体内全脑成像斑马鱼幼鱼使用三维荧光显微镜

我们正在开发光学免疫系统和计算算法，以高空间和时间分辨率记录并分析整个大脑的神经活动。由于幼年斑马鱼具有光学透明性，并且拥有多种可用的遗传工具，因此它是理想的研究模型动物。然而，由于样品固定时使用的琼脂糖凝胶会引入像差，可能导致光学图像质量下降；此外，斑马鱼在记录过程中可能发生移动，从而在图像中产生运动伪影，或阻碍从图像中准确提取信号。

公开的实验方案仅简要概述了实验流程，缺少许多关键细节，例如琼脂糖凝固过程、精确的样品固定技术以及简单的定位方法。因此，亟需一种有效且可重复的实验方案，以获得噪声最小、运动伪影最少的高质量图像数据。本方案提供了一种经过优化且可重复的实验操作流程。

本方案可实现长时间的活体全脑成像以及所获取成像数据的可视化。该工作流程主要聚焦于全脑成像，但也可轻松应用于斑马鱼幼体其他器官的成像。我们的目标是揭示神经计算的潜在原理。

为此，我们将继续致力于构建一个涉及大规模神经活动与结构成像，并通过计算分析实现系统性脑图谱绘制的流程。首先，准备斑马鱼固定与定位所需的实验材料与设备。在体视显微镜下观察已麻痹的斑马鱼幼体，确认其运动已停止。

通过观察幼鱼的心跳来目视评估其健康状况。然后使用移液管将一条幼年斑马鱼放入含有琼脂糖凝胶的1.5毫升微量离心管中。将琼脂糖凝胶倒入培养皿中，形成1至2毫米厚的涂层。

使用移液枪将幼虫从微量离心管转移至培养皿中，注意将幼虫放置在培养皿中央。用镊子调整幼虫的方向，使其头部和尾部平展。然后用镊子旋转幼虫，使两只眼睛处于同一水平位置。

凝胶完成配准后，等待琼脂糖凝胶完全凝固，再向培养皿中加入卵水。将含有包埋幼虫的培养皿置于显微镜载物台上进行成像。打开显微镜，将幼虫调整至视野中央。

使用图像采集软件设置成像参数。如果图像出现饱和，则降低激光功率。接下来，通过移动载物台找到幼虫的大脑，并在软件的实时预览模式下，通过手动上下调节焦平面来确定其厚度。

设定体积的下限和上限。然后，对设定的视野进行图像采集。对于三维结构成像，通过依次获取每个 z 平面的二维图像，来获得整个大脑的三维图像。

对于单个 z 平面的功能成像，在特定深度采集大脑神经元活动的时间序列图像。安装 napari 和 napari-animation 后，创建一个新的 Jupyter 笔记本文件。为了可视化图像并生成斑马鱼大脑的三维图像动画，请加载 3D 图像并打开 napari 窗口，然后连接 napari-animation 插件。

接下来，在图层控制中设置参数，如体素大小、颜色映射和对比度范围。在画布中调整查看器设置。然后，要捕获渲染后的图像，请点击动画向导中的“捕获”按钮。

为了生成渲染体积的动画，请调整查看器设置并添加关键帧。添加关键帧后，在动画向导中设置关键帧之间的帧数。最后，保存渲染后的动画。

表达泛神经元标记物GCaMP7a的幼年斑马鱼脑部的体积成像视野覆盖了前脑、中脑和后脑区域。在幼年斑马鱼全脑中，延髓、小脑板、视顶盖、缰核以及端脑背侧的神经元细胞体清晰可见。在二维功能成像中，神经元细胞体在背景以及叠加的神经活动信号中均清晰可辨。