Name: 解剖成年小鼠血管纹以进行单核测序或免疫染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学习成年小鼠血管纹解剖技术，用于单核测序和免疫染色分析。该方法揭示耳蜗内淋巴电位生成机制，助力研究听力不稳定疾病如梅尼埃病的细胞基础。

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本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD）的院内研究计划资助，项目编号 DC000088，资助对象为 M.H.

所有动物实验和操作均根据美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会批准的方案进行。所有实验方案均经美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会批准。所有方法均按照美国国立神经疾病与卒中研究所和美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所（美国国立卫生研究院）动物护理与使用委员会的相关指南和规定实施。
1. 动物安乐死
<ol>
	<li>使用出生后第30天及以上（P30+）、体重在15–20 g之间的C57BL/6J或Kcnj10-ZsGreen转基因小鼠。</li>
	<li>采用批准的安乐死程序（此处为CO2窒息法）处死一只成年小鼠（年龄P30或以上），并以断头作为辅助步骤。 
	注意：若进行免疫染色，某些抗体可能因非特异性结合血管纹（SV）毛细血管中的血液而产生背景信号。通过心脏灌注固定液可清除血管纹毛细血管中的血液，从而解决此问题。然而，大多数抗体无需此步骤即可获得良好结果，因此本方案不涵盖该方法。</li>
</ol>
2. 暴露骨迷路
<ol>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠并用纸巾擦拭以进行清洁。特别注意头部区域，以降低污染风险。通过将皮肤向鼻部方向拉扯，去除颅骨上的皮肤。</li>
	<li>使用锋利的剪刀沿正中矢状面切开颅骨，分离左侧和右侧部分。</li>
	<li>将脑组织从颅骨中取出，以暴露骨迷路。</li>
</ol>
3. 内耳提取
<ol>
	<li>在颞骨内识别内耳结构（图2A），使用#55镊子刮除脑神经。 
	注意：操作者应使用非优势手持另一把#55镊子固定标本。在解剖过程中，可根据需要使用固定镊子夹持标本的不同部位，但需避免夹持关键区域（例如，切勿压碎耳蜗）。</li>
	<li>使用#55镊子分离鼓室和囊结构，并将其从周围骨组织中剥离。清除内耳表面残留的所有软组织。</li>
	<li>将标本转移至含有1×冷PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4）的透明组织培养皿中，并置于解剖显微镜下（图2B）。</li>
</ol>
4. SV 分离
注意：经过练习，有可能将精囊完整剥离成一条类似带状的长条结构。精囊较为脆弱，若断裂成多个片段，可将其共同存放；或者，也可根据其位置（如基底段、中段、顶端段）分别放入不同且标记清楚的孔中单独保存。
<ol>
	<li>如果解剖显微镜的光源可调节，将一个光源置于培养皿上方，另一个光源从侧面平行于解剖平面照射。这样可提高耳蜗骨下组织的对比度。</li>
	<li>使用 #55 镊子夹住标本的前庭部分，使耳蜗朝上。</li>
	<li>使用 #55 镊子在耳蜗顶处刺穿耳蜗骨。 
	注意：#5 镀子比 #55 更粗，可用于折断骨骼，但其尺寸/强度的增加牺牲了镀子的精细度以及对微小组织的操作能力。建议使用由inox或dumostar等材料制成的镀子，以避免对更精密的镀子造成损伤。操作时应避免将镀子过度深入骨下方，以防损伤SV。</li>
	<li>使用 #55 镊子，沿耳蜗顶回进行刮取（图2C），施加轻柔的力量，剥离外层骨质的小碎片。轻轻抬起骨骼，并将其从侧壁分离。 
	注意：将此解剖过程视为以下步骤可能有助于操作 &#34;移除SV周围的所有物质&#34;，而不是 &#34;从耳蜗中解剖出SV&#34;.</li>
	<li>继续使用 #55 镊子从耳蜗的顶端和中回部分去除骨组织碎片（图 2D，E)。轻压外侧壁，撬动并移除朝向中回的骨壁碎片，以暴露尖回和中回的外侧壁。</li>
	<li>继续使用#55镊子，轻柔地将耳蜗顶回侧壁推开，以暴露螺旋神经节。沿外毛细胞层将顶回和中回的侧壁从螺旋神经节上分离。从耳蜗内部取出螺旋神经节组织块。 
	注意：#55 镊子尺寸较小，在操作小型且精细的组织时具有优势。使用时应格外小心，避免弯曲或损坏。</li>
	<li>为了更好地接触基底回的侧壁，使用#55镊子将耳蜗从颞骨的前庭部分分离。将#55镊子插入圆窗和卵圆窗，并向下朝向前庭方向推动，耳蜗即可分离。随后去除内耳的前庭部分。</li>
	<li>继续使用 #55 镊子，从耳蜗中回区域开始，去除基底耳蜗骨片。轻轻推动骨下侧壁层，使其分离。</li>
	<li>用工具撬动并轻轻牵拉组织，去除侧壁最远端的基底部。该区域的骨质可能过厚，强行去除会损伤下方的软组织。</li>
	<li>现在，随着侧壁基底部的分离，尽可能将侧壁从耳蜗上完整剥离。可通过沿侧壁使用#55镊子进行操作，轻柔地在骨壁与残留的侧壁之间滑动镊子进行分离。若操作者经验丰富，可将侧壁完整剥离至顶回。随后将分离的侧壁转移至新鲜的PBS中。 
	注意：尽管较大的SV组织块可能更易于成像，但由于组织较为脆弱，也可取较小的组织块（图 2F，G），并且根据尺寸大小，也可用于成像。</li>
	<li>使用#55号镊子将侧壁展平。精索静脉应在侧壁内侧呈现为颜色较深的组织层。 
	注意：在解剖过程中，用户可能会发现，尤其靠近顶端时，部分精囊组织会偶然从侧壁脱离。</li>
	<li>轻轻撬起SV层，使其基端从侧壁分离（图 2H）。轻轻推开已分离的SV，将镊子进一步向侧壁的顶端移动，尽可能将SV作为一个长条状整体剥离（图 2I）。不要用镊子用力挤压精索静脉来牵拉。如果组织过于脆弱而无法抓取，可改用组织刮匙（如睑板腺囊肿刮匙）收集。 
	注意：移动SV时应始终在光学显微镜下进行，以确保其不丢失。使用镊子夹取时需格外小心，以防造成损伤。使用者可发现，使用睑板腺囊肿刮匙可降低对SV组织造成损伤的风险。如需进行单核测序，请进入第5节；如需进行SV免疫染色，请进入第7节。</li>
</ol>
5. SV 单核悬液
注意：本方案专为SV组织改编自已发表的制造商单细胞核悬液制备方案。可使用不同制造商的平台31。由于不同平台之间存在差异，建议查阅随设备提供的针对特定制造商的实验方案。为获得sNuc-Seq的最佳结果并最大限度减少RNA降解，组织解剖应尽可能迅速完成（建议在动物安乐死后15-20分钟内开始）。可考虑每次仅对一只动物实施安乐死，并在准备解剖时再进行。多人同时进行解剖操作也有助于缩短降解时间（例如，一名实验人员处理左耳，另一名同时处理右耳）。
<ol>
	<li>如果SV组织将用于sNuc-Seq，请将组织置于预冷的裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl，10 mM NaCl，3 mM MgCl2，0.005% Nonidet P40，溶于无核酸酶水中）。 
	注意：如果解剖后立即进行测序，请继续执行本方案。如果需要暂停实验流程，可通过将SV组织放入RNAlater中进行保存：在4 °C下过夜储存，随后在液氮中速冻，并转移至-80 °C保存直至使用。使用时，将其解冻后用PBS洗涤两次，每次5分钟，然后继续进行匀浆（步骤5.2）。</li>
	<li>在2 mL玻璃匀浆器中，于冰上用10–20次冲程匀浆组织。 
	注意：玻璃杵应手动接触玻璃管底部，以破碎SV组织。由于SV组织较为脆弱，通常20次冲程即可实现充分匀浆。</li>
	<li>在冰上裂解组织25分钟。 
	注意：裂解时间根据组织类型而异。在SV组织中，25分钟的裂解可能导致细胞活力较低（低于4%），但如果细胞活力过高（见步骤5.8），可适当调整裂解时间。</li>
	<li>通过30 µm滤膜过滤，并在4 °C下以500 × g离心5分钟收集滤液。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL核洗涤与重悬缓冲液（1× PBS，1%牛血清白蛋白[BSA]，0.2 U/µL RNase抑制剂）中。</li>
	<li>将细胞通过10 µm滤膜过滤，并在4 °C下以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于50 µL核洗涤与重悬缓冲液中。</li>
	<li>使用细胞计数仪和台盼蓝染色对细胞核进行计数；取5 µL细胞悬液加入50 µL 1× PBS中用于计数。此时细胞活力应极低（3%–4%）。若发现细胞活力偏高，请调整步骤5.3（裂解）的实验条件，并标准化裂解时间，以确保细胞充分裂解。 
	注意：单细胞核制备中细胞活力过高，表明完整细胞数量多于预期，可能需要进一步消化处理。</li>
	<li>按照制造商的操作指南，将样品以所需核密度加载至仪器/芯片上。此时单细胞核捕获已准备就绪。 
	&#8203;注意：通常从一只成年小鼠的SV组织可获得50 µL悬液，浓度约为150,000个细胞核/mL。</li>
</ol>
6. SV 单核测序
<ol>
	<li>将样品送至测序核心平台进行测序。 
	注意：本实验方案的此部分遵循以下通用步骤：（1）乳液中凝胶珠（GEM）的生成与条形码标记，（2）GEM逆转录后纯化及cDNA扩增，（3）3'端基因表达文库构建。单核测序（sNuc-Seq）方案的其余部分相对繁琐，建议读者参考相应仪器制造商提供的专用操作指南。制造商提供的操作手册通常包含具体步骤说明及配套图像，其官方网站上也可能提供“操作视频”。生成的数据集可采用降维方式呈现，例如均匀流形近似与投影（UMAP；图3）。许多实验室会利用测序核心平台代为完成本项操作。</li>
</ol>
7. SV 免疫染色与组织封片
<ol>
	<li>如果组织将用于免疫染色，将其转移至24孔板中，浸入200 µL含4%多聚甲醛（PFA）的1x PBS溶液中，在室温下孵育20分钟。 
	注意：建议在显微镜下进行所有液体移除、洗涤和免疫染色操作。在移液过程中观察组织可确保其不会在液体移除时意外丢失。只要液体体积足以完全浸没SV组织，抗体和洗涤液的体积可根据需要调整。</li>
	<li>固定步骤完成后，在4 °C条件下，使用1x PBS（每孔约500 µL）在低速（30–50）RPM的旋转摇床上进行两次短暂洗涤，每次5分钟。如需储存，可将组织保存在4 °C的1x PBS中。</li>
	<li>移除PBS，并在室温下用约300 µL PBS-T溶液（含0.05 Tween20的1x PBS，添加10%胎牛血清）对组织进行通透和封闭，时间不少于1小时。 
	注意：一抗和二抗应使用此封闭液进行稀释。</li>
	<li>根据所用一抗的具体说明进行组织染色，通常在4 °C孵育过夜。移除残留PBS后，加入稀释后的一抗。 
	注意：稀释比例应依据生产商建议、已发表数据或既往经验等确定。通常初始测试浓度为1:100–200。本文示例中，GS-IB4和DAPI抗体均按1:200稀释。若需同时检测多个蛋白，可将多种一抗混合于同一溶液中，但需确保每种一抗来自不同宿主，以避免二抗交叉反应。</li>
	<li>在低速RPM的旋转摇床上，用约500 µL 1x PBS洗涤组织两次，每次10分钟，以去除残留的一抗。 
	注意：持续确保SV组织完全浸没于溶液中，避免其粘附在孔壁上。</li>
	<li>根据所用二抗的具体说明进行染色，通常在室温下于低速RPM的旋转摇床上孵育2小时。用遮光材料覆盖24孔板，防止荧光标记的二抗暴露于光照下。 
	注意：若需使用多种二抗，可将其混合于同一溶液中，但需注意避免交叉标记。</li>
	<li>在低速RPM的旋转摇床上，用约500 µL 1x PBS洗涤组织四次，每次5分钟，以去除残留的二抗。保持24孔板处于遮光状态，防止荧光淬灭。</li>
	<li>准备大号载玻片（75 mm × 25 mm），沿25 mm边轴方向涂抹两条细小胶线，胶线间距略小于18 mm × 18 mm的小型玻璃盖玻片。在两条胶线之间滴加一滴封片剂（约50 µL）。 
	注意：胶线可提供微小的垂直空间，使放置上层盖玻片时，SV组织样本能安全容纳其中并保持固定位置。尽管血管纹厚度为30–40微米，但仍应避免将组织过度挤压于玻璃表面之间，以保持其形态完整性。也可使用透明胶带作为替代方案。</li>
	<li>使用#55镊子，仅夹取SV一端的少量组织，将其从PBS转移至大号载玻片（75 mm × 25 mm）上的封片剂液滴中。将小型玻璃盖玻片（18 mm × 18 mm）一端置于已涂胶线的位置，缓慢释放，避免产生气泡。盖玻片将自然滑落至另一条胶线上，覆盖SV组织。</li>
	<li>用透明指甲油在封片四周的每个角落轻点封固。在远离观察区域的盖玻片表面正确标记样本信息。此时样本已准备好用于共聚焦显微镜观察（图4）。</li>
	<li>使用解剖显微镜观察SV组织，确保其平铺且远离气泡区域。若SV组织方向不正确，可尝试轻推排除气泡，或小心取下小型玻璃盖玻片后重新调整SV位置。操作时必须轻柔，避免损坏玻璃盖玻片。</li>
</ol>

Stria Vascularis Microdissection for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

<ol><li>Bosher, S. K., Warren, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+electrochemistry+of+the+cochlear+endolymph+of+the+rat%3A+a+quantitative+study+of+its+electrical+potential+and+ionic+composition+as+determined+by+means+of+flame+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).</li>
<li>Patuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+flow+in+stria+vascularis+and+the+production+and+regulation+of+cochlear+endolymph+and+the+endolymphatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential.</a> Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).</li>
<li>Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+cycling+and+the+endocochlear+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">K+ cycling and the endocochlear potential.</a> Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).</li>
<li>Adachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+underlying+maintenance+of+the+endocochlear+potential+by+the+K%2B+transport+system+in+fibrocytes+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear.</a> The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).</li>
<li>Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+highly+positive+endocochlear+potential+formed%3F+The+specific+architecture+of+the+stria+vascularis+and+the+roles+of+the+ion-transport+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus.</a> Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).</li>
<li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).</li>
<li>Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+%26%2334%3Bcochlear+battery%26%2334%3B-claudin-11+barrier+and+ion+transport+proteins+in+the+lateral+wall+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The human &#34;cochlear battery&#34;-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239(2017).</li>
<li>Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNJ10+%28Kir4.1%29+potassium+channel+knockout+abolishes+endocochlear+potential%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).</li>
<li>Spicer, S. S., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+inner+ear+fibrocytes+according+to+their+ion+transport+related+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity.</a> Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).</li>
<li>Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+mechanisms+responsible+for+K%2B+secretion+and+the+transepithelial+voltage+across+marginal+cells+of+stria+vascularis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro.</a> Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).</li>
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<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visuazlied+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561(2016).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

在单细胞测序技术出现之前，许多研究人员采用组织整体分析方法，这种方法仅能对细胞群体的转录组进行平均化分析。而单细胞测序和单细胞核转录组测序（sNuc-Seq）则分别实现了对单个细胞或单个细胞核转录组的分离与分析32。在此基础上，可分别鉴定出边缘细胞、中间细胞、基底细胞以及梭形细胞的单细胞核转录组30。这使得研究人员能够探究螺旋韧带（SV）不同细胞类型之间的转录异质性，并可用于未来进一步研究这些细胞类型在SV功能中的作用，包括内电位（EP）的产生与维持。通过sNuc-Seq生成的数据集可通过降维方式呈现，以帮助理解整体转录差异，并利用UMAP图对不同细胞群体进行比较 图4。对sNuc-Seq数据集的生物信息学分析有多种方法，包括但不限于：差异表达分析、单细胞调控网络推断与聚类（SCENIC）、热图或网格小提琴图构建，以及调控子分析18。针对单细胞RNA测序的其他计算分析技术与sNuc-Seq类似，更多细节可参见Hwang等<sup cla...

耳蜗由三个充满液体的腔室组成，即前庭阶、中阶和鼓室阶。前庭阶和鼓室阶内均含有外淋巴液，其钠离子浓度较高（138 mM），钾离子浓度较低（6.8 mM）1。中阶内含有内淋巴液，其钾离子浓度较高（154 mM），钠离子浓度较低（0.91 mM）1,2,3。这种离子浓度差异被称为耳蜗内电位（EP），主要由钾离子通过耳蜗外侧壁的血管纹（SV）中的多种离子通道和缝隙连接移动而产生4,5,6,7,8,9,10,11。血管纹是一种结构异质、高度血管化的组织，位于耳蜗外侧壁的内侧部分，包含三种主要细胞类型：边缘细胞、中间细胞和基底细胞12（图1）。
边缘细胞通过紧密连接相互连接，形成血管纹（SV）最内侧的表面。其顶膜面向蜗管内的内淋巴液，并利用多种通道（包括KCNE1/KCNQ1、SLC12A2和Na+-K+-ATPase（NKA））将钾离子转运至内淋巴液中5,10,13,14。中间细胞是位于边缘细胞与基底细胞之间的色素细胞，通过KCNJ10（Kir 4.1）通道促进钾离子在血管纹中的转运15,16。基底细胞紧邻耳蜗外侧壁，与螺旋韧带中的成纤维细胞密切相关，有助于钾离子从外淋巴液中回收12。血管纹的病理改变与多种耳科疾病相关17,18。在主要血管纹细胞类型中表达的基因（如Kcnq1、Kcne1、Kcnj10和Cldn11）发生突变时，可导致耳聋及血管纹功能障碍，包括内耳电位（EP）的丧失19,20,21,22,23。除了上述三种主要细胞类型外，血管纹中还存在其他研究较少的细胞类型，例如纺锤形细胞22、根细胞12,24、巨噬细胞25、周细胞26和内皮细胞27，它们在离子稳态维持和内耳电位（EP）生成中的作用尚未完全明确28。
与传统的批量RNA测序相比，单细胞核RNA测序（sNuc-Seq）能够提供关于细胞异质性的信息，而非多个细胞间mRNA的平均值29，在研究具有异质性的SV时尤为有用30。例如，sNuc-Seq已获得的转录组分析结果提示，纺锤体细胞和根细胞可能在EP生成、听力损失以及梅尼埃病中发挥一定作用18。对SV中各类细胞类型进行进一步的转录组学表征，将为我们理解不同类型SV相关性听力波动及听力损失背后的病理生理机制提供宝贵信息。因此，获取这些精细的内耳结构对于实现最佳的组织分析至关重要。
本研究描述了从成年小鼠耳蜗中获取并分离血管纹组织以进行单核RNA测序（sNuc-Seq）或免疫染色的显微解剖方法。对成年小鼠血管纹（SV）进行解剖，有助于理解其多种细胞类型，并进一步阐明它们在听觉功能中的作用。

<table><tbody><tr><td>10-&amp;micro;m 滤膜（聚对苯二甲酸乙二醇酯）</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50010-01</td><td>在 sNuc-Seq 过程中过滤组织</td></tr><tr><td>18 x 18 mm 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td>用于封片 SV 样本</td></tr><tr><td>30-&amp;micro;m 滤膜（聚对苯二甲酸乙二醇酯）</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50030-03</td><td>在 sNuc-Seq 过程中过滤组织</td></tr><tr><td>75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorfrost Plus 显微载玻片</td><td>Daigger</td><td>EF15978Z</td><td>用于承载 SV 样本的载玻片</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:000664</td><td>通用型小鼠品系，其色素在 SV 中间细胞中更易观察。</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>Chalizon 刮匙 5''，3 号，2.5 mm</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>15-1020</td><td>用于转移 SV</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞 3' GEM 试剂盒 v3.1</td><td>Chromium</td><td>PN-1000141</td><td>用于构建单细胞 3' 基因表达文库</td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>用于密封 SV 封片</td></tr><tr><td>Corning Falcon 标准组织培养皿，24 孔</td><td>Corning</td><td>08-772B</td><td>解剖过程中用于盛放样本的培养皿</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306, RRID: AB_2629482</td><td>用于细胞核标记的染料</td></tr><tr><td>Dounce 匀浆器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>用于 sNuc-Seq 前组织匀浆</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>通用解剖镊</td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>尖端精细的镊子，便于操作 SV</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>用于 sNuc-Seq 的若干步骤</td></tr><tr><td>胶棒</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0691392</td><td>用于固定 SV</td></tr><tr><td>GS-IB4 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td>I21411, RRID: AB-2314662</td><td>用于毛细血管标记的抗体</td></tr><tr><td>KCNJ10-ZsGreen 转基因小鼠</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>表达 KCNJ10-ZsGreen 的转基因小鼠，尤其在 SV 的中间细胞中表达。</td></tr><tr><td>MgCl₂</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9530G</td><td>用于 sNuc-Seq 的若干步骤</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>ThermoFisher</td><td>#S36940</td><td>用于 SV 封片的试剂</td></tr><tr><td>24 孔多孔板</td><td>Corning</td><td>#353047</td><td>用于免疫染色的板</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ216183</td><td>用于 sNuc-Seq 的若干步骤</td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9-16-45-9</td><td>用于 sNuc-Seq 的若干步骤</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>ThermoFisher</td><td>4387936</td><td>用于 sNuc-Seq 的若干步骤</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>Silent Shake</td><td>SYC-2102A</td><td>用于免疫染色步骤</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>J61196.AP</td><td>用于免疫染色和解剖步骤</td></tr><tr><td>RNA Later</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>用于保存 SV 以进行 sNuc-Seq</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>用于剪开小鼠颅骨</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15506017</td><td>用于 sNuc-Seq 的若干步骤</td></tr><tr><td>台盼蓝染液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ20605AP&amp;nbsp;</td><td>用于 sNuc-Seq 的若干步骤</td></tr><tr><td>Zeiss STEMI SV 11 Apo 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>用于解剖的显微镜</td></tr></tbody></table>

成年小鼠血管纹组织的解剖用于单核测序或免疫染色

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

由血管纹生成的耳蜗内电位对于维持毛细胞机械转导及最终实现听觉所需的适宜环境至关重要。血管纹的病理改变可导致听力下降。对成年个体血管纹进行解剖，可实现特异性单细胞核捕获，进而开展单细胞核测序和免疫染色。这些技术被用于在单细胞水平上研究血管纹的病理生理机制。
单核测序可用于血管纹的转录组学分析。与此同时，免疫染色在鉴定特定细胞群体方面仍然具有重要价值。这两种方法均需以准确的血管纹分离为前提，而这一操作在技术上可能具有挑战性。

我们介绍一种用于分离血管纹（SV）的方法，可用于单核测序（sNuc-Seq）或免疫染色。耳蜗相对于血管纹（SV）的相关解剖结构（图1）有助于用户更好地理解血管纹的组织结构以及解剖操作步骤。
该视频详细展示了从一只P30小鼠中进行SV显微解剖的每一步操作，图2则呈现了SV解剖与分离关键步骤的截图。
sNuc-Seq 可用于研究异质性 SV 中各类细胞的转录谱。一种可视化方法是在二维 UMAP 上进行聚类（图 3）。通过 sNuc-Seq 产生的数据集可采用多种数据分析技术进行评估，具体将在讨论部分进一步阐述。
SV 经 GS-IB4 和 DAPI 免疫标记以及 Kcnj10-ZsGreen 荧光标记后的整体封片结果如图4...

血管纹对于耳蜗内电位的产生至关重要。本文介绍了用于单核测序或免疫染色的成年小鼠血管纹解剖方法。

耳蜗内电位由血管纹产生，对维持毛细胞正常功能所需的内环境至关重要……

血管纹的功能是产生耳蜗内电位，并调节耳蜗内的内环境稳态。听觉发育与修复项目旨在揭示内环境稳态功能障碍与听力不稳定疾病之间的潜在机制，这些疾病表现为听力波动或突发性听力损失。我实验室的研究工作已建立了血管纹的转录图谱，并加深了我们对其在听觉功能中重要性的理解。我们已利用这些数据来类比研究尚不明确的听力不稳定疾病，包括梅尼埃病。本方案可实现血管纹的整体剥离与分离，以便进一步开展分子研究，如免疫组织化学分析。鉴于血管纹的细胞类型彼此间结构复杂且相互交织，采用细胞核分离及单细胞核RNA测序技术，有助于深入理解其中各自独特的转录机制。首先，在安乐死小鼠的颞骨内确定内耳位置。使用55号镊子刮除颅神经。然后使用55号镊子分离出鼓泡和囊，使其与周围骨组织脱离。清除内耳表面残留的任何软组织。进行前庭导水管（SV）解剖时，使用55号镊子夹住标本的前庭部分，使耳蜗朝上。用同一把镊子从耳蜗骨的顶端穿刺进入。沿顶端回旋轻轻刮取，施加轻柔力量以剥离外层骨质的小碎片。轻柔抬起骨质并从侧壁分离。使用55号镊子移除顶端和中回旋的耳蜗骨碎片。轻柔地向下推压侧壁，将骨壁碎片向中回方向撬开并移除，以暴露顶回和中回的侧壁。将顶回侧壁推开，暴露螺旋神经节。沿外毛细胞层将顶回和中回的侧壁从螺旋神经节上分离。然后从耳蜗内部取出螺旋神经节组织。用镊子插入圆窗和卵圆窗，并向下朝前庭方向推动，使耳蜗与颞骨的前庭部分分离，以便更好地接触到基底回的外侧壁。耳蜗分离后，移除内耳的前庭部分。应尽可能保留大部分螺旋韧带。继续去除骨质，直至中回的骨质与蜗管（SV）分离。接下来，去除覆盖在耳蜗基底回的残余骨质。可通过将骨质下方的侧壁层推开，使其分离来完成此操作。撬开并轻轻牵拉组织，以去除侧壁最远端的基底部，注意不要损伤下方的软组织。当侧壁的基底部脱离后，用镊子沿侧壁走行，将侧壁与其余耳蜗部分分离。轻轻在骨壁与残留的侧壁之间移动镊子，直至到达耳蜗顶端。然后将侧壁转移至新鲜的 PBS 中。将侧壁平铺，使其内侧的精囊（SV）呈现为较深色的组织层。轻轻将精囊组织层从侧壁上剥离。推开已分离的耳蜗导管（SV），沿侧壁推进镊子，尽量将耳蜗导管完整剥离成一条长带状，注意不要挤压耳蜗导管。使用组织铲收集脆弱的组织。耳蜗取自出生后第30天及以上年龄的成年小鼠。从周围颞骨中取出内耳。去除覆盖中回的骨质后，暴露血管纹（SV）。解剖分离后，将血管纹与外侧壁完全分开。将小鼠耳蜗血管纹组织置于2毫升Dounce匀浆器中，在冰上进行10至20次研磨，充分匀浆。将组织置于冰上匀浆 25 分钟。然后将组织通过 30 微米滤膜过滤，并在 4°C 下以 500 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 毫升细胞核洗涤及重悬缓冲液中。接下来，将细胞通过孔径10微米的滤膜过滤，并在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，加入50微升细胞核洗涤与重悬缓冲液重悬细胞。经台盼蓝染色后，取5微升细胞悬液加入50微升1×PBS中稀释，随后进行细胞计数。为准备单核捕获，将具有所需核密度的样本加载到芯片上。通过从小鼠中分离血管纹组织，为免疫染色做准备，并将组织加入含有200 µL 4%多聚甲醛（溶于1×PBS）的24孔板中。在室温下孵育组织20分钟。在低转速的旋转摇床上用 1× PBS 进行两次短暂洗涤。移除 PBS。然后在 300 µL PBST 溶液中于室温下进行透化和封闭，时间至少为一小时。接下来，在4°C条件下用一抗对组织进行过夜孵育。然后加入二抗，在低转速的摇床上室温孵育2小时。用铝箔覆盖板子，避免荧光标记的二抗暴露于光照。接下来，准备一个较大的载玻片，在其25 mm轴线上涂抹两条小胶条，胶条尺寸略小于18 mm × 18 mm的玻璃盖玻片。将一滴封片试剂滴加在两条胶条之间。使用55号镊子，用阴茎海绵体（SV）的一端夹取尽可能少的组织，从磷酸盐缓冲液（PBS）中转移至封片试剂中。将盖玻片的一端放在载玻片上已涂抹一滴胶水的位置，然后轻轻松开盖玻片，避免产生气泡。用透明指甲油在封片的每个角落轻点一下，以密封装片。在玻璃盖玻片上远离观察区域的位置标记样本。在解剖显微镜下观察输精管（SV）组织，确保其平铺且不靠近任何气泡。如果输精管组织方向不正确，可尝试排出气泡，或小心移除较小的玻璃盖玻片并重新调整输精管的位置。制备了来自30日龄小鼠的输精管全封片，并进行了共聚焦成像。ZS 绿色荧光在中间细胞中可见，GSIB-4 标记了内皮细胞，DAPI 标记了细胞核。

dissection-adult-mouse-stria-vascularis-for-single-nucleus-sequencing

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

解剖成年小鼠血管纹以进行单核测序或免疫染色

来源：Daynac, M., et. al．从小鼠成年脑室下区分离神经干细胞与前体细胞及其细胞周期动态的活体成像．J. Vis. Exp.

小鼠神经干细胞分裂的共聚焦显微镜延时成像

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

本文介绍一种从新鲜或冷冻组织中快速分离高质量细胞核的方案，适用于后续的大规模平行RNA测序。方案中包括去污剂-机械法和低渗-机械法两种组织破碎与细胞裂解方法，均可用于细胞核的分离。...

用于大规模并行单核RNA测序的成年脊髓核的分离

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本方案描述了利用透射 illumination...

透射光辅助分离小鼠生精上皮周期特定阶段用于后续免疫染色分析

本文介绍一种从冻存小鼠肾脏中分离高质量细胞核的实验方案，该方法可提高肾髓质细胞类型的代表性，并避免酶解组织解离导致的基因表达异常。...

从成年小鼠肾脏中分离细胞核用于单细胞核RNA测序

本方案详细描述了单细胞核测序的低起始量样本制备流程，包括小鼠颈上神经节和星状神经节的解剖、细胞解离、冷冻保存、细胞核分离以及标签条形码标记。...

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

本文介绍一种对小鼠齿状回中分离的单个细胞核进行测序的方法，该方法通过荧光激活细胞核分选（FAN-分选）排除大多数神经元。该方法可获得高质量的表达谱，有助于研究该微环境中存在的大多数其他细胞类型，包括数量稀少的细胞群体，如神经干细胞。...

结合神经元荧光激活核负向分选与单核RNA测序研究海马神经发生微环境

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于&lt; 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en...

En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

本文提供了一种简化的小鼠嗅上皮解剖与解离方案，用于单核RNA测序。...

小鼠嗅上皮组织快速解剖与解离以制备单细胞核悬液

学习成年小鼠血管纹解剖技术，用于单核测序和免疫染色分析。该方法揭示耳蜗内淋巴电位生成机制，助力研究听力不稳定疾病如梅尼埃病的细胞基础。

成年小鼠血管纹组织的解剖用于单核测序或免疫染色

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