Trichoderma stromaticum 分生孢子在人外周血单核细胞来源巨噬细胞内的活性检测

我们的研究重点是理解木霉属真菌与哺乳动物免疫系统之间的相互作用。某些木霉属物种如何引发疾病？它们如何调节免疫系统，以及这种调节如何影响疾病的发展？

为了回答这个问题，我们使用体外随机化模型。结果表明，木霉属物种通过靶向参与吞噬过程的受体来调节巨噬细胞和中性粒细胞。这些受体包括Toll样受体和白细胞介素受体。

当免疫细胞的吞噬能力下降时，机体对病原体（尤其是胞内病原体）的易感性会增加。真菌具有多种在宿主体内存活的侵袭机制，包括逃避吞噬作用以及在巨噬细胞内存活。

病原菌物种利用巨噬细胞作为“特洛伊木马”以在宿主体内存活。本研究旨在探究木霉菌（Trichoderma）是否能够在巨噬细胞内存活，以及其存活时间的长短。首先，取10 µL木生梭孢壳（Trichoderma stromaticum）母液悬液接种于PDA平板上。

将培养物置于28摄氏度避光条件下培养7至10天，直至观察到分生孢子且培养物变为绿色，以获得新鲜的F1代。向平板中加入三至五毫升磷酸盐缓冲液（PBS），洗涤培养物，然后收集PBS并再次将其滴加到培养物上，逐步去除分生孢子。重复此过程，直至悬液变为深绿色。

将平板中回收的悬液转移至无菌的15毫升离心管中。在12摄氏度下，以1,160 ×g离心5分钟，然后将沉淀重悬于5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。将最终的沉淀重悬于2至3毫升PBS中，并使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对分生孢子进行计数。

将从供体采集的血液转移至一个50毫升离心管中，并加入PBS，使最终体积达到35毫升。沿含有聚蔗糖溶液的离心管管壁缓慢转移血液，形成双相悬浮液。立即在24摄氏度下以1,600 G离心30分钟。

离心后，观察含有 PBMC 的白色环状层，并用 15 毫升离心管轻轻吸取收集。然后向含有 PBMC 的离心管中加入 PBS，使最终体积达到 10 毫升。混匀悬浮液，并在 24 摄氏度下以 1,600 G 离心 30 分钟。

离心后，用10毫升PBS以1,600 G离心5分钟，洗涤细胞三次，然后将沉淀重悬于2毫升R10培养基中。用无菌镊子将圆形玻璃盖玻片放入24孔板的每个孔中，用于接种人类来源的巨噬细胞并加入木霉子实体分生孢子进行处理。计数从人血中分离的外周血单个核细胞（PBMC）悬液，并用R10培养基调整体积，使每孔接种8×10⁵个细胞，终体积为1毫升。

铺板后，使用倒置显微镜观察细胞形态。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养7天，每两天更换一次新鲜的R10培养基，以促进单核细胞向巨噬细胞分化。

七天后，使用倒置显微镜观察细胞形态。随后，吸去每个孔中的培养基，并用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，以去除碎片和未贴壁的细胞。接下来，在R10培养基中制备T. stromaticum分生孢子悬液，终浓度为每毫升8 × 10⁴个分生孢子。

每孔加入一毫升悬浮液，使感染复数达到1:10。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育三小时以进行感染。孵育结束后，移除培养基，并用PBS洗涤细胞，以去除未被吞噬的分生孢子。

然后，向每个孔中加入1毫升R10培养基，并将培养板在不同时间点进行孵育。相应孵育结束后，吸去培养基，并向该孔中加入1毫升PBS。接着，使用镊子和针头将圆形玻璃盖玻片从孔中取出。

接下来，使用染色试剂盒中的组分对盖玻片进行染色。待盖玻片干燥后，用封片剂将其固定在载玻片上。在分生孢子活力检测中，用T.stromaticum分生孢子感染巨噬细胞，并将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育不同时间。每次孵育后，用PBS洗涤细胞两次，以去除未被吞噬的分生孢子。

然后，加入 0.5 毫升无菌蒸馏水，孵育 30 分钟。确认细胞已裂解后，将悬液收集至 1.5 毫升离心管中。在室温下以 6,000 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液，再将沉淀重悬于 10 微升无菌蒸馏水中。

取10微升悬浮液接种至PDA平板上，在28°C避光条件下培养。在吞噬过程初期，可观察到游离的分生孢子、附着于巨噬细胞外膜的分生孢子，或已被巨噬细胞完全内化的分生孢子。随着吞噬时间的延长，游离的分生孢子及附着于巨噬细胞外膜的分生孢子均被巨噬细胞完全内化。

与巨噬细胞相比，分生孢子也位于更上方的平面，且同一个巨噬细胞内可发现多个分生孢子。经过较长时间后，被吞噬的分生孢子在巨噬细胞内萌发，而游离的分生孢子则在R10培养基中萌发，并在37°C下形成菌丝。即使与巨噬细胞相互作用长达120小时后，被吞噬的分生孢子仍保持活性。

吞噬作用后，通过培养物占据整个培养皿并形成有色绿色分生孢子所需的时间来监测其生长情况。