Name: 一种用于FACS分离的小鼠卫星细胞的CUT and RUN分析的有效方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习使用FACS分离小鼠卫星细胞并进行CUT&RUN分析的有效方案，研究雄激素受体在骨骼肌中的转录调控机制。该方法为肌肉相关疾病的治疗提供了重要的分子基础。

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感谢Anastasia Bannwarth提供的出色技术协助。感谢IGBMC动物房设施、细胞培养平台、小鼠临床研究所（ICS，法国伊尔基什）、影像学平台、电子显微镜平台、流式细胞术平台以及GenomEast平台，后者是“法国基因组” consortium（ANR-10-INBS-0009）的成员。
本研究由斯特拉斯堡大学、法国国家科学研究中心（CNRS）和法国国家健康与医学研究院（Inserm）联合开展的“跨学科主题研究所”（ITI）IMCBio项目（2021–2028年）支持，并获得IdEx Unistra（ANR-10-IDEX-0002）、SFRI-STRAT'US项目（ANR 20-SFRI-0012）以及EUR IMCBio（ANR-17-EURE-0023）的资助，上述项目均隶属于法国“未来投资计划”框架。额外资助来自INSERM、CNRS、斯特拉斯堡大学（Unistra）、IGBMC、法国国家科研署（ANR-16-CE11-0009，AR2GR）、AFM- Téléthon战略项目24376（资助对象：D.D.）、INSERM青年研究人员基金（资助对象：D.D.）、ANR-10-LABX-0030-INRT，以及由法国国家科研署（ANR）在“未来投资计划”框架下管理的法国国家资金（ANR-10-IDEX-0002-02）。J.R.获得法德大学（Université franco-allemande）与法国高等教育、研究和创新部联合资助的CDFA-07-22项目支持；K.G.获得IGBMC科研协会（Association pour la Recherche à l'IGBMC，ARI）的支持。

小鼠饲养于经认证的动物房中，符合国家动物护理指南（欧洲委员会指令86/609/CEE；法国法令第87-848号）关于实验动物用于科研的规定。所有计划的操作均已提交至伦理委员会（Com'Eth，法国斯特拉斯堡）及法国研究部（MESR），根据2010/63/EU指令，在APAFIS编号#22281下进行伦理评估并获得许可。
1. 通过荧光激活细胞分选（FACS）分离卫星细胞的细胞悬液制备（图1）
<ol>
	<li>肌肉组织的分离
	<ol>
		<li>使用清洁剂（表1）对用于肌肉解剖的工具（包括镊子、手术刀和剪刀）进行去污处理，并用蒸馏水彻底冲洗。</li>
		<li>准备两个2 mL离心管（表1），每管加入1 mL肌肉分离缓冲液，并置于冰上用于收集收获的肌肉组织。</li>
		<li>通过CO2窒息法处死两只10周龄的C57/Bl6J雄性小鼠，随后进行颈椎脱位。用70%乙醇喷洒每只小鼠全身。用镊子剥离后肢皮肤。解剖出股骨、胫骨和腓骨周围的所有四肢肌肉（每只小鼠约1 mg肌肉组织）。 
		注意：卫星细胞数量在15周龄后逐渐减少。</li>
		<li>将收获的四肢肌肉组织放入步骤1.1.2中准备的含1 mL肌肉分离缓冲液的2 mL离心管中。用相同方法收集第二只小鼠的肌肉组织。在冰上用剪刀将收获的肌肉剪碎，直至获得小于1 mm3的组织碎片。 
		注意：肌肉组织的收集与剪碎方法主要参照文献12所述。组织消化步骤可选择后续的1.2或1.3方法进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用胶原酶进行组织消化
	<ol>
		<li>将来自两只小鼠的剪碎肌肉悬液倒入一个50 mL离心管（表1）中，该管内含18 mL肌肉分离缓冲液（添加5 mL [5 U/mL] dispase和5 mg I型胶原酶）（表1）。</li>
		<li>紧密封闭离心管，并用实验室封口膜（表1）密封。将其水平置于摇床水浴装置（表1）中，在37 °C、100 rpm条件下振荡30分钟。</li>
		<li>30分钟后，加入5 mg I型胶原酶。继续在37 °C、100 rpm的摇床水浴中振荡30分钟。</li>
		<li>消化完成后，用10 mL移液器将肌肉悬液上下吹打10次以提高解离效率。在4 °C、400 × g条件下离心5分钟，可见管底形成清晰沉淀。用10 mL移液器弃去上清液，保留5 mL缓冲液于管中。 
		注意：保留部分缓冲液有助于避免细胞受到应激损伤&#160;。加入10 mL新鲜肌肉分离缓冲液，用10 mL移液器反复吹打重悬沉淀。</li>
		<li>将100 µm、70 µm和40 µm细胞筛（每种各一个）（表1）置于开口的50 mL离心管上。将悬液依次通过细胞筛（100 µm、70 µm、40 µm），收集滤过液至50 mL离心管中，所得细胞直径小于40 µm。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心5分钟。用10 mL移液器弃去上清液至剩余2 mL，再用0.2–1 mL移液器弃至剩余100–200 µL。用2 mL红细胞裂解缓冲液（表2）重悬沉淀，冰上孵育3分钟。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心5分钟，用20–200 µL移液器弃去上清液。用100 µL冷FACS缓冲液（表2）重悬细胞，置于冰上备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Liberase thermolysin低活性（TL）酶进行组织消化的替代方法
	<ol>
		<li>按照步骤1.1中的描述进行组织分离。</li>
		<li>对于Liberase介导的组织解离，使用Roswell Park Memorial Institute（RPMI）分离缓冲液（表2）收集肌肉组织，而非步骤1.1.2中所述的肌肉分离缓冲液。</li>
		<li>将来自两只小鼠的剪碎肌肉悬液倒入一个50 mL离心管（表1）中，该管内含18 mL RPMI分离缓冲液，并添加300或600 µL浓度为5 mg/mL的Liberase TL（表1），即终浓度分别为0.083 mg/mL和0.167 mg/mL13。</li>
		<li>紧密封闭离心管，并用实验室封口膜（表1）密封。将其水平置于摇床水浴装置（表1）中，在37 °C、100 rpm条件下振荡30分钟。</li>
		<li>消化完成后，用10 mL移液器将肌肉悬液上下吹打10次，以促进解离并提高解离效率。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心5分钟，可见管底形成清晰沉淀。用10 mL移液器弃去上清液，保留5 mL缓冲液于管中。保留缓冲液有助于避免细胞受到应激损伤&#160;。加入10 mL新鲜RPMI分离缓冲液，用10 mL移液器反复吹打重悬沉淀。</li>
		<li>将100 µm、70 µm和40 µm细胞筛（每种各一个）（表1）置于开口的50 mL离心管上。</li>
		<li>将悬液依次通过细胞筛（100 µm、70 µm、40 µm），收集滤过液至50 mL离心管中，所得细胞直径小于40 µm。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心5分钟。用10 mL移液器弃去上清液至剩余2 mL，再用0.2–1 mL移液器弃至剩余100–200 µL。</li>
		<li>用2 mL红细胞裂解缓冲液（表2）重悬沉淀，冰上孵育3分钟。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心5分钟，用20–200 µL移液器弃去上清液。</li>
		<li>用100 µL冷FACS缓冲液（表2）重悬细胞，置于冰上备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS分离用细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>取步骤1.2.12中获得的细胞悬液10 µL，转移至新的1.5 mL离心管中。该样本作为未染色对照或阴性对照（图2）。加入190 µL FACS缓冲液，转移至5 mL离心管（表1）中，置于冰上保存。</li>
		<li>将步骤1.2.12中剩余的90 µL细胞悬液在4 °C、400 × g条件下离心5分钟，用移液器（20–200 µL吸头）弃去上清液。用400 µL以无血清Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）稀释的可固定活力染料（表3）重悬细胞，在室温（RT）下孵育15分钟。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心5分钟洗涤细胞，加入100 µL FACS缓冲液。轻轻颠倒混匀管壁3次，再次在4 °C、400 × g条件下离心5分钟。</li>
		<li>在离心期间，准备100 µL主混合液，其中包含偶联荧光染料的初级抗体，靶向CD11b、CD31、CD45、&#160;TER119、CD34、ITGA7和CXCR4（表3），用FACS缓冲液稀释。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心5分钟，用移液器（20–200 µL吸头）弃去上清液，加入100 µL抗体混合液。轻轻颠倒混匀3次，禁止涡旋震荡。避光冰上孵育30分钟。</li>
		<li>在4 °C、400 × g条件下离心5分钟。用20–200 µL移液器弃去上清液，加入500 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。轻轻颠倒混匀3次。再次在4 °C、400 × g条件下离心5分钟，用20–200 µL移液器弃去上清液。</li>
		<li>用500 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并将悬液转移至5 mL离心管中。 
		注意：经Liberase消化获得的细胞悬液以相同方式处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过FACS筛选卫星细胞
	<ol>
		<li>短暂涡旋细胞悬液（2–5秒），并将细胞上样至配备100 µm喷嘴的流式细胞仪（表1）进行分析。</li>
		<li>根据步骤1.4.1中保存的未染色样本设定各门控参数（图2）。</li>
		<li>用1 mL纯胎牛血清（FCS）预包被5 mL离心管以提高细胞回收率，并加入500 µL FACS缓冲液。</li>
		<li>将未染色样本更换为抗体标记的&#160;样本。</li>
		<li>根据前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）（图3A）确定目标细胞群，并利用FSC-A与前向散射高度（FSC-H）排除双联体细胞（图3B）14。</li>
		<li>通过可固定活力染料阴性染色识别活细胞（图3C）。</li>
		<li>选择CD31、CD45、TER119和CD11b阴性细胞（图3D）。</li>
		<li>为鉴定卫星细胞，首先选择CD34和ITGA7阳性细胞（图3E），然后在CD34和ITGA7阳性细胞群中进一步选择CXCR4阳性细胞（图3F）。</li>
		<li>将目标细胞（根据制备质量，通常为40,000至80,000个细胞）收集至含有500 µL FACS缓冲液的预包被5 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织培养中分离群体的验证
<ol>
	<li>使用水凝胶包被载玻片
	<ol>
		<li>将280 µL纯化的水凝胶人胚胎干细胞（hESC）合格基质（表1）溶于12 mL无血清DMEM/F12培养基中。</li>
		<li>用上述水凝胶溶液包被腔室载玻片（表1），并在4 °C孵育过夜。</li>
		<li>次日，在接种细胞前，将腔室载玻片于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞生长与分化
	<ol>
		<li>将步骤1.5.9中获得的约20,000个细胞接种至每个孔中，在生长培养基（表2）中培养5天。使用明场显微镜拍摄相差图像（图4A），然后进行免疫荧光分析以确保制备质量（图4B）。</li>
		<li>为诱导成肌分化，将步骤2.2.1中扩增的卫星细胞在成肌培养基（表2）中继续培养额外7天。在进行免疫荧光分析前，使用明场显微镜拍摄相差图像（图4C），以确保制备质量（图4D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫细胞荧光分析
	<ol>
		<li>轻柔吸去培养基，用100 µL 1× PBS洗涤腔室载玻片上的细胞两次，然后在室温下用100 µL 4%多聚甲醛（PFA）固定1小时。 
		注意：此步骤应小心操作。腔室内应始终保留少量液体以避免细胞受到应激，PBS应沿腔室壁缓慢加入。</li>
		<li>用含0.1% Tween 20的100 µL 1× PBS（PBST）洗涤细胞三次，以通透细胞膜。</li>
		<li>在含5% FCS的100 µL 1× PBST（PBST-FCS）中室温孵育1小时，以封闭非特异性信号。</li>
		<li>加入100 µL主混合液（含抗PAX7和抗dystrophin（DMD）抗体，用1× PBST-FCS稀释），在4 °C孵育过夜，分别用于检测卫星细胞和肌纤维。</li>
		<li>用100 µL 1× PBST洗涤细胞三次，然后加入100 µL用1× PBST-FCS稀释的山羊抗小鼠Cy3或山羊抗兔Alexa 488二抗（表3），室温孵育1小时。</li>
		<li>使用供应商提供的工具将腔室从载玻片上分离，加入20 µL含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的水性封片剂，并用盖玻片覆盖载玻片（表1）。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜观察并采集染色细胞的图像。</li>
		<li>使用图像分析软件处理图像（图4B、D）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. CUT&amp;RUN 分析
<ol>
	<li>通过流式细胞术分离的卫星细胞进行 CUT&amp;RUN 分析的样品制备 
	注意：CUT&amp;RUN 实验基本按照文献10,15所述方法进行。缓冲液组成见表2。
	<ol>
		<li>对于 CUT&amp;RUN 检测，每个待测样品/抗体使用方法1中第1.5.9步获得的大约40,000个细胞。</li>
		<li>在室温下以500 × g 离心FACS分离的卫星细胞10分钟，然后用移液器（20–200 µL吸头）弃去上清液。</li>
		<li>用1 mL 1× PBS洗涤细胞，在室温下以500 × g 离心5分钟，用移液器（0.2–1 mL吸头）弃去上清液，将细胞重悬于1 mL冷核提取缓冲液中（表2），并在冰上孵育20分钟。</li>
		<li>在孵育期间，准备一个含有850 µL冷结合缓冲液的1.5 mL离心管（表2），并为每个样品加入20 µL刀豆球蛋白A包被的磁珠（表1）。</li>
		<li>使用磁力架用1 mL冷结合缓冲液洗涤磁珠两次（表1）。在整个实验过程中，每次洗涤或更换缓冲液时，将离心管置于磁力架上使磁珠吸附至管壁一侧，静置5分钟，然后用移液器（0.2–1 mL吸头）移除澄清的上清液。随后，将磁珠轻柔地重悬于300 µL冷结合缓冲液中。</li>
		<li>在4 °C下以600 × g 离心细胞核5分钟，轻柔地将其重悬于600 µL核提取缓冲液中。将600 µL提取的细胞核与300 µL刀豆球蛋白A磁珠悬液轻轻混合，并在4 °C下孵育10分钟。</li>
		<li>如步骤3.1.4所述，使用磁力架去除上清液，并将与磁珠结合的细胞核轻柔地重悬于1 mL冷封闭缓冲液中（表2），在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>使用磁力架去除上清液，并用1 mL冷洗涤缓冲液（表2）洗涤与磁珠结合的细胞核两次。在第二次洗涤时，将与磁珠结合的细胞核均等地分装至多个1.5 mL离心管中，每个离心管将在下一步中加入特定抗体。 
		注意：在此示例中，将250 µL与磁珠结合的细胞核分装至四个1.5 mL离心管中。</li>
		<li>如步骤3.1.4所述，使用磁力架分离上清液并用移液器吸除。将细胞核/磁珠复合物轻柔地重悬于特定的一抗（表3）或另一种物种的IgG（此处为兔IgG）中，抗体用250 µL冷洗涤缓冲液稀释。在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。 
		注意：此处使用的抗体靶向AR、H3K4me2和H3K27ac。</li>
		<li>如步骤3.1.4所述，使用磁力架去除上清液，用1 mL冷洗涤缓冲液洗涤与磁珠结合的细胞核两次，最后重悬于100 µL冷洗涤缓冲液中。</li>
		<li>将蛋白A-微球菌核酸酶按每份样品100 µL冷洗涤缓冲液中1.4 ng/µL的浓度稀释。</li>
		<li>将100 µL蛋白A-微球菌核酸酶加入步骤3.1.11获得的100 µL样品中，在4 °C下振荡孵育1小时。</li>
		<li>如步骤3.1.4所述，使用磁力架去除上清液，用1 mL冷洗涤缓冲液洗涤两次，最后将与磁珠结合的细胞核重悬于150 µL冷洗涤缓冲液中。</li>
		<li>为启动DNA切割，向150 µL样品中加入3 µL 100 mM CaCl2，快速轻弹混匀，并在冰上孵育30分钟。加入150 µL终止缓冲液终止反应，并在37 °C下孵育20分钟以消化RNA并释放DNA片段。</li>
		<li>进行DNA提取时，在4 °C下以16,000 × g 离心样品5分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新的微量离心管中，弃去沉淀和磁珠。</li>
		<li>加入3 µL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）和2.5 µL 20 mg/mL蛋白酶K，通过倒置混匀，在70 °C孵育10分钟（不振荡）。</li>
		<li>加入300 µL酚/氯仿/异戊醇混合液，涡旋振荡，转移至2 mL相分离管（预先在16,000 × g 下离心5分钟），在4 °C下以16,000 × g 离心5分钟。</li>
		<li>向同一离心管中加入300 µL氯仿，在4 °C下以16,000 × g 离心5分钟。用移液器（0.2–1 mL吸头）收集上清液（约300 µL），转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>加入1 µL甘油（浓度为20 mg/mL）。</li>
		<li>加入750 µL 100%乙醇，在-20 °C下沉淀过夜。</li>
		<li>在4 °C下以16,000 × g 离心15分钟沉淀DNA。用1 mL 100%乙醇洗涤沉淀，在16,000 × g 下离心5分钟，弃去上清液，再在16,000 × g 下离心30秒，用移液器（20–200 µL吸头）吸除残留液体。</li>
		<li>将沉淀在空气中干燥约5分钟，重悬于25 µL 1 mM Tris-HCl（pH 8）和0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA；pH 8）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物信息学分析
	<ol>
		<li>利用基因组平台，从免疫切割的DNA制备文库，并按照文献16所述方法进行双端100 bp测序。</li>
		<li>去除与ENCODE黑名单区域（V2）重叠的reads，并将剩余reads分为两组：片段大小&#60;120 bp（通常无核小体，适用于转录因子）和片段大小&#62;150 bp（含核小体，通常适用于组蛋白修饰）。使用Bowtie 2（v2.3.4.3）17比对至mm10参考基因组。</li>
		<li>使用bamCoverage（deeptools 3.3.0：bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20）生成bigwig文件。</li>
		<li>保留唯一比对的reads用于后续分析。</li>
		<li>使用genomeCoverageBed（bedtools v2.26.0）生成原始bedgraph文件。</li>
		<li>使用SEACR 1.3算法（严格选项）进行峰识别。将目标数据的bedgraph文件（以UCSC bedgraph格式，排除信号为零的区域）和对照（IgG）数据的bedgraph文件导入，以生成峰识别的经验阈值18。</li>
		<li>使用deeptools进行Pearson相关性分析，以确定样本间的相似性19。使用命令行multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz，随后运行plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle &#34;Pearson Correlation of Read Counts&#34; --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab。</li>
		<li>使用IGV20结合bedgraph文件和SEACR获得的bed峰文件，可视化全基因组强度谱图。</li>
		<li>使用HOMER进行峰注释和基序搜索21。</li>
		<li>最后，将数据集与已发表的数据通过ChIP-Atlas Peak浏览器进行比较，以在IGV中可视化，和/或使用SEACR生成的bed文件作为输入数据集进行富集分析22。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Satellite Cell Isolation from Mouse Limb Muscles and Flow Cytometry Analysis

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<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Schultz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+satellite+cell+population+in+postnatal+mouse+lumbrical+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle.</a> The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).</li>
<li>Hyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+pancreatic+digestion+with+liberase+versus+collagenase+on+the+yield%2C+function+and+viability+of+neonatal+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets.</a> Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本研究报道了一种标准化、可靠且易于操作的小鼠卫星细胞分离与培养方法，以及利用CUT&RUN方法评估转录调控的实验方案。
本方案包含多个关键步骤。首先是肌肉组织的破碎和肌纤维的消化，以确保获得大量细胞。尽管酶浓度有所增加，但获得的活细胞数量仍多于使用方案1时的结果。卫星细胞表达一系列特定的膜蛋白。为了提高分选的严谨性，我们联合使用了先前报道的阴性（CD31、TER119、CD45和CD11b）和阳性（CD34、ITGA7和CXCR4）卫星细胞标志物30,31。采用该策略，平均可获得约1%的活体候选卫星细胞。该结果处于预期范围内，因为在成年小鼠中，卫星细胞约占肌肉细胞群体的2%–7%32。作为卫星细胞分选标志物的对照，我们分离了CD34+/ITGA7-/CXCR4-细胞。免疫荧光染色显示，CD34+/ITGA7-/CXCR4-细胞不表达PAX7，而70%的CD34+/ITGA7+/CXCR4+分选细胞对该卫星细胞特异性标志...

骨骼横纹肌平均占人体总重量的40%1。肌纤维在受到损伤后表现出显著的再生能力，这一过程表现为新形成的成肌细胞融合并生成新的肌纤维，以替代受损的肌纤维2。1961年，Alexander Mauro 报道了一类单核细胞群体，并将其命名为卫星细胞3。这些干细胞表达配对盒转录因子7（PAX7），位于肌纤维的基底膜与肌膜之间4。据报道，它们还表达分化簇34（CD34；一种造血、内皮祖细胞和间充质干细胞标志物）、整合素α7（ITGA7；一种平滑肌、心肌和骨骼肌标志物）以及C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4；一种淋巴细胞、造血细胞和卫星细胞标志物）5。在基础状态下，卫星细胞存在于特定的微环境中，使其保持静息状态6。当肌肉受损时，它们被激活，开始增殖并进行成肌分化7。然而，由于卫星细胞仅占肌肉细胞总数的一小部分，其全基因组分析尤为困难，尤其是在生理条件下（&#60;总细胞数的1%）。
已有多种用于从卫星细胞中分离染色质的方法被报道，这些方法包括染色质免疫沉淀联合大规模并行测序（ChIP-seq）或靶点切割与标签化（CUT&amp;#38;Tag）实验。然而，这两种技术仍存在一些尚未解决的重要局限性。事实上，ChIP-seq 需要大量的起始材料以获得足够的染色质，其中很大一部分在超声处理步骤中会丢失。CUT&amp;#38;Tag 更适用于细胞数量较少的情况，但由于 Tn5 转座酶的活性，其产生的非特异性切割位点多于 ChIP-seq。此外，由于该酶对开放染色质区域具有高亲和力，CUT&amp;#38;Tag 方法可能更适用于分析与基因组活跃转录区域相关的组蛋白修饰或转录因子，而非沉默的异染色质8,9。
本文介绍了一种详细的实验方案，可通过荧光激活细胞分选（FACS）分离小鼠肢体肌肉的卫星细胞，用于靶位切割并经核酸酶释放（CUT&amp;#38;RUN）10,11 分析。该方法包括组织机械性解离、细胞分选以及细胞核分离等多个步骤。通过针对共价组蛋白修饰和转录因子开展CUT&amp;#38;RUN分析，验证了该方法在制备具有活性的单细胞悬液方面的高效性。所获得细胞的质量优良，使本方法在制备能够真实反映基因组天然占据状态的染色质时具有显著优势，且有望适用于结合高通量测序技术，在特定位点（4C-seq）或全基因组水平（Hi-C）上捕获染色体构象。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 离心管</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>抗 AR 抗体</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD11b 抗体</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD31 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD34 抗体</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD45 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>抗 CXCR4 抗体</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>抗 DMD 抗体</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>抗 H3K27ac 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>抗 H3K4me2 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>抗 ITGA7 抗体</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>抗 PAX7 抗体</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>抗 TER119 抗体</td><td>BD Pharmingen &lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>磁珠</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&amp;reg;Plus 刀豆蛋白 A</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning&amp;reg;&amp;nbsp;</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning&amp;reg;&amp;nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning&amp;reg;&amp;nbsp;</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>离心机 1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Centrifuge 5415 R</td></tr><tr><td>离心机 2</td><td>Eppendorf</td><td>5805000010</td><td>Centrifuge 5804 R</td></tr><tr><td>腔室载玻片系统&amp;nbsp;</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>Syst&amp;egrave;me Nunc&amp;trade; Lab-Tek&amp;trade; 腔室载玻片</td></tr><tr><td>清洁剂</td><td>Sigma&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>胶原酶 I 型&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>中性蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;-2 磁铁</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活力染料</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD FACSAria&amp;trade; Fusion 流式细胞仪</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Fluoromount G 封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>基因组浏览器&amp;nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr><tr><td>甘油&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>水凝胶</td><td>Corning&amp;reg;&amp;nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC 认证基质</td></tr><tr><td>图像处理软件</td><td>Image J&amp;reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>实验室封口膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&amp;reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>没食子酸丙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>测序仪&amp;nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>摇床水浴箱</td><td>Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

一种高效的小鼠卫星细胞cut&run分析方案（经facs分离）

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

基因组范围分析在细胞数量较少的群体中面临重大限制，这在干细胞研究领域尤为突出。本文介绍了一种高效利用荧光激活细胞分选（FACS）技术从小鼠肢体肌肉组织中分离卫星细胞的实验方案，该组织富含结构蛋白。成年小鼠的肢体肌肉经解剖后，在添加了dispase和I型胶原酶的培养基中通过机械剪切进行破碎处理。消化完成后，&#160;将匀浆液通过细胞滤网过滤，细胞重悬于FACS缓冲液中。使用可固定活力染料测定细胞活力，并通过FACS分离免疫染色的卫星细胞。细胞用Triton X-100裂解，释放的细胞核与刀豆球蛋白A磁珠结合。细胞核/磁珠复合物与针对目标转录因子或组蛋白修饰的抗体孵育。洗涤后，细胞核/磁珠复合物与蛋白A-微球菌核酸酶孵育，并加入CaCl₂启动染色质切割。2DNA提取后，构建文库并进行测序，通过生物信息学分析获得全基因组范围内转录因子结合及共价组蛋白修饰的图谱。不同组蛋白标记所获得的峰信号显示，这些结合事件特异性地发生在卫星细胞中。此外，已知基序分析揭示该转录因子与染色质发生结合。 通过 其对应的反应元件。因此，本方案适用于研究成年小鼠肢体肌肉卫星细胞中的基因调控。

通过结合Gunther等人的方案（以下称为方案1）12 和Liu等人的方案23（以下称为方案2），从小鼠骨骼肌中分离出卫星细胞。在使用方案1中推荐的胶原酶和分散酶浓度进行消化后，观察到存在未完全消化的肌纤维，因此按照步骤1.2.1和1.2.3所述，增加了酶的用量以改善肌纤维的解离效果。根据方案2的建议，将样品置于水浴中进行轻柔振荡，以维持细胞活力。我们按照方案1所述，使用细胞筛网进行过滤，并用红细胞裂解缓冲液进行孵育（见步骤1.2.7至1.2.10）。在方案1中，细胞被加载到30%/70%的Percoll密度梯度中，以分离位于界面处的单核细胞，但该步骤可能导致目标细胞的丢失。因此，参照方案2的建议，省略了此步骤。
通过FSC-A与SSC-A设门来根据细胞大小（FSC）和颗粒度（SSC）鉴定单核细胞（图3A）。通过排除FSC-A轴上低于40 K的事件去除碎片，共选出38.8% ± 3.6%的细胞。使用FSC-A与前向散射高度（FS...

本文介绍了一种高效的荧光激活细胞分选（FACS）方案，用于分离小鼠肢体肌肉卫星细胞，适用于通过靶点切割和核酸酶释放技术（CUT&amp;RUN）研究肌纤维中转录调控。

一种高效的小鼠卫星细胞CUT&RUN分析方案（经FACS分离）

小规模细胞群体的全基因组分析是当前研究中的主要限制因素，尤其在干细胞领域。本研究描述了一种高效的……

二十多年来，我们的实验室一直致力于研究核受体的病理生理学作用。为了阐明其在体内的功能，我们构建了可实现核受体表达时空特异性调控的小鼠模型。同时，我们开发了前沿技术，用于研究核受体在小鼠组织中的分子功能。我们的科研兴趣最近引导我们研究了包括骨骼肌在内的多种组织中secosteroid和类固醇受体的信号传导。我们近期已证实，存在于骨骼肌肌纤维中并介导细胞分化的雄激素受体，在其收缩功能和代谢功能中起着关键作用。我们最近的研究结果加深了对骨骼肌病理生理动态的理解，这对于开发针对肌肉相关疾病的有效治疗方案至关重要。我们开发了该方案，以便能够在体内对肌肉干细胞进行顺式调控元件组分析。以往所有方案均使用体外模型，这完全脱离了完整生物体的背景。该方案不仅成本低且省时高效，还为研究骨骼肌前体细胞中转录因子的招募及染色质景观提供了有效的实验体系。通过本方案制备的染色质实现了对卫星细胞中雄激素受体顺式作用组（AR cistrome）的首次全基因组分析，将有助于未来开展基因调控相关研究。在众多研究方向中，我们未来的目标之一是将此类研究扩展至其他氧代类固醇受体，并探索其在骨骼肌再生过程中所涉及的不同细胞类型中的特异性共调节因子。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

一种用于FACS分离的小鼠卫星细胞的CUT&amp;RUN分析的有效方案

分离和培养静息状态的卫星细胞（一种肌肉干细胞群体）的纯细胞群体，对于理解肌肉干细胞生物学与再生机制，以及用于杜氏肌营养不良症和其他退行性疾病的干细胞移植治疗至关重要。...

肌肉卫星细胞的分离、培养与移植

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in...

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本文介绍的方法总结了利用细胞外通量分析仪实时测定非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），以评估其细胞生物能量学的优化实验方案。...

利用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞及原始祖细胞的细胞生物能量代谢

CUT&amp;#38;RUN 及其变体可用于确定蛋白质在染色质上的占据情况。本实验方案描述了如何利用单细胞 uliCUT&amp;#38;RUN...

使用超低输入量靶向切割与核酸酶释放技术进行染色质上单细胞因子定位

准确鉴定纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌肉干细胞（MuSCs）对于研究其在生理和病理条件下的生物学功能至关重要。本方案提供了从成年小鼠肌肉中分离、纯化和培养FAPs与MuSCs的操作指南。...

FACS分离与培养未受干扰及损伤后小鼠骨骼肌中的纤维脂肪生成祖细胞和肌肉干细胞

对于表观遗传学领域的新手研究人员而言，CUT&amp;Tag 是比 ChIP 检测显著更简便的替代方法。CUT&amp;Tag 极大地推动了对稀有细胞和原代细胞群体的表观遗传学研究，仅需极少量细胞即可生成高质量数据。本方案描述了对从小鼠后肢肌肉中分离的小鼠成肌细胞进行 H3K4me1 CUT&amp;Tag...

利用靶点切割与标签化（CUT&Tag）技术在小鼠成肌细胞研究中的应用

本方案描述了一种用于定量HEK-293T细胞中非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）效率的染色体外非同源末端连接（NHEJ）检测方法和同源重组（HR）检测方法。...

利用基于GFP的报告系统分析HEK-293T细胞中非同源末端连接和同源重组效率

为获得满足单细胞RNA测序（scRNA-seq）要求的小鼠脑皮层周细胞，我们提出了一种基于CD13⁺/CD31⁻筛选的 critically...

使用FACS从鼠脑皮层组织中分离周细胞用于单细胞测序

本方案通过组织解离、连续过滤、预贴壁及特定培养条件，提供了一种从成年和新生小鼠骨骼肌中分离和富集原代成肌细胞的标准化方法，可用于建立和维持由卫星细胞衍生的成肌细胞培养体系，以支持后续实验应用。...

分离骨骼肌卫星细胞以 体外 肌生成研究

学习使用FACS分离小鼠卫星细胞并进行CUT&RUN分析的有效方案，研究雄激素受体在骨骼肌中的转录调控机制。该方法为肌肉相关疾病的治疗提供了重要的分子基础。

一种高效的小鼠卫星细胞CUT&RUN分析方案（经FACS分离）

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