Name: 基于图像的高通量线粒体DNA合成和分布定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学习基于图像的高通量方法定量分析线粒体DNA合成与分布。该技术利用自动化免疫荧光成像和BrdU标记，结合RNA干扰与抑制剂处理，帮助研究人员系统鉴定调控mtDNA代谢的关键蛋白并揭示其动态机制。

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本工作由波兰国家科学中心资助（资助/奖项编号：2018/31/D/NZ2/03901）。

1. siRNA 混合物的制备
<ol>
	<li>实验开始前一天，将细胞（例如 HeLa 细胞）接种至 100 mm 培养皿中，使其在次日达到 70%–90% 的融合度。 
	注意：所有操作均须在层流净化台内无菌条件下进行。</li>
	<li>用 Opti-MEM 培养基将 siRNA 稀释至 140 nM 的浓度，并准备适当体积（参见 材料表）。可使用 96 孔板作为试剂储液板。</li>
	<li>向黑色 384 孔细胞培养微孔板的每孔中加入 5 µL siRNA 溶液（对照样品加等体积 Opti-MEM 培养基）。 
	注意：根据所测试 siRNA 样品的数量，可使用电子移液器或多通道移液器操作。</li>
	<li>在 Opti-MEM 培养基中配制适量的 RNAiMAX 转染试剂溶液（参见 材料表），每 100 µL 培养基中加入 1 µL RNAiMAX。</li>
	<li>向 384 孔板的每孔中加入 10 µL 转染试剂溶液。最方便快捷的方法是使用试剂分配器。</li>
	<li>将 siRNA 与转染试剂在室温下孵育 30 分钟。</li>
</ol>
2. 转染用细胞的准备
<ol>
	<li>孵育期间（步骤 1.6），使用吸液装置（参见材料表）吸去培养基，并用 3 mL PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>加入 1.5 mL 用 PBS 按 1:2 比例稀释的胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>检查细胞是否已脱落；若已脱落，加入 3 mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基。充分重悬细胞后转移至 15 mL 离心管中。取至少 150 µL 细胞悬液，使用细胞计数板进行细胞计数（参见材料表）。</li>
	<li>在含 10% FBS、青霉素和链霉素的 DMEM 培养基中，将细胞重悬至适当浓度（HeLa 细胞系为 35,000/mL）。</li>
</ol>
3. 细胞转染
<ol>
	<li>使用试剂分配器将 20 µL 细胞悬液加入 384 孔板的每个孔中。每孔将接种 700 个细胞。</li>
	<li>将细胞在室温下孵育 1 小时，然后置于培养箱中孵育 72 小时（37 °C 和 5% CO2）。</li>
</ol>
4. BrdU 掺入
<ol>
	<li>用含10% FBS的DMEM培养基配制90 µM的BrdU（参见材料表）溶液。</li>
	<li>在siRNA转染后56小时（细胞固定前16小时），向384孔板的每孔中加入10 µL 90 µM BrdU溶液（最终BrdU浓度为20 µM）。 
	注意：操作应尽可能迅速，因此最好使用试剂分配器、电子移液器或多通道分配移液器。请记得设置不加BrdU的对照孔。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育16小时。</li>
</ol>
5. 线粒体标记
<ol>
	<li>在含有10% FBS的DMEM中配制20 µM的BrdU溶液，并加入线粒体示踪染料溶液（见材料表），使染料终浓度为1.1 µM。</li>
	<li>在BrdU掺入开始后15小时（细胞固定前1小时），向384孔板的每孔中加入10 µL线粒体示踪染料溶液（见材料表），终浓度为200 nM。 
	注意：使用试剂分配器、电子移液器或多通道分配移液器。请保留未添加BrdU但添加了线粒体示踪染料的对照孔。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
</ol>
6. 细胞固定
注意：所有洗涤步骤使用微孔板洗涤器操作最为方便，而试剂的添加则使用试剂分配器进行最为快速。
<ol>
	<li>使用酶标板清洗仪（参见材料表），每孔加入100 µL PBS，清洗两次。第二次清洗后，每孔保留25 µL PBS。 
	注意：在孔中保留PBS可降低下一步加液时细胞脱落的可能性。所有清洗步骤均需保留PBS；因此，下一步加入的溶液应始终配制为2倍浓度，因其将与残留的PBS以等体积混合。</li>
	<li>向每孔加入25 µL含0.4% Triton X-100和Hoechst 33342（浓度为4 µg/mL）的8%多聚甲醛PBS溶液（各试剂的终浓度分别为4%、0.2%和2 µg/mL）以固定细胞（参见材料表）。</li>
	<li>将酶标板置于室温避光孵育30分钟。</li>
</ol>
7. 封闭
<ol>
	<li>用 100 µL PBS 每孔洗涤四次。最后一次洗涤后，每孔中保留 25 µL PBS。</li>
	<li>每孔加入 25 µL 含 6% BSA 的 PBS 溶液（最终 BSA 浓度为 3%）。</li>
	<li>将酶标板置于室温避光孵育 30 分钟。</li>
</ol>
8. 一抗的添加
<ol>
	<li>使用微孔板洗板机吸去BSA，每孔保留10 µL溶液。</li>
	<li>加入10 µL用含3% BSA的PBS配制的一抗溶液。使用终浓度为0.8 µg/mL的抗BrdU抗体和0.4 µg/mL的抗DNA抗体（抗体的最终浓度分别为0.4 µg/mL和0.2 µg/mL）（参见材料表）。</li>
	<li>将酶标板置于4 °C避光条件下过夜孵育。</li>
</ol>
9. 加入二抗
<ol>
	<li>用 100 µL PBS 将每孔洗涤四次。最后一次洗涤后，每孔中保留 10 µL PBS。</li>
	<li>加入 10 µL 用含 6% BSA 的 PBS 配制的 4 µg/mL 二抗溶液（终浓度为 2 µg/mL）。使用与荧光染料（如 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 555）偶联的同种型特异性抗体（抗小鼠 IgG1 和抗小鼠 IgM）（参见 材料表）。</li>
	<li>将酶标板置于室温避光孵育 1 小时。</li>
	<li>用 100 µL PBS 将每孔洗涤四次。最后一次洗涤后，每孔中保留 50 µL PBS。</li>
	<li>用粘性封板膜密封酶标板（参见 材料表），并于 4 °C 避光保存。成像必须在 2 周内完成。</li>
</ol>
10. 成像
注意：成像必须使用自动化的宽场显微镜进行；显微镜必须配备带有控制系统的电机化载物台，以自动对培养板的各个区域进行成像。
<ol>
	<li>检查培养板角落区域（孔 A1、A24、P24、P1）以及中心区域的自动对焦设置。 
	注意：成像时建议使用工作距离较短的 20 倍物镜（参见材料表），并尽可能选择数值孔径较高的物镜。</li>
	<li>根据成像软件在实时预览模式下生成的强度直方图，为各个荧光通道选择足够长的曝光时间，以确保所得图像不出现过饱和现象。</li>
	<li>设置 z 轴成像的适当层数。 
	注意：在 20 倍放大倍数下，视场范围较大，因此并非所有细胞都处于同一焦平面，必须进行 z 轴层扫才能在各自正确的焦平面上观察所有细胞。通常情况下，五层即可满足需求。根据可用磁盘空间情况，可保存完整的 z 层堆栈图像，或仅保存最大强度投影图像。代表性结果部分所示的图像分析基于最大强度投影图像。</li>
	<li>选择每个孔中需成像的视场数量。 
	注意：根据细胞汇合度的不同，单个视场中可成像约 60–300 个细胞。通常情况下，对于汇合度为 60%–90% 的 HeLa 细胞，成像五个视场可分析 500 至 1,000 个以上的细胞。</li>
	<li>选择需要成像的孔位，并开始成像。</li>
</ol>
11. 定量图像分析
注意：获取的图像的定量分析可以使用开源软件（如 Cell Profiler15）进行。本研究中，分析使用 ScanR 3.0.0 软件完成（见材料表）。
<ol>
	<li>通过校正所有荧光通道图像的背景开始分析。根据被分析对象的大小，选择合适的滤波尺寸：细胞核为80像素，BrdU和线粒体DNA（mtDNA）斑点为4像素。</li>
	<li>通过基于细胞核对应荧光通道的信号强度与背景强度之比，创建主对象的掩膜，开始图像分割。</li>
	<li>分别使用适用于BrdU和mtDNA结构的荧光通道，创建代表BrdU和mtDNA斑点的子对象掩膜。 
	注意：每个子对象将被分配给距离最近的主对象（细胞核）。</li>
	<li>设置分析过程中需测量的参数，并测量每个掩膜内所有荧光通道中各个像素的强度。 
	注意：还需计算分配给特定细胞核的子对象数量以及每个子对象的面积。</li>
	<li>根据获得的数据定义需计算的衍生参数。为获得BrdU或mtDNA通道的总荧光强度，需将分配给特定细胞核的所有子对象的强度相加；为获得平均荧光强度，将总荧光强度除以分配给该细胞核的子对象面积之和。 
	注意：为确保所创建的子对象（BrdU或mtDNA斑点）确实位于线粒体内，必须根据线粒体示踪染料的荧光强度对其进行设门筛选。</li>
	<li>使用R 4.2.2统计软件16及以下软件包对ScanR软件获得的数据进行进一步分析：dplyr17、data.table18、ggplot219、&#160;和ggpubr20。此步骤为可选。</li>
</ol>

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

<ol><li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+basis+and+metabolic+interplay+of+redox+regulation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation).</a> Redox Biology. 26, 101284(2019).</li>
<li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis%3A+Mechanism%2C+role%2C+and+tissue+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li>
<li>Shadel, G. S., Horvath, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+signaling+in+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis.</a> Cell. 163 (3), 560-569 (2015).</li>
<li>Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+TCA+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nature Communications. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+control+of+cellular+life%2C+stress%2C+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial control of cellular life, stress, and death.</a> Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).</li>
<li>Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+transport+in+steroid+biosynthesis%3A+role+of+protein-protein+interactions+and+implications+in+disease+states%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).</li>
<li>Swenson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synthesis+to+utilization%3A+The+ins+and+outs+of+mitochondrial+heme%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme.</a> Cells. 9 (3), 579(2020).</li>
<li>West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in innate immune responses.</a> Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+In+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li>
<li>Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+circles%2C+forks+and+humanity%3A+Topological+organisation+and+replication+of+mammalian+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA.</a> BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).</li>
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 <a target="_blank" href="https://ggplot2.tidyverse.org">https://ggplot2.tidyverse.org</a> (2016).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

传统上，通过BrdU掺入及抗体检测对DNA进行标记，已被用于核DNA复制和细胞周期研究14,27,28到目前为止，所有用于检测 BrdU 标记 DNA 的实验方案均包含 DNA 变性步骤（酸性或热变性）或酶消化步骤（DNase 或蛋白酶处理），以暴露表位并促进抗体渗透。这些方案最初是针对高度致密的核 DNA 设计的。然而，由于线粒体 DNA（mtDNA）具有不同的结构组织，研究人员开发出一种无需变性步骤的检测方法，从而简化了操作流程，并使其更适用于高通量应用。该方法取得了优异的效果，因为省略变性步骤后，BrdU 标记的 DNA 仅在细胞核外被检测到图2 和 图3因此，当包含变性步骤时，总是会出现较强的核DNA信号，这可能会严重干扰BrdU标记的线粒体DNA信号的检测...

对于大多数真核细胞而言，线粒体是必需的细胞器，因为它们在多种细胞过程中发挥着关键作用。首先，线粒体是细胞的主要能量供应者1。线粒体还参与调控细胞稳态（例如细胞内氧化还原2和钙平衡3）、细胞信号传导4,5、细胞凋亡6、多种生化物质的合成7,8以及先天免疫应答9。线粒体功能障碍与多种病理状态和人类疾病相关10。
线粒体的功能依赖于两个独立基因组中的遗传信息：核基因组和线粒体基因组。与核基因组相比，线粒体基因组编码的基因数量较少，但所有由线粒体DNA（mtDNA）编码的基因对人类生命均至关重要。维持mtDNA所必需的线粒体蛋白机器由核DNA（nDNA）编码。线粒体复制体的基本组分以及部分线粒体生物发生因子已被鉴定（详见前期研究综述11,12）。然而，线粒体DNA复制与维持机制仍远未被阐明。与核DNA不同，线粒体基因组以多拷贝形式存在，这为调控线粒体基因表达提供了额外层次。目前对于mtDNA在细胞器内的分布与分离规律、这些过程在多大程度上受到调控，以及若存在调控，涉及哪些蛋白质，所知甚少13。当细胞含有野生型与突变型mtDNA的混合群体时，其分离模式尤为关键。它们的不均等分布可能导致产生含有大量有害突变mtDNA的细胞。
迄今为止，维持线粒体DNA（mtDNA）所必需的蛋白质因子主要通过生化方法、生物信息学分析或与疾病相关的研究来鉴定。在本研究中，为了最大限度地提高发现此前未被识别因子的可能性，采用了一种不同的策略。该方法基于在mtDNA复制或修复过程中使用胸腺嘧啶核苷类似物5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）对其进行标记。BrdU在DNA合成过程中可被迅速整合到新生DNA链中，通常用于监测细胞核DNA的复制14。然而，本文所建立的方法已针对检测整合到mtDNA中的BrdU进行了优化，采用抗BrdU抗体的免疫荧光技术进行检测。
该方法可实现对培养的人类细胞中线粒体DNA合成与分布的高通量定量分析 体外一种高通量策略对于在相对较短时间内于不同实验条件下开展测试至关重要；因此，本方案建议采用多孔板格式进行细胞培养，并结合自动化荧光显微镜进行成像。该方案包括利用siRNA文库转染人HeLa细胞，随后通过BrdU对新合成DNA的代谢标记来监测线粒体DNA（mtDNA）的复制或修复过程。该方法结合使用抗DNA抗体对DNA进行免疫染色，并通过定量荧光显微镜分析上述两个参数。此外，使用特异性染料对线粒体进行可视化标记。为验证本方案的特异性，分别在缺乏mtDNA的细胞（rho0细胞）、沉默已知mtDNA维持因子的HeLa细胞以及经mtDNA复制抑制剂处理的HeLa细胞中检测了BrdU染色效果。同时，采用独立方法——定量PCR（qPCR）——检测mtDNA水平。

<table><tbody><tr><td>2&amp;prime;,3&amp;prime;-双脱氧胞苷 (ddC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5782</td><td></td></tr><tr><td>384&amp;nbsp;孔黑色细胞培养微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#781946</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-2&amp;prime;-脱氧尿苷 (BrdU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-1G</td><td>将 BrdU 粉末溶于水中，配制成 20 mM 储存液，并分装。标记时使用 20 &amp;micro;M BrdU 溶液。</td></tr><tr><td>粘性封板膜</td><td>Nerbe Plus</td><td>04-095-0060</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgM 二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21426</td><td></td></tr><tr><td>BioTek 405 LS 微孔板洗板机</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Thoma 细胞计数板</td><td>Heinz Herenz</td><td>REF:1080339</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Cytiva</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965-062</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>甲醛具有毒性，请仔细阅读安全数据表。</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 小鼠单克隆抗 BrdU (IIB5) 一抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32323</td><td></td></tr><tr><td>IgM 小鼠单克隆抗 DNA (AC-30-10) 一抗</td><td>Progen</td><td>#61014</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 系统</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#13778150</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td>线粒体示踪染料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multidrop Combi 试剂分配器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>Orca-R2 (C10600) CCD 相机</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 引物 Fw B2M (内参基因)</td><td></td><td></td><td>CAGGTACTCCAAAGATTCAGG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Fw GPI (内参基因)</td><td></td><td></td><td>GACCTTTACTACCCAGGAGA</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Fw MT-ND1&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>TAGCAGAGACCAACCGAACC&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Fw POLG</td><td></td><td></td><td>TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Fw TFAM</td><td></td><td></td><td>GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Fw TWNK</td><td></td><td></td><td>GCCATGTGACACTGGTCATT</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Rev B2M (内参基因)</td><td></td><td></td><td>GTCAACTTCAATGTCGGATGG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Rev GPI (内参基因)</td><td></td><td></td><td>AGTAGACAGGGCAACAAAGT</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Rev MT-ND1&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>ATGAAGAATAGGGCGAAGGG&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Rev POLG</td><td></td><td></td><td>GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Rev TFAM</td><td></td><td></td><td>GGACTTCTGCCAGCATAATA</td></tr><tr><td>qPCR 引物 Rev TWNK</td><td></td><td></td><td>AACATTGTCTGCTTCCTGGC</td></tr><tr><td>ScanR 显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA Ctrl</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-5</td><td></td></tr><tr><td>siRNA POLG</td><td>Invitrogen</td><td>POLGHSS108223</td><td></td></tr><tr><td>siRNA TFAM</td><td>Invitrogen</td><td>TFAMHSS144252</td><td></td></tr><tr><td>siRNA TWNK</td><td>Invitrogen</td><td>C10orf2HSS125597</td><td></td></tr><tr><td>吸液装置</td><td>NeoLab</td><td>2-9335</td><td>用于细胞培养的吸液装置</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Biowest</td><td>L0931-500</td><td></td></tr><tr><td>UPlanSApo 20x 0.75 NA 物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高通量成像法对线粒体dna合成及分布的定量分析

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

绝大多数细胞过程需要持续的能量供应，其中最常见的能量载体是ATP分子。真核细胞通过氧化磷酸化在线粒体中产生大部分ATP。线粒体是一种独特的细胞器，因其拥有独立的基因组，该基因组可进行复制并传递至下一代细胞。与核基因组不同，细胞中含有多个线粒体基因组拷贝。深入研究负责线粒体基因组复制、修复和维持的机制，对于理解线粒体及整个细胞在正常和疾病状态下的正常功能至关重要。本文介绍一种方法，可用于高通量定量分析培养的人类细胞中线粒体DNA（mtDNA）的合成与分布 体外 介绍了一种基于免疫荧光检测的方法，该方法通过掺入5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记新合成的DNA分子，并同时利用抗DNA抗体检测所有线粒体DNA（mtDNA）分子。此外，线粒体可通过特异性染料或抗体进行可视化。采用多孔板形式培养细胞，并结合自动化荧光显微镜，可在相对较短时间内，在多种实验条件下便捷地研究mtDNA动态变化及线粒体形态。

关键词：免疫荧光检测，5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），线粒体DNA（mtDNA），抗DNA抗体，线粒体形态，多孔板培养，自动化荧光显微镜

高通量研究线粒体DNA（mtDNA）合成与分布动态的实验流程示意图见图1。采用多孔板格式可同时分析多种不同的实验条件，例如利用siRNA文库对不同基因进行沉默。使用BrdU标记新合成的DNA分子的条件可用于检测HeLa细胞线粒体中的BrdU标记DNA（图2A），也可作为其他细胞类型检测方法建立的起始条件。BrdU孵育时间应根据时间进程实验针对不同细胞系进行优化（补充图1）。本研究选用HeLa细胞，因为siRNA筛选需要转染效率高的细胞。重要的是，抗BrdU抗体所获得的信号具有特异性，仅在经BrdU处理的细胞中可观察到（图2）。进一步利用缺乏线粒体DNA的rho0细胞验证了抗BrdU抗体和抗DNA标记的特异性21（补充图2）。如预期，在这些细胞中，无论是否进行BrdU处理，抗BrdU抗体和抗DNA抗体在线粒体中均未检测到信号（<strong cla...

本文描述了一种利用多孔板和自动免疫荧光成像技术，在细胞中研究线粒体DNA（mtDNA）代谢动态过程的方法，可用于检测和定量mtDNA的合成与分布。该方法可进一步用于研究各种抑制剂、细胞应激以及基因沉默对mtDNA代谢的影响。

高通量成像法对线粒体DNA合成及分布的定量分析

绝大多数细胞过程需要持续的能量供应，其中最常见的能量载体是ATP分子。真核细胞……

该方案旨在鉴定导致线粒体DNA分子数量发生变化的蛋白质功能障碍。此项研究还可能揭示参与线粒体DNA在线粒体内分布的因素。线粒体的复制与维持机制目前尚未被完全阐明。关于线粒体基因组在细胞器内的分布调控及其相关蛋白，目前所知甚少。因此，鉴定并表征一些新的参与者将具有重要意义。该技术的主要优势在于其高通量和高内涵的实验方案。我们可以在单次实验中同时测试多种实验条件，并测量各种参数。在全基因组研究中，该方案能够揭示核基因组编码的遗传信息如何调控其线粒体对应部分的全局图景。此外，该方法还有望鉴定出那些功能障碍会导致线粒体DNA应激并激活干扰素反应通路的蛋白质。首先，通过将小干扰RNA（siRNA）稀释于Opti-MEM培养基中，配制140纳摩尔的siRNA混合液。取5微升稀释后的混合液加入至黑色384孔细胞培养微孔板的各孔中。在Opti-MEM培养基中配制适量的RNAiMAX转染试剂溶液，并向每孔加入10微升。使用试剂分配器将试剂加入384孔板中。开始细胞转染时，向含有稀释后siRNA的384孔板各孔中加入20微升HeLa细胞悬液，使每孔接种700个HeLa细胞。在室温下孵育1小时后，将孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育72小时。为了将 BrdU 掺入转染的细胞中，在 siRNA 转染 56 小时后，向每个孔中加入 10 微升 90 微摩尔的 BrdU 溶液。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。使用缺失线粒体 DNA 的第零行细胞研究了 BrdU 掺入 HeLa 细胞线粒体 DNA 中的特异性。开始线粒体标记时，先在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中配制20 µM的BrdU溶液，然后加入线粒体示踪染料，调节其终浓度为1.1 µM。15小时后，取10 µL线粒体示踪染料溶液加入含有HeLa细胞的培养孔中。将细胞孵育一小时。用于通过 BrdU 标记新合成 DNA 分子的条件，能够检测到 HeLa 细胞线粒体中被 BrdU 标记的 DNA。使用抗 BrdU 抗体获得的信号是特异性的，仅在经 BrdU 处理的细胞中观察到；无论是否进行 BrdU 处理，在第零行细胞的线粒体中均未检测到抗 BrdU 或抗 DNA 抗体信号。通过定量抗 BrdU 抗体的荧光信号发现，经 BrdU 处理的第零行细胞的荧光水平与未加 BrdU 的细胞相同，均处于较低水平，而亲本细胞系 A549 和 HeLa 的信号则高出 50 倍。开始固定 HeLa 细胞时，使用微孔板洗涤器，以每孔 100 微升 PBS 对含有 HeLa 细胞的 384 孔板清洗两次。第二次洗涤后，每孔保留 25 微升 PBS，并加入 25 微升 8% 甲醛溶液。将培养板在室温下避光孵育30分钟。然后用100微升PBS洗涤每个孔4次，最后一次洗涤后在孔中留下25微升PBS。向每个孔中加入25微升含6%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液，并将培养板避光孵育30分钟。开始加入一抗时，吸除已固定并封闭的转染HeLa细胞中的牛血清白蛋白（BSA），每孔保留10微升BSA溶液。然后加入10微升用含3% BSA的PBS配制的一抗溶液，将培养板置于4°C避光条件下过夜孵育。孵育结束后，用100微升PBS将每孔洗涤4次，最后一次洗涤后每孔保留10微升。接下来，向384孔板中加入10 µL二抗溶液。使用与荧光染料偶联的同型特异性抗体，例如Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555。将板在避光条件下孵育1小时后，用100 µL PBS对每个孔清洗4次，最后一次洗涤后在孔中保留50 µL PBS。使用抗DNA抗体可在给定实验条件下监测细胞内线粒体DNA的分布情况。线粒体转录因子A（TFAM）的下调导致线粒体DNA分布发生显著变化，与对照细胞相比，线粒体DNA斑点数量减少。通过定量抗DNA抗体的平均荧光信号发现，与所测试的其他条件相比，TFAM沉默后荧光信号显著增加数倍。开始对转染的HeLa细胞进行成像时，根据成像软件生成的强度直方图，在实时成像模式下为各个荧光通道选择足够长的曝光时间。在Z轴上设置适当的成像层面数量。选择每个孔中要显示的视野数量。为了开始对获取的图像进行定量分析，需对所有荧光通道的图像执行背景校正。根据被分析物体的大小，选择合适的滤波器尺寸。接下来，通过基于细胞核荧光信号通道中荧光信号强度与背景强度的比值，创建主要物体的掩膜，从而开始图像分割。使用适用于特定结构的荧光通道，为代表 BrdU 和线粒体 DNA 斑点的亚细胞结构创建掩膜。设置参数，并测量每个掩膜内所有荧光通道中各个像素的强度。为了获得 BrdU 或线粒体 DNA 通道的总荧光强度，需将分配给特定细胞核的所有亚细胞结构的强度值相加。为了获得平均荧光强度，将总荧光强度除以分配给特定细胞核的亚细胞结构面积之和。通过使用实时定量 PCR 检测线粒体 DNA 和基因表达水平，验证了成像结果。使用双脱氧胞苷（ddC）处理导致线粒体 DNA 水平显著降低。在TFAM和twinkle解旋酶的沉默实验中观察到较弱的效应，而转染线粒体DNA聚合酶gamma（POLG）siRNA对线粒体DNA拷贝数仅产生轻微影响。定量分析TFAM和twinkle解旋酶的表达水平，证实其mRNA表达量有效降低至对照组水平的约15%至20%。在POLG中，mRNA表达仅降低至30%，这解释了其对线粒体DNA拷贝数产生的意外轻微效应。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

基于图像的高通量线粒体DNA合成和分布定量

我们开发了一种灵敏的技术，用于标记单个细胞中新合成的线粒体DNA（mtDNA），以研究mtDNA的生物合成。该技术结合了EdU的掺入与酪胺信号放大（TSA）方法，可在神经元的亚细胞区域中可视化mtDNA的复制过程。...

通过EdU信号扩增在单个细胞中可视化线粒体DNA复制

通过追踪光转化的基质靶向GFP在随时间变化的线粒体网络中的平衡情况，来测量线粒体融合。迄今为止，每次仅能对一个细胞进行长达一小时的动力学分析。我们提出了一种可同时测量多个细胞的方法，从而加快了数据采集过程。...

一种基于mtPA-GFP的快速、高分辨率线粒体融合检测方法：利用共聚焦显微镜并行获取多个细胞的动力学数据

携带帕金森病致病基因突变的患者成纤维细胞是一种易于获取的 离体...

利用原代人类成纤维细胞监测帕金森病领域中的线粒体表型

本文介绍一种可在单核苷酸分辨率下对高度完整的DNA中的核糖核苷酸进行同时定量和全基因组定位的方法，该方法结合了基因组DNA的酶切、碱性水解以及后续的5´端测序。...

同时绘制并定量人线粒体DNA中的核糖核苷酸

本文介绍了一种可准确量化线粒体DNA（mtDNA）甲基化水平的实验方案。该方案描述了使用BamHI酶对DNA进行消化，并结合生物信息学分析流程，以避免因mtDNA二级结构导致的mtDNA甲基化水平高估问题。...

线粒体DNA甲基化的精确定量检测方法

过氧化氢（H2O2）既是氧化损伤的来源，也是一种信号分子。本实验方案介绍了如何在活酵母细胞中利用线粒体靶向的基因编码比率型生物传感器 HyPer7（mtHyPer7）来检测线粒体内的...

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视黄酸受体亚型特异性调控活神经元线粒体稳态的优化自动化分析

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在衰老过程中对C. elegans线粒体形态进行成像与定量分析

本研究中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，并重点强调了确定活细胞中线粒体形态特征的关键细节，包括样品制备、图像采集和数据分析。该方法常用于研究多种生理或病理状态下线粒体的形态变化。...

利用共聚焦显微镜测定活细胞中线粒体形态

本文介绍了线粒体事件定位器（MEL），这是一种ImageJ插件，可用于定量分析随时间变化的线粒体分裂与融合活性的三维动态。我们还描述了一种图像处理流程，可用于在ImageJ中进行分析前对显微图像进行预处理和优化。...

通过动态三维荧光显微图像理解线粒体形态的变化

本文介绍了利用共聚焦显微镜和ImageJ评估线粒体裂变/融合动态的方法 通过 Dendra2...

肾近端小管细胞中线粒体分裂/融合动态的评估

学习基于图像的高通量方法定量分析线粒体DNA合成与分布。该技术利用自动化免疫荧光成像和BrdU标记，结合RNA干扰与抑制剂处理，帮助研究人员系统鉴定调控mtDNA代谢的关键蛋白并揭示其动态机制。

高通量成像法对线粒体DNA合成及分布的定量分析

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