高通量成像法对线粒体DNA合成及分布的定量分析

该方案旨在鉴定导致线粒体DNA分子数量发生变化的蛋白质功能障碍。此项研究还可能揭示参与线粒体DNA在线粒体内分布的因素。线粒体的复制与维持机制目前尚未被完全阐明。

关于线粒体基因组在细胞器内的分布调控及其相关蛋白，目前所知甚少。因此，鉴定并表征一些新的参与者将具有重要意义。该技术的主要优势在于其高通量和高内涵的实验方案。

我们可以在单次实验中同时测试多种实验条件，并测量各种参数。在全基因组研究中，该方案能够揭示核基因组编码的遗传信息如何调控其线粒体对应部分的全局图景。此外，该方法还有望鉴定出那些功能障碍会导致线粒体DNA应激并激活干扰素反应通路的蛋白质。

首先，通过将小干扰RNA（siRNA）稀释于Opti-MEM培养基中，配制140纳摩尔的siRNA混合液。取5微升稀释后的混合液加入至黑色384孔细胞培养微孔板的各孔中。在Opti-MEM培养基中配制适量的RNAiMAX转染试剂溶液，并向每孔加入10微升。

使用试剂分配器将试剂加入384孔板中。开始细胞转染时，向含有稀释后siRNA的384孔板各孔中加入20微升HeLa细胞悬液，使每孔接种700个HeLa细胞。在室温下孵育1小时后，将孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育72小时。

为了将 BrdU 掺入转染的细胞中，在 siRNA 转染 56 小时后，向每个孔中加入 10 微升 90 微摩尔的 BrdU 溶液。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。使用缺失线粒体 DNA 的第零行细胞研究了 BrdU 掺入 HeLa 细胞线粒体 DNA 中的特异性。

开始线粒体标记时，先在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中配制20 µM的BrdU溶液，然后加入线粒体示踪染料，调节其终浓度为1.1 µM。15小时后，取10 µL线粒体示踪染料溶液加入含有HeLa细胞的培养孔中。

将细胞孵育一小时。用于通过 BrdU 标记新合成 DNA 分子的条件，能够检测到 HeLa 细胞线粒体中被 BrdU 标记的 DNA。使用抗 BrdU 抗体获得的信号是特异性的，仅在经 BrdU 处理的细胞中观察到；无论是否进行 BrdU 处理，在第零行细胞的线粒体中均未检测到抗 BrdU 或抗 DNA 抗体信号。

通过定量抗 BrdU 抗体的荧光信号发现，经 BrdU 处理的第零行细胞的荧光水平与未加 BrdU 的细胞相同，均处于较低水平，而亲本细胞系 A549 和 HeLa 的信号则高出 50 倍。开始固定 HeLa 细胞时，使用微孔板洗涤器，以每孔 100 微升 PBS 对含有 HeLa 细胞的 384 孔板清洗两次。第二次洗涤后，每孔保留 25 微升 PBS，并加入 25 微升 8% 甲醛溶液。

将培养板在室温下避光孵育30分钟。然后用100微升PBS洗涤每个孔4次，最后一次洗涤后在孔中留下25微升PBS。向每个孔中加入25微升含6%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液，并将培养板避光孵育30分钟。

开始加入一抗时，吸除已固定并封闭的转染HeLa细胞中的牛血清白蛋白（BSA），每孔保留10微升BSA溶液。然后加入10微升用含3% BSA的PBS配制的一抗溶液，将培养板置于4°C避光条件下过夜孵育。孵育结束后，用100微升PBS将每孔洗涤4次，最后一次洗涤后每孔保留10微升。

接下来，向384孔板中加入10 µL二抗溶液。使用与荧光染料偶联的同型特异性抗体，例如Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555。将板在避光条件下孵育1小时后，用100 µL PBS对每个孔清洗4次，最后一次洗涤后在孔中保留50 µL PBS。

使用抗DNA抗体可在给定实验条件下监测细胞内线粒体DNA的分布情况。线粒体转录因子A（TFAM）的下调导致线粒体DNA分布发生显著变化，与对照细胞相比，线粒体DNA斑点数量减少。通过定量抗DNA抗体的平均荧光信号发现，与所测试的其他条件相比，TFAM沉默后荧光信号显著增加数倍。

开始对转染的HeLa细胞进行成像时，根据成像软件生成的强度直方图，在实时成像模式下为各个荧光通道选择足够长的曝光时间。在Z轴上设置适当的成像层面数量。选择每个孔中要显示的视野数量。

为了开始对获取的图像进行定量分析，需对所有荧光通道的图像执行背景校正。根据被分析物体的大小，选择合适的滤波器尺寸。接下来，通过基于细胞核荧光信号通道中荧光信号强度与背景强度的比值，创建主要物体的掩膜，从而开始图像分割。

使用适用于特定结构的荧光通道，为代表 BrdU 和线粒体 DNA 斑点的亚细胞结构创建掩膜。设置参数，并测量每个掩膜内所有荧光通道中各个像素的强度。为了获得 BrdU 或线粒体 DNA 通道的总荧光强度，需将分配给特定细胞核的所有亚细胞结构的强度值相加。

为了获得平均荧光强度，将总荧光强度除以分配给特定细胞核的亚细胞结构面积之和。通过使用实时定量 PCR 检测线粒体 DNA 和基因表达水平，验证了成像结果。使用双脱氧胞苷（ddC）处理导致线粒体 DNA 水平显著降低。

在TFAM和twinkle解旋酶的沉默实验中观察到较弱的效应，而转染线粒体DNA聚合酶gamma（POLG）siRNA对线粒体DNA拷贝数仅产生轻微影响。定量分析TFAM和twinkle解旋酶的表达水平，证实其mRNA表达量有效降低至对照组水平的约15%至20%。在POLG中，mRNA表达仅降低至30%，这解释了其对线粒体DNA拷贝数产生的意外轻微效应。