利用哺乳动物锌转运蛋白的表征 体外 锌转运实验

我的研究重点是哺乳动物锌转运蛋白的结构与功能关系，特别关注其调控机制。由于锌离子对细胞功能具有重要意义，准确测量细胞内锌动态变化具有挑战性。我们的实验方案解决了锌动态变化检测中信噪比低和时间分辨率不足的问题。

该方法能够以高时间分辨率检测锌离子跨细胞膜的内流，同时显著减少其他二价阳离子带来的背景噪声和交叉相互作用。我们发现，哺乳动物锌转运蛋白ZnT-1的C端结构域中的无序延伸区域不参与锌转运功能。这使得研究人员可以专注于ZnT-1蛋白的其他结构域，以研究其对锌转运的调控作用。

首先使用倒置荧光显微镜观察转染后的 HEK293T 细胞。待细胞对焦后，切换至明场照明，然后使用 mCherry 的激发波长 587 纳米和发射波长 610 纳米进行荧光观察。关闭明场光源后，检查细胞的荧光信号，以确认 ZnT-1 mCherry 的表达。

配制染料加载溶液时，取4微升锌特异性荧光染料溶液，加入4微升10% Pluronic酸溶液，用移液器吹打混匀后转移至1.5毫升离心管中。

向已制备的溶液中加入 750 微升洗涤液，剧烈涡旋振荡试管。再次加入 750 微升洗涤液。涡旋振荡后，取 750 微升该溶液加入新的六孔培养板的两个孔中，并用铝箔覆盖。

用镊子将先前培养的 HEK293T 细胞板中的 13 毫米盖玻片转移至六孔板中。用铝箔覆盖板后，轻轻振荡 15 至 20 分钟，然后用配制好的洗涤液替换染料加载液。盖好板后，再次振荡 20 分钟。

首先，打开显微镜、光源、相机和抽吸系统。清洗灌流系统时，第一个腔室使用林格氏液，第二个腔室使用添加了吡啶硫酮的含锌林格氏液。关闭旋塞后，用相同的溶液填充各腔室。

开始样品制备时，将灌流 chamber 放置，使槽的窄边朝上，并在槽周围涂抹一圈硅脂。然后用精细镊子将一块 13 毫米盖玻片从洗涤液中转移至槽上方，细胞面朝下。将一块 22 毫米盖玻片置于 13 毫米盖玻片之上，并用镊子轻轻压紧，注意避免压裂盖玻片。

翻转腔室并按压以释放液体。然后向槽内加入100微升林格氏洗涤液，再次按压，确保无泄漏。

将灌流室安装并固定在平台上，然后连接灌流和吸引管，以便对沟槽中的细胞进行灌流。将灌流速度调节至约2 mL/min，并开启任氏液灌流。

进行测量时，打开成像软件。使用显微镜左侧按钮将显微镜放大倍数设置为10X。选择实时成像后，使用操纵杆移动载物台，并对准凹槽中的细胞进行聚焦。

选择 mCherry 的合适波长。细胞聚焦后，移动载物台以选择合适的细胞区域。选择“绘制感兴趣区域（Draw ROIs）”下拉菜单。

选择绘制圆形 ROI，并在表达 mCherry 的细胞簇上绘制 ROI。通过按住 Shift 键，然后点击并拖动已有的 ROI，可在第一个 ROI 之外创建新的 ROI。

从下拉菜单中选择“绘制方形背景感兴趣区域（ROI）”，并调整背景感兴趣区域的位置和大小，确保该区域内无细胞存在。确认背景感兴趣区域内无细胞后，转到 ND 采集选项卡，选择“波长”子选项卡，并勾选其复选框。

确保勾选 GFP 波长的复选框。点击时间子选项卡，将测量间隔设置为每 5 秒一次，持续时间为 30 分钟。在显微镜控制面板上，按下“开启”按钮以启用完美聚焦系统（PFS）。

在ND采集条件下，确保勾选PFS On。调节焦距后点击立即运行。使用林格氏液灌注，开始90秒的基线期测量。

90秒后，将灌流液从林格氏液切换为含锌林格氏液，并点击主界面面板右下角的红色标记。一旦荧光上升开始趋于饱和，立即切换回林格氏液灌流，直至实验时间结束。

要导出经过基线校正的数据，请按下背景校正按钮，并在ND采集窗口中查看变化。点击导出按钮，将数据保存至指定位置。荧光增强表明细胞内锌浓度升高，而荧光减弱则提示ZnT-1将锌转运通过细胞膜的活性。

与突变体相比，野生型ZnT-1在细胞对锌负荷的反应变异性方面表现出更平滑的荧光曲线。比较野生型与Delta-USCTD活性的箱线图显示，两者的平均转运速率相似，表明野生型与突变体之间无显著差异。然而，分布范围上的差异可能提示存在功能上的差别。