Name: 使用 体外 锌转运测定表征哺乳动物锌转运蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 了解哺乳动物锌转运蛋白的体外锌转运测定方法，使用HEK293T细胞和荧光显微镜实时监测锌离子动态。该方法具有高时间分辨率和低背景噪声，可准确分析ZnT-1转运功能及其调控机制。

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Raz Zarivach 由以色列科学基金会（资助号：163/22）支持。Tomer Eli Ben Yosef 和 Arie Moran 由以色列科学基金会（资助号：2047/20）支持。我们感谢本-古里安大学的 Daniel Gitler 及其研究团队的合作、支持与专业指导。

1. 细胞转染
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞（参见 材料表在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中2 直至在10 cm培养皿中达到汇合（8.8 × 10⁵）6 总细胞数）。</li>
	<li>在12孔板的每个孔中放入一个13 mm盖玻片。将0.44 x 106 将步骤1.1中胰蛋白酶消化的细胞加入12 mL完全DMEM培养基中，用移液器轻轻吹打3至5次以充分混匀。每孔加入1 mL混悬液。置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中培养。2 过夜。</li>
	<li>将每个孔中的完全 DMEM 替换为 1 mL 无血清 DMEM（参见 材料表每个孔中加入） 。将12孔板放回加湿培养箱中，步骤同1.1。</li>
	<li>每个转染孔中，将含有目的蛋白并标记有mCherry荧光蛋白的pAAV2质粒1 µg进行稀释（补充文件 1在1.5 mL离心管中，将溶于100 µL无血清DMEM的溶液混合。</li>
	<li>加入3 µg聚乙烯亚胺（PEI，参见 材料表) 加入到每次转染的100 µL无血清DMEM中，每次转染使用不同的1.5 mL离心管。质粒与PEI的质量比应为1:3（µg:µg）。</li>
	<li>将步骤1.4中的两个试管均进行涡旋振荡&#160;以及步骤1.5&#160;静置10秒，然后在室温下静置至少5分钟。</li>
	<li>将步骤1.4中制备的DNA溶液（每孔100 µL）与步骤1.5中制备的PEI溶液（每孔100 µL）等体积混合。涡旋振荡终溶液10秒，室温静置至少20分钟，最长可至6小时。</li>
	<li>从培养箱中取出12孔板。将步骤1.7中的终溶液涡旋混匀，然后向步骤1.3中的12孔板各孔中加入200 µL。将12孔板放回湿化培养箱中（步骤1.1）。</li>
	<li>孵育3小时后，将每孔中的培养基更换为1 mL完全DMEM。将12孔板放回加湿培养箱中，步骤同1.1。</li>
	<li>2天后，从37 °C/5% CO₂培养箱中取出转染后的细胞培养物2 孵育箱，并将其置于倒置荧光显微镜下，使用10倍物镜进行观察。</li>
	<li>使用显微镜调焦旋钮，在明场光下对细胞进行调焦。</li>
	<li>切换至荧光 mCherry 的激发波长（587 nm）和发射波长（610 nm），并关闭明场光源。观察细胞荧光以确认 ZnT1-mCherry 的表达。</li>
	<li>配制染料加载溶液。
	<ol>
		<li>取4 µL锌离子特异性荧光染料（参见 材料表) 以其乙酰甲氧基甲酯（AM 酯）形式提供，溶于 DMSO（1 µg/µL），来自避光保存于 −20 °C 冰箱中的储备液。该形式可使染料通过简单扩散穿过质膜进入细胞。</li>
		<li>加入4 µL 10%的普鲁尼克酸（或2 µL 20%的普鲁尼克酸，参见 材料表将8 µL的溶液加入到步骤1.13.1中的等分试样中。用移液器上下吹打混合3次，充分混匀后，将全部8 µL溶液转移至一个1.5 mL离心管中。</li>
		<li>加入750 µL林格氏液（自行配制，参见 材料表 向步骤1.13.2中的试管中加入750 µL裂解缓冲液（含1 mg/mL（约0.1%）牛血清白蛋白），剧烈涡旋振荡。再加入750 µL相同溶液，再次涡旋振荡以确保充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入750 µL步骤1.13.3所得的终溶液&#160;加入新培养板的两个孔中，用铝箔覆盖。 
	注意：为避免褪色，从这一步开始，6孔板始终用铝箔覆盖。</li>
	<li>使用精细镊子，从转染后的细胞培养板中取出最多四张重复的盖玻片，放入步骤1.14中准备的新6孔板的第一个加样孔中（每孔最多四张盖玻片）。对第二个加样孔重复此操作。 
	注意：同一注满液体的孔中的所有盖玻片必须来自相同条件。但不同孔之间可包含不同条件。</li>
	<li>用铝箔覆盖，轻轻振荡15-20分钟。</li>
	<li>移除染料加载溶液，并替换为新的含白蛋白的任氏液（Ringer's plus albumin）洗涤溶液，其成分同前文所述。&#160;步骤1.13.3. 用铝箔覆盖，再次震荡20分钟。此步骤可使细胞内酯酶裂解AM酯。</li>
</ol>
2. 显微镜准备
<ol>
	<li>准备好所需的工具（参见材料表）：一台能够检测GFP和mCherry荧光团的倒置荧光显微镜、一个可切换至少两种溶液的灌流系统、一个吸引系统以及一个灌流腔室。</li>
	<li>打开显微镜、光源和相机。同时打开吸引系统。</li>
	<li>清洗灌流系统。用Ringer溶液清洗第一个腔室，用含有7 µM锌溶液并补充7 µM吡啶硫酮（锌离子载体，参见材料表）的Ringer溶液清洗第二个腔室。为避免产生气泡或空隙，请在每个腔室内保留少量液体。 
	注意：由于两个容器通过同一根管道连接至灌流腔室，务必确保共用管段始终用Ringer溶液清洗。</li>
	<li>关闭阀门，并按照步骤2.3中的方法，将相应的腔室分别装入Ringer溶液和含锌Ringer溶液。</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
	<li>取灌流室，将其放置，使槽的窄边朝上。 
	注意：槽是灌流室中央的一个孔洞，用于使灌流液接触细胞。槽的一侧较窄，另一侧较宽。</li>
	<li>在槽周围涂抹密封硅胶（见材料表）。使用移液器吸头将槽内的密封硅胶清理干净。 
	注意：确保槽周围有足够的硅胶密封，以密封22 mm盖玻片。</li>
	<li>使用精细镊子从洗涤液中取出一张盖玻片，将其细胞面朝下放置在槽的上方。这样，在实验过程中细胞将暴露于灌流槽的溶液中。</li>
	<li>将一张22 mm盖玻片置于13 mm盖玻片之上，并用镊子夹紧。注意不要压裂盖玻片。</li>
	<li>翻转灌流室，按压以排出所有残留液体。向槽内加入100 µL林格氏洗涤液，再次按压以确保无泄漏。 
	注意：若发现泄漏，应在泄漏部位补涂密封剂并重新测试。</li>
	<li>将灌流室安装至载物台并固定。放置灌流管和吸引管，使灌流液能够流经槽内的细胞。</li>
	<li>调节灌流速度至约2 mL/min，开启林格氏溶液的灌流。确保灌流系统正常运行，无泄漏或溢出。</li>
</ol>
4. 测量准备
<ol>
	<li>通过双击图标打开成像软件（参见材料表）。使用相应的凭据登录，选择连接的相机，然后点击确定。</li>
	<li>使用显微镜左侧的按钮将显微镜放大倍数设置为10倍。</li>
	<li>选择实时预览模式，并使用操纵杆移动载物台，使沟槽中的细胞聚焦。</li>
	<li>在灌注开启状态下，关闭灯光，并通过按下界面中的专用按钮将波长切换至mCherry。使用显微镜的调焦旋钮调整焦距。</li>
	<li>当显微镜对准细胞后，使用操纵杆移动载物台，以便选择合适的细胞区域。 
	注意：合适的区域是指至少包含10个细胞的感兴趣区域（ROI），以及一个无细胞的空白区域用于背景校正。</li>
	<li>选择开启/关闭&#160;ROI下拉菜单，然后选择绘制圆形ROI。</li>
	<li>对表达mCherry的细胞簇（表示ZnT1表达）绘制感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>从与步骤4.6相同的工具栏中，点击开启/关闭背景ROI按钮，并将背景ROI的位置和大小调整至完全无细胞的区域。
	<ol>
		<li>使用mCherry和EGFP波长进行检查，确保所选的背景ROI区域内无任何细胞。 
		注意：波长已设置为mCherry激发波长520 nm、发射波长610 nm；EGFP激发波长470 nm、发射波长520 nm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择波长（λ）子选项卡，勾选其复选框，并确认GFP波长已存在且已被选中。若未包含，请添加并勾选。</li>
	<li>选择持续时间子选项卡。将测量间隔定义为每5秒一次，并根据实验持续时间调整间隔次数。</li>
	<li>在目镜下方的显微镜面板的调焦部分，点击开启按钮以启用完美调焦系统（PFS）。</li>
	<li>使用PFS调焦旋钮调整焦距。在软件界面的ND采集下，确保已勾选PFS开启。</li>
	<li>点击立即运行。</li>
</ol>
5. 实验步骤
<ol>
	<li>使用林格氏液灌注，开始90秒的基础期测量。</li>
	<li>基础期结束后，关闭林格氏液灌注，然后开启含锌林格氏液灌注。通过点击主界面面板右下角的红色标记来记录溶液切换时间点。此时应观察到荧光信号上升。</li>
	<li>当荧光上升趋势开始趋于饱和时，切换回林格氏液灌注。先关闭含锌林格氏液灌注，然后开启林格氏液灌注。</li>
	<li>等待实验时间结束。若ZnT1功能正常，应观察到荧光信号明显但稳定地下降。</li>
</ol>
6. 数据导出
<ol>
	<li>若要导出经过基线扣除的数据，请按下 Subtract Baseline 按钮，并在 &#34;ND acquisition window&#34; 中查看变化。</li>
	<li>在 &#34;ND acquisition window&#34; 的软件界面中点击 Export 按钮，将打开一个 Excel 数据表。将其保存至目标位置。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>针对每个 ROI，使用前 90–100 秒的数据计算平均基础荧光强度。</li>
	<li>将每个 ROI 计算得到的荧光强度表示为该 ROI 背景荧光的百分比。</li>
	<li>对所有 ROI 取行平均值，并将结果绘制成折线图。由此可获得所有 ROI 随时间变化的平均荧光曲线。</li>
	<li>利用线性拟合功能，选取用任氏液洗涤后荧光下降的初始速率。拟合方程的斜率值与转运速率相关。</li>
</ol>

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

<ol><li>Lindskog, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+carbonic+anhydrase%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of carbonic anhydrase.</a> Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).</li>
<li>Rutherford, J. C., Bird, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-responsive+transcription+factors+that+regulate+iron%2C+zinc%2C+and+copper+homeostasis+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells.</a> Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).</li>
<li>Maret, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Biochemistry%3A+From+a+single+zinc+enzyme+to+a+key+element+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life.</a> Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

上述方法可实现对细胞内锌浓度的直接测量，并具有高时间分辨率。与其他方法相比，该方法通过监测细胞内 Zn2+ 的变化，可显著降低背景噪声。此外，该染料对锌具有选择性，可避免与其他金属阳离子产生潜在的交叉干扰18,19。最后，该染料无 immediate 细胞毒性，因而可用于活细胞过程的检测19。
然而，该方法存在一定的局限性。首先，由于本方法所使用的染料设计为滞留在细胞内，但无法靶向特定区域或特定结构，因此检测细胞内动态过程相对更具挑战性。虽然其他荧光染料可被引导至细胞内的特定区域，但遗憾的是其动态范围要小得多20。其次，染料暴露于光照下会导致荧光因漂白而减弱，从而限制了光照时间，进而缩短了实验的有效操作窗口。第三，与使用其他染料（尤其是基因编码染料）相比，该方案中的染料加载过程繁琐且耗时21。最后，即使...

锌是细胞微环境中一种必需的微量元素。它参与了约三分之一的蛋白质构成，并在多种细胞过程中发挥作用，例如催化作用1、转录调控2以及结构模体的形成3。然而，尽管锌不具备氧化还原活性，高浓度的锌仍会对细胞产生毒性。因此，若缺乏调控锌稳态的机制，任何哺乳动物都无法存活。在哺乳动物中，有三种机制负责这一过程：（1）金属硫蛋白（metallothioneins），这是一类富含半胱氨酸的胞质蛋白，能够高亲和力地结合锌，从而防止胞质中游离锌过量4；（2）Zrt/Irt样蛋白（ZIPs），作为锌转运蛋白，介导锌通过质膜或从细胞内细胞器向胞质内流入4,5,6,7,8；以及（3）ZnTs，属于广泛存在的阳离子扩散促进因子（CDF）家族中的哺乳动物亚群，作为锌转运蛋白，可将锌从胞质中排出至细胞外或转运至细胞内细胞器中4,5,6,7,8,9。鉴于锌在细胞代谢中的重要性，深入理解细胞内锌的动态变化至关重要。
以往评估锌动态的方法依赖于在不同锌条件下检测mRNA表达水平，并将其与固定组织或细胞的细胞内锌含量测量结果进行关联10,11,12。这些方法包括化学检测和免疫组织化学染色。然而，这些方法仅能提供间接测量结果，因此只能确定细胞内锌浓度与锌转运蛋白表达之间的离线相关性。因此，这些方法无法推断任何需要高时间分辨率的参数。
一种更直接的Zn2+转运测量方法是使用锌的放射性同位素13。该方法依赖于对放射性标记的Zn2+的检测，以监测锌的转运过程及其动力学特征。然而，由于锌在细胞稳态中的重要性，多种细胞过程共同调控细胞内锌浓度。其中包括细胞外结合以及多个协同作用的转运系统，以严格维持细胞内Zn2+水平的稳定。这些过程的共同作用会产生显著的背景噪音，从而难以单独检测与锌相关的特定转运功能。
本文介绍了一种通过使用锌特异性荧光染料FluoZin-3测定细胞内游离锌浓度，从而直接监测锌转运速率的方法。该染料对Zn2+具有高度特异性，且受其他二价阳离子（如钙离子）的干扰较小。此外，该染料的酯化形式可通过非离子扩散进入细胞，并因细胞内二酯酶的作用而被截留。因此，其荧光信号主要与细胞质中游离锌的浓度相关。这些实验旨在研究锌转运蛋白1（ZnT1）的结构与功能关系，ZnT1属于ZnT蛋白家族成员。

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板</td><td>greiner bio-one</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>13 mm 盖玻片</td><td>Superior Marienfeld</td><td>111530</td><td></td></tr><tr><td>22 mm 盖玻片</td><td>Superior Marienfeld</td><td>101050</td><td></td></tr><tr><td>6 孔培养板</td><td>greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>bioWorld</td><td>22070008</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化钙，颗粒状</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Ringer 溶液中的浓度：1 mM</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Glentham Life Science</td><td>GC6947</td><td>Ringer 溶液中的浓度：10 mM</td></tr><tr><td>Dubelco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>TI-DH</td><td>已停产，由 Eclipse Ti2 取代</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Dumont</td><td>0203-55-PS</td><td></td></tr><tr><td>Fluozin-3AM</td><td>Invitrogen</td><td>F24195</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 青霉素-链霉素 100 倍溶液</td><td>Cytiva</td><td>SV30010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LED 照明系统</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Merck</td><td>1.05833</td><td>Ringer 溶液中的浓度：0.8 mM</td></tr><tr><td>N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸] (HEPES)</td><td>Formedium</td><td>HEPES10</td><td>Ringer 溶液中的浓度：10 mM</td></tr><tr><td>Neo 5.5 sCMOS 相机</td><td>ANDOR</td><td>DC-152Q-FI</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 成像软件</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 酸</td><td>Millipore</td><td>540025</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Bio-Lab</td><td>163823</td><td>Ringer 溶液中的浓度：5.4 mM</td></tr><tr><td>吡啶硫酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3261</td><td>Ringer 锌溶液中的浓度：7 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>硅脂试剂盒</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-0378</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Bio-Lab</td><td>190305</td><td>Ringer 溶液中的浓度：120 mM</td></tr><tr><td>硫酸锌</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31665</td><td>Ringer 锌溶液中的浓度：7 &amp;mu;M</td></tr></tbody></table>

利用哺乳动物锌转运蛋白的表征 体外 锌转运实验

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

由于锌离子（Zn2+）具有细胞毒性，因此必须对其在细胞内的浓度进行严格调控。过去，通常通过测定在不同 Zn2+ 浓度条件下转运蛋白的表达水平，间接评估 Zn2+ 转运蛋白的活性。这一过程常借助免疫组织化学方法、检测组织中的 mRNA 水平，或测定细胞内 Zn2+ 含量来实现。随着细胞内 Zn2+ 传感器的发展，目前主要通过荧光探针检测细胞内 Zn2+ 的变化，并将其与 Zn2+ 转运蛋白的表达水平相关联，从而确定锌转运蛋白的活性。然而，即使在今天，仍仅有少数实验室能够监测细胞内 Zn2+ 的动态变化，并直接利用该指标测量锌转运蛋白的活性。部分原因在于，在 ZnT 家族的 10 种锌转运蛋白中，除 ZnT10（转运锰离子）外，只有锌转运蛋白 1（ZnT1）定位于质膜上。因此，将转运活性与细胞内 Zn2+ 浓度的变化直接关联存在困难。本文介绍了一种基于锌特异性荧光染料 FluoZin-3 的直接测定锌转运动力学的方法。该染料以其酯化形式被加载到哺乳动物细胞中，并因细胞内的二酯酶活性而在细胞质中被捕获。通过使用 Zn2+ 离子载体吡啶硫酮（pyrithione）使细胞加载 Zn2+。ZnT1 的活性通过细胞洗脱后荧光下降的线性阶段进行评估。在激发波长 470 nm、发射波长 520 nm 下测得的荧光强度与细胞内游离 Zn2+ 浓度成正比。选择表达与 mCherry 荧光蛋白融合标记的 ZnT1 的细胞，可实现仅对表达该转运蛋白的细胞进行监测。该方法可用于研究 ZnT1 蛋白不同结构域在人源 ZnT1（一种将过量锌从细胞中排出的真核跨膜蛋白）转运机制中的作用。

ZnT1 是一种位于细胞质膜上的哺乳动物锌转运蛋白13。它属于阳离子扩散促进因子（CDF）蛋白家族，可将锌从细胞质转运至细胞外环境14。ZnT1 具有双结构域结构：跨膜结构域负责跨膜转运离子，以及一个C端结构域14。与其他已知的 CDF 蛋白不同，ZnT1 具有一个延伸的无序C端结构域（USCTD）。目前，该 USCTD 的功能尚不清楚。我们采用上述方案将 ZnT1 野生型与缺失 USCTD 的 ZnT1 进行比较，以评估其在锌转运活性中的作用。
将 HEK 293T 细胞转染含有 ZnT1 WT 或缺失无序 C 末端（ΔUSCTD）的 pAAV2 质粒，并按照上述方法检测其转运活性速率。补充图 1 显示，两种形式的 ZnT1 均能正常表达并定位于质膜，无任何异常。图 1 展示了此类实验的典型结果。荧光强度的增加反映了细胞内 Zn2+</...

由于锌转运与蛋白质功能之间的因果关系较弱，且时间分辨率较低，其测量一直具有挑战性。本实验方案介绍了一种利用对 Zn2+ 敏感的荧光染料来高时间分辨率监测活细胞 Zn2+ 外排的方法，从而直接测定 Zn2+ 外流。

由于锌离子（Zn2+）等过渡金属具有细胞毒性，其浓度必须受到严格调控。此前，Zn2+转运蛋白的活性是通过……来测定的

我的研究重点是哺乳动物锌转运蛋白的结构与功能关系，特别关注其调控机制。由于锌离子对细胞功能具有重要意义，准确测量细胞内锌动态变化具有挑战性。我们的实验方案解决了锌动态变化检测中信噪比低和时间分辨率不足的问题。该方法能够以高时间分辨率检测锌离子跨细胞膜的内流，同时显著减少其他二价阳离子带来的背景噪声和交叉相互作用。我们发现，哺乳动物锌转运蛋白ZnT-1的C端结构域中的无序延伸区域不参与锌转运功能。这使得研究人员可以专注于ZnT-1蛋白的其他结构域，以研究其对锌转运的调控作用。首先使用倒置荧光显微镜观察转染后的 HEK293T 细胞。待细胞对焦后，切换至明场照明，然后使用 mCherry 的激发波长 587 纳米和发射波长 610 纳米进行荧光观察。关闭明场光源后，检查细胞的荧光信号，以确认 ZnT-1 mCherry 的表达。配制染料加载溶液时，取4微升锌特异性荧光染料溶液，加入4微升10% Pluronic酸溶液，用移液器吹打混匀后转移至1.5毫升离心管中。向已制备的溶液中加入 750 微升洗涤液，剧烈涡旋振荡试管。再次加入 750 微升洗涤液。涡旋振荡后，取 750 微升该溶液加入新的六孔培养板的两个孔中，并用铝箔覆盖。用镊子将先前培养的 HEK293T 细胞板中的 13 毫米盖玻片转移至六孔板中。用铝箔覆盖板后，轻轻振荡 15 至 20 分钟，然后用配制好的洗涤液替换染料加载液。盖好板后，再次振荡 20 分钟。首先，打开显微镜、光源、相机和抽吸系统。清洗灌流系统时，第一个腔室使用林格氏液，第二个腔室使用添加了吡啶硫酮的含锌林格氏液。关闭旋塞后，用相同的溶液填充各腔室。开始样品制备时，将灌流 chamber 放置，使槽的窄边朝上，并在槽周围涂抹一圈硅脂。然后用精细镊子将一块 13 毫米盖玻片从洗涤液中转移至槽上方，细胞面朝下。将一块 22 毫米盖玻片置于 13 毫米盖玻片之上，并用镊子轻轻压紧，注意避免压裂盖玻片。翻转腔室并按压以释放液体。然后向槽内加入100微升林格氏洗涤液，再次按压，确保无泄漏。将灌流室安装并固定在平台上，然后连接灌流和吸引管，以便对沟槽中的细胞进行灌流。将灌流速度调节至约2 mL/min，并开启任氏液灌流。进行测量时，打开成像软件。使用显微镜左侧按钮将显微镜放大倍数设置为10X。选择实时成像后，使用操纵杆移动载物台，并对准凹槽中的细胞进行聚焦。选择 mCherry 的合适波长。细胞聚焦后，移动载物台以选择合适的细胞区域。选择“绘制感兴趣区域（Draw ROIs）”下拉菜单。选择绘制圆形 ROI，并在表达 mCherry 的细胞簇上绘制 ROI。通过按住 Shift 键，然后点击并拖动已有的 ROI，可在第一个 ROI 之外创建新的 ROI。从下拉菜单中选择“绘制方形背景感兴趣区域（ROI）”，并调整背景感兴趣区域的位置和大小，确保该区域内无细胞存在。确认背景感兴趣区域内无细胞后，转到 ND 采集选项卡，选择“波长”子选项卡，并勾选其复选框。确保勾选 GFP 波长的复选框。点击时间子选项卡，将测量间隔设置为每 5 秒一次，持续时间为 30 分钟。在显微镜控制面板上，按下“开启”按钮以启用完美聚焦系统（PFS）。在ND采集条件下，确保勾选PFS On。调节焦距后点击立即运行。使用林格氏液灌注，开始90秒的基线期测量。90秒后，将灌流液从林格氏液切换为含锌林格氏液，并点击主界面面板右下角的红色标记。一旦荧光上升开始趋于饱和，立即切换回林格氏液灌流，直至实验时间结束。要导出经过基线校正的数据，请按下背景校正按钮，并在ND采集窗口中查看变化。点击导出按钮，将数据保存至指定位置。荧光增强表明细胞内锌浓度升高，而荧光减弱则提示ZnT-1将锌转运通过细胞膜的活性。与突变体相比，野生型ZnT-1在细胞对锌负荷的反应变异性方面表现出更平滑的荧光曲线。比较野生型与Delta-USCTD活性的箱线图显示，两者的平均转运速率相似，表明野生型与突变体之间无显著差异。然而，分布范围上的差异可能提示存在功能上的差别。

characterizing-mammalian-zinc-transporters-using-an-vitro-zinc

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用 体外 锌转运测定表征哺乳动物锌转运蛋白

本文描述了一种评估单次跨膜结构域（TMD）寡聚化倾向的高效方法。将TMD与ToxR融合形成的嵌合蛋白在大肠杆菌报告菌株中表达。TMD诱导的寡聚化可导致ToxR二聚化，从而激活转录并产生报告蛋白β-半乳糖苷酶。...

跨膜结构域寡聚化倾向由ToxR检测法确定

来源： Maurakis, S., 等金属限制条件下的生长 淋病奈瑟菌 用于表征金属响应基因及从宿主配体获取金属的研究。 视频实验杂志.

金属限制条件下细菌生长实验：研究金属响应基因功能

我们提出了一种实验方案，用于 体外 外排泵的研究...

体外 MexAB 外排泵的研究 铜绿假单胞菌

蛋白脂质体用于在明确的生化环境中研究纯化的通道蛋白和转运蛋白。本文图示了一种用于检测这些蛋白介导的外排作用的实验方法。详细描述了制备蛋白脂质体、进行记录以及分析数据以定量确定重组蛋白功能特性的各个步骤。...

基于蛋白脂质体的外排实验测定 Cl⁻ 通道单分子特性- 通道蛋白与转运蛋白

锌指结构域具有内在的细胞通透性，能够介导蛋白质递送至多种哺乳动物细胞类型。本文提供了一种利用锌指技术实现细胞内蛋白质递送的详细逐步操作方案。...

利用可穿透细胞的Cys2-His2锌指结构域向哺乳动物细胞直接递送蛋白质

本文介绍了一种在天然结合伴侣存在的条件下提取周质过渡金属分子伴侣并利用X射线荧光和放射性金属摄取技术对其底物含量进行生物物理表征的实验方案。...

革兰氏阴性细菌中必需金属的吸收：X射线荧光、放射性同位素与细胞组分分离

本实验方案的目的是利用细胞外电子受体，通过分光光度法监测跨质膜电子传递，并分析这些细胞外电子受体可能发生的酶促相互作用。...

通过C2C12成肌细胞测量跨质膜电子传递

在使用动物模型之前，培养的原代细胞或永生化细胞系通常被用作研究基本生物学和机制问题的初步方法。本实验方案描述了如何制备全细胞提取物和亚细胞组分，用于通过原子吸收光谱法研究锌（Zn）及其他微量元素。...

原子吸收光谱法测定哺乳动物细胞内锌池

本文详细阐述了一种系统评估大西洋鲑微矿物流通性的方法。该方法包括生物学复杂性逐步增加的工具和模型：（1）化学形态分析，（2）体外溶解度实验，（3）细胞系摄取研究，以及（4）活体鱼类研究。...

利用互补方法评估鱼类饲料中的矿物质可利用性——以大西洋鲑鱼饲料中锌为例

我们描述了一种方法，用于表征通过在大肠杆菌（E.

通过异源表达对膜转运蛋白进行表征 E. coli 膜泡的制备与生产

本方案详细介绍了Zn的制备方法2+-受限培养基、培养容器和种子培养物以生产 Zn2+-结核分枝杆菌中受限制的核糖体。微量的Zn2+ 导致 Zn2+限制生长，我们描述了用作生物指示剂以验证锌的形态发生特征2+ 局限性 体外 在模式细菌中， 耻垢分枝杆菌， 以及人类病原体 M. tuberculosis.

使用Mycobacterium smegmatis作为分枝杆菌锌限制生长条件下的一种生物指示剂

了解哺乳动物锌转运蛋白的体外锌转运测定方法，使用HEK293T细胞和荧光显微镜实时监测锌离子动态。该方法具有高时间分辨率和低背景噪声，可准确分析ZnT-1转运功能及其调控机制。

利用哺乳动物锌转运蛋白的表征体外锌转运实验

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