Name: 麻醉小鼠颅外刺激电极的放置和脑血流量和颅内电场的测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 学习在麻醉小鼠中放置颅外刺激电极并测量脑血流量与颅内电场的方法。该方案通过电刺激改善阿尔茨海默病模型小鼠的动态脑血流反应缺陷，为神经退行性疾病治疗提供新策略。

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本研究获得了以下基金项目资助（资助对象：D.A.T.）：NIA RO1 AG074999、NIA R21AG051103、VA I21RX002223 和 VA I21 BX003023。

所有动物实验程序均经杜克大学机构动物护理和使用委员会或监管涉及动物研究的同等地方主管部门批准。有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 仪器准备
<ol>
	<li>确保所有必需物品和手术器械均已备齐（图2头皮清洁液（酒精棉片）、胶带、镊子、剪刀以及用于钻制小（0.5 mm）钻孔的钻头。</li>
	<li>准备用于颅骨表面的颅外电极，并确保如果电极曾被使用过，则已清除其上的任何手术胶残留物。</li>
	<li>在将这些经颅交流电刺激（tACS）电极应用于颅骨之前，直接验证其阻抗。为此，将两个电极置于生理盐水浴中，并使用tACS刺激器内置的测量功能进行检测。 
	注意：首选阻抗为 &lt;每对电极的电阻为5 KΩ，以允许足够的电流通过颅骨。刺激器设备在输出恒流脉冲前会检测阻抗，并直接显示其数值。</li>
</ol>
<img alt="手术器械套装布局；剪刀、镊子、手术刀、细镊；无菌操作设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于制备颅外刺激所需器械的照片，包括解剖器械和剪刀。1. 微型解剖剪，11.5 cm；2. 镊子，11.5 cm，轻微弯曲，带齿；3. Dumont #7 镊子，弯曲型；4. Dumont #5 镊子；5. 微型刮匙，13 cm；6. 棉签；7. 手术胶带；8. 酒精棉片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 手术动物的准备
注意：在这些实验中，我们使用了14只年龄在12至33周之间的C57BL/6对照小鼠，其中雄性5只，雌性9只。
<ol>
	<li>在诱导室中使用30% O₂中的异氟烷对动物进行麻醉2 以约1.5 L/min的流速，初始使用约4%浓度诱导，随后以1.25%–1.5%浓度维持麻醉水平，保持自主呼吸，并足以消除夹尾反应。</li>
	<li>诱导后将动物转移至立体定位仪，随后将其头部固定于鼻部固定器和耳杆中，以进行后续的电极放置和钻颅手术（图1 和 图3).</li>
	<li>将立体定位仪的鼻锥连接至麻醉蒸发器 通过 一个进气口和一个出气口，通过废气清除系统（如活性炭或真空装置）去除残留的异氟烷。确保鼻罩无空气泄漏，以维持异氟烷麻醉水平，并防止其意外泄漏至室内空气中图3).</li>
	<li>检查小鼠在立体定位仪框架中的位置，包括鼻罩的位置，以确保其在无气管插管的情况下能够自主呼吸，同时保证适当的麻醉恢复和废气清除，以保护科研人员图3).</li>
	<li>将用于测量脉搏、脉搏血氧饱和度（pulse OX）、血压和体温的探头放置于动物身上；确保脉搏血氧饱和度不低于90%，且脉搏 &gt;450次/分钟（报警下限显示为380次/分钟）。根据记录系统的情况，于操作过程中定期或连续记录这些参数。图3).</li>
	<li>在开始操作前，使用（例如）脚趾夹捏法检查动物的镇静程度以评估反射情况。若无反射，则表明镇静程度理想，前提是动物仍保持自主呼吸及足够的脉搏血氧饱和度。若存在反射，则应增加异氟烷的供给以加深麻醉程度，随后重新检查反射。持续观察并监测动物的呼吸频率，并据此调整异氟烷的供给量。</li>
	<li>剃除头皮上的毛发，或使用脱毛膏去除毛发（用酒精棉片擦拭以清除残留的脱毛膏）。</li>
	<li>涂抹眼药膏，然后使用剪刀切除前，用碘酒和酒精各擦拭三次，无菌清洁头皮。</li>
</ol>
<img alt="动物实验装置、光学实验、手术台上的小鼠、生物医学研究设备" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：动物固定于立体定位仪中的图像，颅骨已暴露，仅放置了经颅交流电刺激（tACS）电极（尚未钻孔）。 请注意尾部的血压监测装置以及足掌上的脉搏血氧仪，读数显示在左侧。鼻罩周围设有异氟烷废气收集管。缩写：tACS = 经颅交流电刺激。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 手术步骤：放置刺激电极并制作颅骨钻孔
<ol>
	<li>对于终末期实验，使用手术剪去除头皮，从枕骨缝向后暴露约 3 mm，从前囟向前暴露约 3 mm，以暴露部分后额缝。从顶骨区域切除头皮，双侧暴露颞肌的起始部分（图 3）。</li>
	<li>清除残留的皮下结缔组织，使颅骨表面清洁干燥，以便放置刺激电极。</li>
	<li>在电极将与颅骨接触的一侧涂抹导电凝胶或糊剂，并在电极边缘间断处使用外科速干胶固定电极。 
	注意：避免导电凝胶与外科速干胶接触，以确保电极与颅骨表面形成更牢固的粘附。电极的外表面也可用外科速干胶进行绝缘处理（若在存活手术中关闭头皮，则可防止与头皮接触）。</li>
	<li>可使用市售的平面电极，或自制电极：采用直径为 100 µm 的绝缘导线（焊接到电极板上），并根据颅骨大小裁剪出 1 mm × 3 mm 的柔性铜板，单面绝缘。</li>
	<li>在不扰动电极的前提下，在双侧颞肌和头皮上涂抹利多卡因糊剂，以减少肌肉和外周神经的激活。</li>
	<li>当颅外刺激电极就位于颅骨两侧各 4 mm 处（位于前囟与人字缝之间）后，在矢状缝垂直方向上，于中线两侧各 2 mm 处钻两个相距 4 mm 的 0.5 mm 直径骨孔（图 1）。用无菌矿物油填充这些骨孔，防止颅外电极的电流进入颅内。</li>
	<li>如实验需要诱导扩散性去极化（例如钾离子诱导的扩散性去极化 [K+-SD]），可在颅骨右侧冠状缝前方约 1.5 mm、后额缝外侧约 1 mm 处增加第三个 0.5 mm 直径骨孔。该骨孔用生理盐水填充，用于后续施加 1 M KCl 以诱导 K+-SD。</li>
	<li>在钻骨孔前后，均应检测颅外刺激电极的阻抗（并与同一电极置于生理盐水浴中的阻抗进行比较），以确认骨孔不会干扰电流向脑组织的传导（即确保阻抗无变化）。 
	注意：阻抗测量由刺激设备直接提供。通常我们发现整个系统的阻抗（即从颅外电极经颅骨/脑组织通路，通常约为 3 KΩ）相对恒定，不受骨孔和玻璃微电极的影响，表明通过骨孔直接进入脑组织的电流泄漏极小。</li>
	<li>慢性经颅刺激电极的放置方式类似。在此情况下，应对电极外表面进行绝缘处理，缝合头皮，并将绝缘导线经头皮下穿出，或连接至固定在颅骨上的头件。</li>
</ol>
4. 生理学实验步骤
<ol>
	<li>在动物完全准备好进行非存活状态的生理实验后，开始实验的生理学部分。维持足够的麻醉水平，以确保自主呼吸以及充分的脉搏血氧、呼吸和脉搏水平。</li>
	<li>通过以下两种方法之一测量颅外刺激引起的脑血流量（CBF）。
	<ol>
		<li>将小鼠置于激光散斑成像设备下，可选择是否同时植入颅内记录电极，以在刺激期间测量颅内电场（图3）。</li>
		<li>将动物转移至生理实验装置，放置双侧激光多普勒探头和颅内电极，以在刺激期间测量颅内电场（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 双侧激光多普勒和玻璃电极的放置
<ol>
	<li>将动物转移至显微镜载物台上，以放置双侧激光多普勒探头。将探头置于颅骨表面双侧钻孔之间、冠状缝上方（图1）。</li>
	<li>用0.2 M NaCl溶液填充拉制的玻璃微电极（约0.1 µM，阻抗2-6 MΩ），并通过微操纵器将电极插入位于矢状缝两侧的两个钻孔中3,14（图1）。 
	注意：这些钻孔位于两个对称的颅外刺激电极之间（图1）。</li>
	<li>电极插入脑组织后，确保玻璃微电极深入大脑皮层约1 mm。在多个对称深度进行深度记录。用无菌矿物油填充钻孔，以绝缘电流通路。</li>
</ol>
6. 经颅交流电刺激（tACS）或经颅直流电刺激（tDCS）的刺激程序及刺激强度的测量
<ol>
	<li>使用具有至少四个通道的数字化系统和软件（采样频率为1 kHz），同步记录颅骨上的双激光多普勒探头信号以及两个颅内微电极的输出信号（通过直流放大器配合前置放大头stage记录）。在获得足够长时间的稳定基线数据后（即 &gt;10 分钟），测试颅外刺激。 
	注意： 图4 显示了四个通道的示例，其中上方两个通道为颅内记录电极信号，下方两个通道为脑血流（CBF）响应信号。</li>
	<li>在可耐受范围内，以不同强度（即 20–30 秒，0.5–2.0 mA）进行短暂的开关刺激，以获取刺激前后清晰的基线图4）。在两侧颅骨tACS电极之间施加刺激（图1) 使用一种商用的人体兼容刺激装置，该装置可提供恒定电流。</li>
	<li>密切观察小鼠是否出现肌肉抽搐或对tACS的其他反应，例如脉搏或呼吸的变化，以确定耐受性的上限（通常约为2 mA）。</li>
	<li>继续在刺激时段监测电极间的阻抗，以确保其保持恒定。</li>
	<li>加入少量（2-3 µL1 M KCl 溶液注入前囟门钻孔处14 诱导自发性K+ -SD事件。这些事件会产生显著的脑血流（CBF）反应，以及K+ -SD诱导的CBF反应与其它CBF反应之间的相互作用。通过在SD发生前后均施加经颅交流电刺激（tACS），估算tACS对CBF反应的影响。</li>
	<li>实验结束时，通过过量异氟烷（5%）实施安乐死，待呼吸和心跳停止后，进行断头处死。</li>
</ol>
<img alt="静态平衡分析，时间序列图；显示动态力测量结果和数据趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：显示对低强度 tACS 响应的四通道原始数据。 数据排列方式为上方两行为颅内直接直流电记录（标记为输入 1 [IN0] 和输入 2 [IN1]），下方两行为双侧激光多普勒法记录的脑血流量。请注意，右侧（上方）与左侧（下方）的电生理信号和脑血流迹线之间的响应呈现不对称性。（A）在 1.2 mV/mm、持续 20 秒的刺激（0.75 mA）下出现较小响应（脑血流增加 16%）。（B）在 1.4 mV/mm 刺激（1.0 mA）下出现较大响应（脑血流增加 21%）。缩写：tACS = 经颅交流电刺激。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
7. 电场的计算
<ol>
	<li>使用记录到的两个正弦波（图4 中上方两条轨迹）的半波（一个周期）之间的差异，测量两个颅内电极输出信号的差值。将该差值（mV）除以两个电极之间的距离（mm，此处约为 4 mm，但每次需直接测量），得到场强（mV/mm）3,6。</li>
</ol>

Mapping Cerebral Blood Flow and Electrical Fields: Electrode Placement in Mice

<ol><li>Bestmann, S., Walsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcranial electrical stimulation.</a> Current Biology. 27 (23), R1258-R1262 (2017).</li>
<li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+in+research+with+transcranial+electrical+stimulation%3A+An+NIMH-sponsored+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility in research with transcranial electrical stimulation: An NIMH-sponsored workshop.</a> Brain Stimulation. 11 (3), 465-480 (2018).</li>
<li>Turner, D. A., Degan, S., Galeffi, F., Schmidt, S., Peterchev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+dose-dependent+enhancement+of+cerebral+blood+flow+by+transcranial+AC+stimulation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%22%5BJournal%5D)">Rapid, dose-dependent enhancement of cerebral blood flow by transcranial AC stimulation in mouse.</a> Brain Stimulation. 14 (1), 80-87 (2020).</li>
<li>Shah, S., Chhatbar, P. Y., Feld, J. A., Feng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+tDCS+into+routine+inpatient+rehabilitation+practice+to+boost+post-stroke+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%22%5BJournal%5D)">Integrating tDCS into routine inpatient rehabilitation practice to boost post-stroke recovery.</a> Brain Stimulation. 13 (4), 953-954 (2020).</li>
<li>Voroslakos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+transcranial+electric+stimulation+on+brain+circuits+in+rats+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct effects of transcranial electric stimulation on brain circuits in rats and humans.</a> Nature Communications. 9 (1), 483(2018).</li>
<li>Alekseichuk, I., Mantell, K., Shirinpour, S., Opitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+modeling+of+transcranial+magnetic+and+electric+stimulation+in+mouse%2C+monkey%2C+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Comparative modeling of transcranial magnetic and electric stimulation in mouse, monkey, and human.</a> Neuroimage. 194, 136-148 (2019).</li>
<li>Tavakoli, A. V., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+alternating+current+stimulation+%28tACS%29+mechanisms+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcranial alternating current stimulation (tACS) mechanisms and protocols.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 214(2017).</li>
<li>Yavari, F., Jamil, A., Mosayebi Samani, M., Vidor, L. P., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+functional+effects+of+transcranial+electrical+stimulation+%28tES%29-An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Basic and functional effects of transcranial electrical stimulation (tES)-An introduction.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 85, 81-92 (2018).</li>
<li>Wachter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+direct+current+stimulation+induces+polarity-specific+changes+of+cortical+blood+perfusion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat.</a> Experimental Neurology. 227 (2), 322-327 (2011).</li>
<li>Han, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+responses+in+rat+brain+during+transcranial+direct+current+stimulation%3A+A+functional+near-infrared+spectroscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic responses in rat brain during transcranial direct current stimulation: A functional near-infrared spectroscopy study.</a> Biomedical Optics Express. 5 (6), 1812-1821 (2014).</li>
<li>Ayata, C., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+depression%2C+spreading+depolarizations%2C+and+the+cerebral+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spreading depression, spreading depolarizations, and the cerebral vasculature.</a> Physiological Reviews. 95 (3), 953-993 (2015).</li>
<li>Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-loop+control+of+epilepsy+by+transcranial+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation.</a> Science. 337 (6095), 735-737 (2012).</li>
<li>Hoang, K. B., Cassar, I. R., Grill, W. M., Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+and+stimulation+algorithms+for+adaptive+brain+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biomarkers and stimulation algorithms for adaptive brain stimulation.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, 564(2017).</li>
<li>Turner, D., A, D. S., Hoffmann, U., Galleffi, F., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CVN-AD+Alzheimer%27s+mice+show+premature+reduction+in+neurovascular+coupling+in+response+to+spreading+depression+and+anoxia+compared+to+aged+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+and+Dementia%22%5BJournal%5D)">CVN-AD Alzheimer's mice show premature reduction in neurovascular coupling in response to spreading depression and anoxia compared to aged controls.</a> Alzheimer's and Dementia. 17 (7), 1109-1120 (2021).</li>
<li>Colton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mNos2+deletion+and+human+NOS2+replacement+in+Alzheimer+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">mNos2 deletion and human NOS2 replacement in Alzheimer disease models.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 73 (8), 752-769 (2014).</li>
<li>Castano-Prat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+slow+%28%3C1+Hz%29+and+fast+%28beta+and+gamma%29+neocortical+oscillations+in+the+3xTg-AD+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Altered slow (<1 Hz) and fast (beta and gamma) neocortical oscillations in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease under anesthesia.</a> Neurobiology of Aging. 79, 142-151 (2019).</li>
<li>Etter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+gamma+stimulation+rescues+memory+impairments+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic gamma stimulation rescues memory impairments in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 10 (1), 5322(2019).</li>
<li>Iaccarino, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+frequency+entrainment+attenuates+amyloid+load+and+modifies+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia.</a> Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).</li>
<li>Martorell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-sensory+gamma+stimulation+ameliorates+Alzheimer%27s-associated+pathology+and+improves+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-sensory gamma stimulation ameliorates Alzheimer's-associated pathology and improves cognition.</a> Cell. 177 (2), 256-271 (2019).</li>
<li>Dawson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagus+nerve+stimulation+paired+with+rehabilitation+for+upper+limb+motor+function+after+ischaemic+stroke+%28VNS-REHAB%29%3A+A+randomised%2C+blinded%2C+pivotal%2C+device+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Vagus nerve stimulation paired with rehabilitation for upper limb motor function after ischaemic stroke (VNS-REHAB): A randomised, blinded, pivotal, device trial.</a> Lancet. 397 (10284), 1545-1553 (2021).</li>
<li>Hacker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+in+early-stage+Parkinson+disease%3A+Five-year+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation in early-stage Parkinson disease: Five-year outcomes.</a> Neurology. 95 (4), e393-e401 (2020).</li>
<li>Duun-Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+in+electroencephalographic+monitoring%3F+Subscalp+devices+for+ultra-long-term+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings.</a> Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).</li>
<li>Haneef, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-scalp+electroencephalography%3A+A+next-generation+technique+to+study+human+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sub-scalp electroencephalography: A next-generation technique to study human neurophysiology.</a> Clinical Neurophysiology. 141, 77-87 (2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案重点关注 体内，麻醉状态下测量脑血流（CBF）反应作为评估脑对经颅电刺激（tES）反应的生物标志物14长期的tES反应生物标志物包括组织学治疗效应，例如在多种阿尔茨海默病模型中通过40 Hz伽马刺激对淀粉样斑块形成所起到的预防作用或改变。16,17,18,19但短期生物标志物也有助于评估即时生理效应，并用于计算剂量-反应曲线3该相同方案也可用于跨颅骨的慢性tES刺激，但需要将刺激导线引至便于间歇性连接的位置，以实现清醒状态下的刺激。
该方案中的第一个关键步骤是保持双侧刺激电极的低阻抗，并在每次刺激时段测量该阻抗。可通过使用足够的导电膏、颅骨表面的绝缘处理，以及在颅骨钻孔处使用矿物油（以防止电流进入颅内的替代通路...

经颅电刺激（tES；采用正弦波刺激时称为tACS）是一种常见的外部非侵入性脑神经调控方法1,2此前，我们提出假设认为，在特定剂量下，经颅电刺激（tES，尤其是经颅交流电刺激tACS）可能增加相应脑区的脑血流量（CBF）3此外，施加的外部电流或颅内电场与相应的脑血流（CBF）反应之间可能存在剂量-效应关系。然而，大多数临床刺激方案均采用在预定时间段内（即30–45分钟）以受试者可耐受的最大舒适皮肤刺激强度（即约2 mA）作为治疗方案4,5在啮齿类动物中，可以使用侵入性颅外脑电极，直接将其放置于颅骨上，以研究经颅电刺激（tES）在脑内诱导的电场。6因此，本方法的目标是确定在相关频率下，经颅交流电刺激（tACS）强度对脑血流（CBF）变化的影响，即建立剂量-反应关系。该剂量-反应曲线基于脑血流的直接测量这一短期生理生物标志物，与施加于大脑的电场相关。3我们先前已表明，在较大振幅下（通常超出临床tACS在脑内诱导的电场范围），诱导的电场与皮层脑血流量（CBF）之间存在近乎线性的相关性。3然而，较小范围的刺激（即1-5 mV/mm强度）可能在人类应用中更具相关性和可行性；因此，我们已改进技术以检测更微小的脑血流量变化。
本文描述了一种用于分析低场强经颅电刺激（tES）交流正弦电流（tACS）对脑血流量（CBF）影响的实验方案（即0.5–2.0 mA电流，1–5 mV/mm电场），该参数范围可被清醒状态下的啮齿类动物耐受5。本方案结合在tACS过程中使用新型激光散斑成像技术以及双颅内玻璃电极，以同时确定tACS在脑内的作用范围（通过CBF监测）和颅内电场强度，相关结果以示意图和实际实验照片形式展示（图1）。tES在脑内可能产生多种生理效应，包括直接神经元调控、神经可塑性以及星形胶质细胞激活7,8。尽管已有研究采用经颅直流电刺激（tDCS）测量CBF9,10，但这些测量方法速度慢、间接且不足以评估脑内的剂量-效应关系。因此，通过使用适当的短期生物标志物（即CBF、电场）以及快速开启/关闭的tACS序列，我们现在能够更准确地估算剂量-效应函数。此外，我们可以采用多种技术测量CBF，包括聚焦式激光多普勒探针（LD）和针对特定感兴趣区域的激光散斑成像（LSI）。
<img alt="经颅刺激装置；激光多普勒、微电极、用于血流研究的电极示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：经颅刺激示意图及实验照片示例。（A）经颅刺激装置示意图。图中显示小鼠颅骨，标出冠状缝和矢状缝。经颅电极对称地置于颅骨两侧，并使用外科胶水和导电膏固定于电极与颅骨之间。这些电极连接至一种适用于人类的恒流刺激装置，该装置可设定刺激的频率、幅度和持续时间。为评估颅内电场，将双侧玻璃电极（约2 MΩ）插入大脑皮层（即通过小钻孔进入颅骨内表面1 mm范围内），电极用矿物油密封，并在颈部肌肉中设置AgCl接地电极（图中显示为中央较粗的导线，埋入皮下颈部组织）。这些玻璃电极连接至直流放大器，其输出信号通过至少四通道的数字化仪记录。双侧激光多普勒探头也放置于颅骨表面用于记录。整个颅骨还可使用激光散斑成像设备或高分辨率（至少1,024 × 1,024像素，12–14位像素深度）制冷相机进行成像，以检测固有光学信号。通常选择血红蛋白等吸收波长（即562 nm）作为血流成像的照明光源。（B）实际实验的特写照片，显示双侧激光多普勒探头（位于左侧）、通过钻孔插入的双侧颅内玻璃记录微电极，以及侧方放置的tACS刺激电极。缩写：tACS = 经颅交流电刺激。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了评估其机制，我们还可以研究其与其他生理过程的相互作用，这些过程同样会影响脑血流量（CBF），例如由K+诱导的扩散性去极化11。此外，除了在固定时间进行规律性刺激外，还可以基于多种疾病的其他生物标志物开发闭环系统，这已在癫痫治疗中被提出（例如临床使用的Neuropace设备）12。例如，针对帕金森病的闭环脑刺激通常依赖于该疾病在多巴胺不足情况下特有的异常局部场电位（LFPs）（通常是β频段的LFPs）13。

<table><tbody><tr><td>酒精棉片</td><td>HenryShein</td><td>112-6131</td><td></td></tr><tr><td>婴儿矿物油</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL 注射器</td><td>Becton Dikinson</td><td>REF 305699</td><td></td></tr><tr><td>C3 平面电极</td><td>Neuronexus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td></td><td></td><td>来自 NIH 种群&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>铜颅骨电极</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440，Clampex</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>FST</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 弯头镊子</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>Major</td><td>LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-87</td><td></td></tr><tr><td>11.5 cm 轻度弯曲带齿镊子&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic 23 G 针头</td><td>Becton Dikinson</td><td>REF 427565</td><td></td></tr><tr><td>1 M KCl 溶液</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒探头</td><td>Moor Instruments</td><td>0.46 mm 激光多普勒探头</td><td></td></tr><tr><td>激光散斑成像设备</td><td>RWD</td><td>RFLSI-ZW</td><td></td></tr><tr><td>13 cm 微型刮匙</td><td>FST</td><td>10080-05</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪刀，11.5 cm</td><td>Roboz</td><td>RS-5914</td><td></td></tr><tr><td>小鼠麻醉固定装置</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuroconn-DS</td><td>Neurocare</td><td>DC-Stimulator Plus</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite 监测系统</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisherbrand</td><td>22363167</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl 生理盐水溶液</td><td>Baxter</td><td>281322</td><td></td></tr><tr><td>Sensicam QE 相机</td><td>PCO Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>Axon Instruments Clampex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科粘合剂</td><td>Covetrus</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>外科胶带</td><td>3M Transpore</td><td>T9784</td><td></td></tr></tbody></table>

麻醉小鼠颅外刺激电极的放置及脑血流与颅内电场的测量

Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice

检测脑血流（CBF）对各种神经元激活形式的反应，对于理解大脑动态功能以及脑组织供血底物的变化至关重要。本文描述了一种测量经颅交流电刺激（tACS）所诱发的CBF反应的实验方案。剂量-反应曲线既根据tACS电流强度（mA）引起的CBF变化进行估计，也根据颅内电场（mV/mm）进行估计。我们基于玻璃微电极在大脑两侧测得的不同幅度来估算颅内电场。本文介绍了实验装置，该装置使用双侧激光多普勒（LD）探头或激光散斑成像（LSI）技术测量CBF；因此，该实验需要麻醉以确保电极植入和记录过程中的稳定性。我们展示了CBF反应与电流强度随年龄变化的相关性，结果显示，在年轻对照组动物（12–14周龄）中，较高电流（1.5 mA和2.0 mA）引起的CBF反应显著大于老年动物（28–32周龄）（p &lt; 0.005 差异）。我们还发现，在电场强度&lt;5 mV/mm时即可引发显著的CBF反应，这一发现对未来的人体研究具有重要意义。这些CBF反应还受到麻醉使用情况（与清醒动物相比）、呼吸控制方式（即插管通气与自主呼吸）、系统性因素（如CO2）以及血管内局部传导（由周细胞和内皮细胞介导）的显著影响。同样，更精细的成像或记录技术可能会将观测视野从全脑限制为仅一个小区域。本文还描述了用于施加tACS刺激的颅外电极的使用方法，包括自制和商用的啮齿类动物电极设计、利用双侧玻璃直流记录电极同步测量CBF和颅内电场的技术，以及成像方法。目前，我们正在将这些技术应用于阿尔茨海默病和脑卒中动物模型中，以实现闭环调控方式增强CBF的目标。

代表性结果如图4、图5和图6所示。图4展示了四个通道的示例，其中上方通道为颅内记录电极信号，下方通道为脑血流（CBF）反应。经颅交流电刺激（tACS）在颅骨两侧呈对称分布，但通常情况下，颅内电场反应对于施加的交流电流呈现轻微的不对称性，一侧的反应幅度大于另一侧（图4）。tACS电刺激诱发的CBF反应3在较高刺激强度下（即0.75–2.0 mA，图4B）通常表现为时相性反应，而在较低刺激强度下（0.5–0.75 mA，图4A）则更为持续稳定。由于CBF记录（无论是采用激光散斑成像还是激光多普勒测量）存在噪声并表现出自发性波动，因此在较低刺激强度下，我们对5–10个tACS周期进行...

我们描述了一种通过脑电场测量和相关生物标志物——脑血流量，来评估颅外刺激剂量-反应曲线的实验方案。由于该方案涉及将电极侵入性地植入脑内，因此需要实施全身麻醉，并优先选择自主呼吸而非控制性呼吸。

脑血流（CBF）对多种形式神经元激活反应的检测对于理解大脑动态功能至关重要，并且……

脑血流量可通过氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的饱和度来测量。这种饱和度的增加会随着衰老以及在阿尔茨海默病模型中而降低。我们正在通过施加的电流和颅内电场密度来评估电刺激的强度。最新的研究进展包括改进颅外刺激技术，以应用于阿尔茨海默病的动物模型。目前，在动物模型中已采用多种成像技术，包括激光光谱成像、双光子显微镜成像以及生理信号记录。当前面临的挑战在于阐明阿尔茨海默病模型中脑血流动力学反应变化的机制基础。我们发现阿尔茨海默病模型小鼠对代谢挑战的反应存在缺陷，而施加颅外刺激可改善这些缺陷。本方案的优势在于，基于刺激的方法可改善脑血流量。

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麻醉小鼠颅外刺激电极的放置和脑血流量和颅内电场的测量

本视频演示了从小鼠大脑双侧M2区域进行局部场电位（LFP）的in...

小鼠大脑双半球局部场电位的记录

非束缚式脑电遥测技术是一种有价值的实验方法，可用于在自由活动的啮齿类动物中长期记录体内脑电图。本详细方案描述了立体定位下在不同脑区进行硬膜外和深部脑内电极植入的操作步骤，以实现对中枢神经系统节律性活动及相关行为阶段的可靠记录。...

非束缚式脑电遥测：硬膜外与深部脑内立体定位脑电电极植入

本研究介绍了在乌拉坦麻醉条件下对超直接通路进行多部位体内电生理记录的方法学。...

急性麻醉大鼠超直接通路局部场电位与多单元活动的体内电生理记录

本方案展示了如何在小鼠中建立可靠的高频刺激（HFS）方法。通过HFS直接和间接地对海马齿状回中的神经元进行电刺激。 体内神经元活动和分子信号传导通过以下方式检测 c-fos...

一种通过高频刺激激活小鼠齿状回的侵入性方法

我们介绍了在小鼠双侧次级运动皮层（M2）中进行局部场电位（LFP）的体内电生理记录方法，该方法可用于评估大脑半球的偏侧化功能。研究发现，与野生型对照组小鼠相比，APP/PS1小鼠左右M2之间的同步化水平发生改变。...

通过小鼠次级运动皮层双侧局部场电位记录评估半球偏侧化

本方案描述了使用功能超声（fUS）对小鼠大脑中体积性脑血流动力学变化进行定量分析的方法。文中以麻醉状态和清醒状态的小鼠为例，提供了在感觉刺激后获得三维功能激活图以及静息态功能连接图的操作流程。...

利用经颅功能超声成像在小鼠中进行全脑三维激活与功能连接图谱绘制

该方案描述了在运动皮层（MC）进行细胞外记录的方法，以揭示自由活动的清醒小鼠的细胞外电生理特性，以及局部场电位（LFPs）和锋电位的数据分析方法，这对于评估与特定行为相关的神经网络活动具有重要意义。...

自由移动小鼠中的多通道胞外记录

提出一种低成本脑电图记录系统，并结合毫米级线圈，用于在活体小鼠大脑中进行经颅磁刺激。in...

低成本脑电图记录系统结合毫米级线圈用于活体小鼠脑部经颅刺激 体内

本方案描述了一种在固定头部的小鼠脑干中获取体内高密度单神经元记录的方法。该方法用于在全身麻醉前和麻醉期间，测量腹外侧导水管周围灰质（即快速眼动（REM）睡眠期间不活跃的脑干区域）神经元的动作电位发放。...

固定头部小鼠脑干的急性单细胞多电极记录

本方案旨在建立一种可靠且易于操作的系统，用于记录自由活动啮齿类动物的脑电图（EEG）。...

一种经济高效且微创的自由活动小鼠多部位慢性脑电图记录方案

学习在麻醉小鼠中放置颅外刺激电极并测量脑血流量与颅内电场的方法。该方案通过电刺激改善阿尔茨海默病模型小鼠的动态脑血流反应缺陷，为神经退行性疾病治疗提供新策略。

麻醉小鼠颅外刺激电极的放置及脑血流与颅内电场的测量

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