电穿孔技术，为研究神经发育和进化过程提供了有效工具，亦可用于疾病建模。

本文所述方案可高效地从人类、黑猩猩、恒河猴和普通狨猴的诱导多能干细胞系生成脑类器官，且不同物种间所需的时间调整极少（图1A）。这些类器官可在20至50天之间进行电穿孔，具体时间取决于类似脑室结构的可及性以及目标细胞群体的丰度。然而，在电穿孔之前，必须首先确定脑类器官是否具备足够的质量以进行电穿孔。
适合电穿孔的脑类器官应在外周表现出明显且明亮的类似脑室结构，无退化迹象（如细胞脱落、扩大的凋亡核心），并具有总体致密健康的形态（如无过度生长）（图1B，“可用”）。优先选择具有较大且结构良好的类似脑室结构的脑类器官，以靶向更多数量的细胞。如果类器官的外周区域较暗且未显示任何突出结构，建议不要用于电穿孔，因为缺乏可视标志可能会影响精确的微量注射（图1B，“不可用”）。为获得理想的脑类器官形态，必须确保神经外胚层诱导和基质包埋等关键步骤的时间控制得当。脑类器官形态相关的问题通常源于神经外胚层和/或神经上皮芽形成失败...

灵长类大脑类器官的电穿孔技术为在接近灵长类（病理）生理新皮层发育的模型系统中，向不同类型的前体细胞和神经元引入瞬时遗传修饰提供了一种精确且高效的方法。该技术可用于研究神经发育和进化过程，也可应用于疾病建模。

大脑皮层是最外层的脑结构，负责感觉输入和运动输出的处理；它被认为是……

我们的研究领域是灵长类动物大脑的发育与进化。我们致力于理解灵长类动物新皮质扩张背后的驱动因素。为了以切实可行且符合伦理的方式回答这一问题，我们采用脑类器官作为研究模型。现代人类（我们）与尼安德特人之间在大脑发育上的差异 recently emerged。这些差异源于在脑发育中起关键作用的蛋白质中少数氨基酸的改变。脑类器官在这些研究中已成为至关重要的模型系统。从进化角度研究灵长类动物的发育，并开展功能获得与功能缺失研究具有重要意义。然而，包括人类在内的类人猿天然不适合用于此类实验，因此类器官的基因改造在该领域发挥着至关重要的作用。在我实验室担任博士后期间，Michael Heide 证明了人类特有的基因 ARHGAP11B 在人类进化过程中脑容量增加方面起着关键作用。如今，迈克尔作为德国灵长类动物中心的课题组长，通过比较人类与黑猩猩的脑类器官，提供了至关重要的见解。我们的实验方案采用特异性显微注射类脑室结构的方法，而非使用商业化的电穿孔比色皿，从而实现了靶向遗传修饰。该方法采用成本效益高的装置，包括方波电穿孔仪和培养皿电极室，无需昂贵的核效应子溶液。虽然通过基因改造在灵长类动物中研究脑功能和脑发育在技术上是可行的，但该方法在操作上要求高、成本昂贵，且禁止用于大型类人猿。对灵长类大脑类器官进行电穿孔，为在接近灵长类脑发育的模型中引入基因改造提供了一种快速且经济高效的方法。未来，我们希望聚焦于不同灵长类物种大脑皮层中差异表达基因的鉴定与表征。我们将通过电穿孔技术将基因导入灵长类脑类器官，研究这些基因的功能，并分析其对皮层前体细胞的潜在影响。首先，用杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco PBS 或 DPBS）洗涤培养的诱导多能干细胞（iPSCs），然后加入一毫升蛋白酶和胶原酶混合液。将培养皿置于37摄氏度环境中孵育两分钟，以使细胞脱离。接下来，加入1.5毫升预热的iPSC培养基以终止反应。通过移液吹打7到10次，使细胞从培养皿上解离，获得单细胞悬液。将细胞悬液转移至15毫升锥形离心管中。在室温下以200 × g离心5分钟收集细胞，吸除上清液。将细胞沉淀重悬于2毫升添加了50 µM Y27632的iPSC培养基中。取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。使用添加了50微摩尔Y27632的iPSC培养基，将细胞悬液浓度调整为每150微升含9,000个细胞。为生成拟胚体（EB），在将150微升细胞悬液接种至超低吸附96孔板的每个孔之前，轻轻振荡细胞悬液管以防止细胞沉降。将拟胚体在加湿环境中培养48小时。孵育结束后，每孔移除 100 微升培养基，并加入 150 微升预热的新鲜培养基（不含 Y27632）。将石蜡膜网格纸带纸包覆面朝上放置于 0.2 毫升离心管架上，用戴手套的手指轻轻按压每个管孔位置，在石蜡膜上形成 4 × 4 的凹穴网格，以嵌入胚状体（EBs）至基底膜基质中。随后移除纸片，并用剪刀将石蜡膜上的凹穴网格剪下，调整其大小以适配 60 毫米细胞培养皿。将带有凹面的石蜡膜放回0.2毫升离心管架上，以作为基底膜基质液滴生成的基础。使用剪去尖端的200微升移液枪头，将拟胚体逐个从培养皿的孔中小心转移至石蜡膜的凹面内。将16个拟胚体转移至网格后，更换新的200微升移液枪头，吸除凹面中残留的培养基。现在用移液器将一滴基底膜基质加入每个含有一个拟胚体（EB）的凹面中。取一支10微升移液枪头，迅速将EB移至每滴液滴的中央，注意不要破坏液滴边缘。将带有基底膜基质液滴的带凹面聚四氟乙烯膜置于一个60毫米的细胞培养皿中，在37摄氏度下孵育15至30分钟，使基质聚合。随后，为将包埋在基质中的EB从聚四氟乙烯膜上分离，向培养皿中加入5毫升不含维生素A的分化培养基，并用镊子将聚四氟乙烯膜方块翻转，使带有EB的一面朝向培养皿底部。轻轻晃动培养皿，使含有胚体的基底膜基质液滴从Parafilm上脱落。如果仍有部分附着，可用镊子夹住Parafilm方块的一边，迅速向培养皿中心方向反复卷起数次。随后，将脑类器官置于37°C、含5%二氧化碳和95%空气的湿润环境中，在轨道摇床上以55 rpm的速度进行培养。将类器官置于不含维生素A的DM培养基中，并每隔一天更换一次培养基。图中显示了一个接种后第32天的人脑类器官的明场图像，其周围具有类似脑室的结构，并呈现致密健康的形态。首先为对照组和目的基因准备足量的电穿孔混合液。将培养皿电极室连接至电穿孔仪。然后使用微量加样器吸头，将每种电穿孔混合液各8 µL注入显微注射针中。使用精细剪刀在使用前剪去针尖，以获得稳定的流速。确保仅切去吸头尖端的一小部分，因为钝且宽的吸头会严重损伤类器官。在显微镜下挑选五个边界光滑、具有可见的类似脑室结构的脑类器官，然后用剪切过的1000微升移液器吸头将其转移至含有预热DMEM/F12培养基的35毫米细胞培养皿中。现在小心地将针头插入类似心室结构的壁内，并注入电穿孔混合液，直至其明显充满。避免对类似心室的结构施加过大压力，以防破裂。用少量 DMEM/F12 将一个显微注射后的大脑类器官转移至培养皿电极腔中。将类器官摆放，使显微注射后形成的类似脑室结构的表面朝向连接电穿孔仪正极的电极。现在逐个对脑类器官进行电穿孔，设置参数为每次80伏、持续50毫秒，共5次脉冲，每次间隔1秒。如果显微注射和电穿孔操作在非无菌条件下进行，则将电穿孔后的类器官转移至超净工作台内的一个新的35毫米细胞培养皿中，培养皿内应含有预热的DMEM/F12培养基。随后，将电穿孔后的类器官置于含维生素A的培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳和95%空气的湿润环境中，以55 rpm的转速在摇床上进行培养。电穿孔后的第二天，在常规倒置荧光显微镜下观察脑类器官，以确认电穿孔是否成功。使用剪去尖端的1,000微升移液器吸头将电穿孔后的类器官转移至15毫升锥形离心管中，并吸除多余培养基。加入足量的4%多聚甲醛（paraformaldehyde）DPBS溶液，室温孵育30分钟。孵育结束后，吸除多聚甲醛溶液。随后加入5毫升DPBS，轻轻振荡，然后吸除DPBS。将类器官置于含有 DPBS 的环境中，于 4°C 保存以待后续使用。电转后两天，GFP 阳性细胞几乎全部定位于室管膜区，并表达 PAX6，表明这些细胞为顶端前体细胞或新生的基底前体细胞。10 天后，GFP 阳性细胞则定位于基底区域。这些细胞还表达 PAX6 或 NeuN，分别表明其为基底前体细胞或神经元。图中展示了电转染脑类器官的三维重建，以呈现 GFP 阳性细胞在三维空间中的分布情况。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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