Name: 使用 MicroSiM （μSiM） 屏障组织平台对血脑屏障进行建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解使用MicroSiM屏障组织平台建立血脑屏障组织芯片模型的方法。该技术利用人诱导多能干细胞评估遗传因素影响，为研究脓毒症对大脑的影响提供可靠的体外建模工具。

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J.L.M.、B.E.、T.R.G.、M.C.M.、P.K.、M.T.、K.C. 和 L.W. 由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R33 HL154249 支持。J.L.M. 由 R44 GM137651 项目资助。M.M. 由罗切斯特大学德鲁·梅尔·德尔蒙特神经科学研究所的施密特项目奖资助。M.T. 由 RF1 AG079138 项目资助。K.C. 由国际伦理研究基金会资助。

Analysis of Blood-Brain Barrier Models via Immunofluorescence Staining

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<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).</li>
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<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+for+studying+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions.</a> FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).</li>
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J.L.M. 是 SiMPore 的联合创始人，并持有该公司股权。SiMPore 正在将包括本研究中所用膜在内的超薄硅基技术进行商业化。

尽管膜芯片在设计上具有稳定性，但在组装过程中若操作不当，仍可能发生开裂或破损。因此，必须使用芯片镊子夹住芯片的凹槽部位，并轻柔地将其放入夹具中。在一般情况下操作这些装置时，必须格外小心，避免碰撞或跌落。在将膜芯片与夹具A1进行键合时，必须将芯片平整且居中地放置在夹具A1的支柱上，以防止在与组件1键合过程中膜发生开裂。此外，在移除保护膜后，必须避免任何与暴露的PSA层接触的情况。在移除保护膜后操作组件2时，建议沿组件边缘持握，并使用镊子夹取无PSA的三角形角落部位。
尽管已有文献描述了可能的血脑屏障（BBB）细胞培养方案，但本文所述的脑微血管内皮细胞（BMEC）/周细胞共培养BBB模型是否充分，取决于具体的生理背景和研究问题。例如，免疫细胞的迁移主要发生在脑部的后微静脉中41,42。在这些区域，血管周围间隙将BMEC/周细胞屏障与星形胶质细胞形成的胶质界膜分隔开来。因此，在后微静脉中，神经血管单元（NVU）由两个在空间上分离且串联的屏障组成，而星形胶质细胞终足并不直接接触BMEC/周细胞构成的血屏障，当前模型能够很好地模拟这一结构。如果目标是构建一个能够反映星形胶质细胞分泌因子对血屏障影响的NVU模型，则可在装置中增加一个星形胶质细胞区室，使可溶性因子通过血管周围间隙进行交换。这一设计此前已有示例34，并可进一步扩展，以在三维“脑”区室中纳入小胶质细胞和神经元等其他细胞类型。该平台的模块化架构支持采用简单的组装策略实现上述重构，使平台&#160;可根据待验证的科学假设灵活调整为所需复杂程度。然而，每种细胞培养配置&#160;都必须针对新的细胞系和多细胞共培养体系进行优化。例如，由于氮化硅膜的特性，与传统组织培养板相比，可能需要调整包被溶液。通常添加纤连蛋白有助于细胞的贴附和存活。此外，用户也可在相对方向上培养内皮细胞和周细胞。在此情况下，可能需要修改例如通透性测量的方法及其结果解读方式。然而，本文不涉及此类培养的具体操作步骤。
细胞培养过程中可能遇到的另一个挑战是培养基的快速蒸发，因为这些装置相比标准的组织培养板和培养瓶对环境变化更为敏感。若观察到过度蒸发或细胞生长减缓，必须检测所有关键的培养箱参数，以确保设置准确。可向组织培养瓶的瓶帽中添加更多无菌水&#160;将小培养皿置于细胞培养腔内，或更频繁地更换培养基。此外，气泡可能进入底部通道，并在沟槽朝下装置的沟槽处滞留。虽然气泡可以被清除，但最简便的方法是从一开始就避免引入气泡。为此，在向底部腔室加样前，必须检查移液枪尖端内部及尖端末端是否存在气泡或空气。此外，通道中的培养基蒸发可能导致液面与加样口顶部之间形成间隙。此时可向一个加样口加入少量培养基，直至液体到达对侧加样口表面，随后可在对侧加样口进行培养基更换。hECSR和E6 + 10% FBS培养基不应在水浴中预热，但其他培养基可预先温育以减少气泡形成。若气泡已进入底部腔室，可通过快速在通道中移取100 µL液体将其排出。然而，该方法可能导致腔室间污染或培养基溢出至装置表面，还可能破坏细胞层。另一种方法是先将通道内的培养基完全移除，再以50 µL体积重新加入。但先移除培养基的操作可能引发更多气泡产生。若气泡未位于膜区域正下方，则可保留在通道内，对细胞培养无影响。
如图2所示，周细胞的贴壁与生长可能具有挑战性。使用优化的接种密度对于形成具有生理相关周细胞-内皮细胞比例的细胞层至关重要。此外，由于周细胞对剪切力敏感，通道内的所有换液操作均应缓慢进行，以保护细胞。对于BPLC培养，可通过在下层腔室中包被800 µg/mL IV型胶原或100 µg/mL纤连蛋白来改善细胞贴壁。
本文所述装置中的免疫细胞化学技术可实现对细胞健康状况和功能的定性分析。在组织培养板或其他平台上的染色方法可直接适用于该装置。若仅在上层腔室中进行细胞培养，在固定后，可向底层腔室中加入磷酸盐缓冲液（PBS），并在后续步骤中保留该液体，仅在上层腔室中进行封闭和染色操作。此方法可最大限度降低膜破损或向底层腔室引入气泡的风险。对于共培养染色，我们建议在所有步骤中同时使用上下两个腔室。需要注意的是，固定液和PBS的黏度与培养基不同，因此更容易在底层腔室中引入气泡。在向底层腔室加样前，应格外小心，检查移液器吸头尖端是否存在空气。
本文所述的小分子通透性检测方案可用于对在 µSiM 装置中培养的内皮细胞屏障功能进行功能性与定量评估。在执行步骤 4.1.7.4 从底部通道采集样本时，可能会遇到的一个问题是吸入气泡。为避免此问题，必须确保在开始采样前移液枪头已完全密封插入端口，且采样速度不宜过快。若此方法仍无法解决问题，则可能是所用枪头尺寸过小或过大，无法与端口良好贴合；应使用 材料表 中列出的枪头。若在单层细胞形态健康、融合良好的情况下仍测得异常高的通透性值，则必须检查采样过程中单层结构是否受损。我们建议每次采样后立即在显微镜下检查单层完整性。若单层仍显示完整且状态良好，则可对样本进行固定，并通过例如连接蛋白的免疫染色等方式评估屏障功能的生物学标志物。相反，若测得的通透性值异常偏低，则必须确保从底部通道准确采集 50 µL 培养基，且无气泡混入。若在将储液枪头放置到位后立即有培养基流出，则必须先收集这部分液体，因为从底部通道最初采集的约前 10 µL 体积中通常含有大部分荧光小分子。使用疏水笔在端口周围画圈，或在端口周围贴带孔的疏水胶带，可防止被动泵送的培养基扩散。&#160;被动泵送&#160;的培养基。若采样过程中吸入气泡或未能完全移取 50 µL 样本，则该样本不得使用。或者，也可准确测定实际采集体积并用于通透性计算；但此方法仅适用于采集体积 ≥40 µL 的情况，此时染料回收率约为 98–99%34。

活体组织由特化细胞分隔成不同区室，这些细胞形成并维持屏障，调控细胞和分子在各区室间的转运。屏障功能调节异常可能是多种急性病症和慢性疾病的根源。血脑屏障（BBB）是人体中最严格的组织屏障。1血脑屏障功能障碍是多种中枢神经系统（CNS）疾病的基础，包括阿尔茨海默病2，帕金森病3,4，以及多发性硬化症5,6血脑屏障（BBB）损伤也与脓毒症等急性疾病后出现的长期认知功能障碍相关。7，COVID-198，以及术后谵妄9由于难以有目的地突破血脑屏障以将生物活性分子递送至大脑内的靶点，开发具有治疗脑部疾病潜力的药物一直面临令人沮丧的困难。10因此，研究血脑屏障功能的方法 体外 对理解与治疗中枢神经系统疾病至关重要。
测量屏障功能的基本方法 体外 涉及在半透膜上建立单层细胞或共培养体系，并测量细胞对小分子扩散或微小电流的阻抗11,12,13,14尽管微生理系统（MPS）的出现为三维建模血脑屏障（BBB）提供了大量选择15,16，系统几何结构的多样性使得不同微生理系统（MPS）之间的通透性测量结果难以相互比较，也难以与已建立的文献数值进行对照。在血脑屏障（BBB）研究中，由于脑血管内皮细胞对屏障功能具有广泛的调控作用，建立可靠的基准值尤为关键。 体外 通透性数值受到严格审查12,17,18因此，建立在二维膜上的单层细胞通透性测量将在未来数年内继续成为血脑屏障研究中的常规方法。这一方法同样适用于其他组织屏障，包括上皮屏障，其中基础通透性的绝对值被用于验证和比较 体外 模型19,20,21.
旨在为血脑屏障研究领域建立一种有价值的新型工具，我们已引入22 和高级的23,24,25,26 的 微具有以下特征的装置 silicon m过去5年中，用于屏障组织建模的微膜（µSiM）平台。该平台的关键特性在于其超薄（&#60;厚度为100 nm、含有数亿个纳米孔的膜27,28 或纳米孔与微米孔的混合结构29自由-standing 膜芯片是在一片 300 µm 厚的硅“芯片”上制备而成，用于稳定这些超薄结构。30 并可使用镊子进行操作以组装器件。由于其超薄特性，这些膜的通透性比商用膜培养装置中常用的径迹蚀刻膜高出两个数量级。31,32在实际应用中，这意味着膜对小于纳米孔的分子的扩散具有阻碍作用（&#60;60 nm）可忽略不计33因此，对于细胞屏障而言，只有细胞及其分泌的基质决定了小分子通过膜分隔的顶端与基底腔室之间转运的速率。34该装置的设计以及膜的超薄特性还为光学显微镜观察提供了诸多优势，包括：1）可利用相差或明场成像技术对活细胞培养过程进行实时观察；2）可对样品进行荧光染色并成像 原位 无需将膜提取并转移至盖玻片，以及3）膜的厚度薄于共聚焦显微镜的“切片”，因此直接共培养中不同细胞类型之间的间距比使用6-10 µm厚的径迹蚀刻膜更接近自然状态。
最近，我们将该平台改进为模块化形式，以促进快速组装34和定制化35,36。我们利用模块化设计，在我们的生物工程实验室与合作的脑屏障实验室之间分发装置组件，随后共同开发了装置组装、单细胞培养与共培养、免疫荧光染色、小分子通透性等实验方案，并证明这些方法在不同实验室之间具有可重复性。基于这些方案，我们还证实该模块化平台可支持采用扩展内皮细胞培养法（EECM）建立的经验证的血脑屏障模型，该方法可由人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成类脑微血管内皮细胞（BMEC）37。本报告旨在更详细地综述这些方法，并结合随附视频，推动该平台在血脑屏障研究领域更广泛的应用&#160;。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 多克隆抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-5 小鼠 IgG 抗体，4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>山羊 &amp;alpha;-小鼠 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>山羊 &amp;alpha;-兔 IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2，小鼠 IgG2a，9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&amp;nbsp;MAB2029</td><td></td></tr><tr><td>Occludin 小鼠 IgG 抗体，OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&amp;beta;，兔 IgG 抗体，28E1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin 小鼠 IgG2B 克隆 # 123413</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 兔 IgG 抗体，多克隆</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品、多肽和重组蛋白&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 甲醇</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>人胎盘来源 IV 型胶原蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾来源 I 型胶原蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>DMEM/Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆来源纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>人源纤连蛋白，血浆来源</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>荧光黄 CH 二锂盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>不含钙、镁的 PBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>周细胞培养基</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>使用完整试剂盒（包含添加剂）</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸，10 mg/mL</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 去离子水</td><td>Invitrogen&amp;trade;</td><td>10977015</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验模型：细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血脑屏障 hCMEC/D3 细胞系</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>人脑血管周细胞</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 人诱导多能干细胞</td><td>WiCell</td><td>RRID:CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;玻璃器皿与塑料器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mm TC 处理带 20 mm 网格的细胞培养皿</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>夹具</td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning 细胞培养板（6 孔）</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>平底 96 孔非结合微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片装置支架</td><td>&amp;nbsp;SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>尺寸需与显微镜载玻片支架兼容</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339653</td><td>管盖可注水用于细胞培养</td></tr><tr><td>P20-200 移液器吸头</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>其他品牌可能无法有效密封接口</td></tr><tr><td>Transwell 小室（12 孔，12 mm，0.4 &amp;mu;m 孔径，PC）</td><td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X 物镜（适用于 Andor）</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>空气；工作距离：4 mm；数值孔径 0.45</td></tr><tr><td>10X 物镜（适用于 Nikon）</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>空气；工作距离：6.2 mm；数值孔径 0.25</td></tr><tr><td>40X 物镜（长工作距离）（适用于 Andor）</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>水浸；工作距离：590-610 mm；数值孔径 1.15</td></tr><tr><td>Andor 转盘共聚焦显微镜</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2 相差显微镜</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced PAP 笔</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z672548</td><td>推荐使用 2 mm 笔尖</td></tr><tr><td>带固定装置的组装套件</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>包括固定装置 A1、A2、B1 和 B2</td></tr><tr><td>显微镜相机适配器</td><td>AmScope</td><td>CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR</td><td>&amp;Phi;23.2 - &amp;Phi;30 适配器适用于 Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 DSLR 相机</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>可用类似产品替代</td></tr><tr><td>细胞滤器，40 &amp;micro;m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>组件 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>组件 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>膜芯片</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>其他芯片规格也可提供</td></tr><tr><td>SMD 操作双角镊子</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td><td>&quot;芯片镊子&quot;</td></tr><tr><td>不锈钢精密型 GG 镊子</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW534</td><td>&quot;直头镊子&quot;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>用于图像处理</td></tr><tr><td>Fusion</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td>版本 2.3.0.44 的使用说明</td></tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>版本 2.0 的使用说明</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>用于图像处理。版本 9.9.0 的使用说明</td></tr></tbody></table>

使用微尺度屏障组织平台（microsim, µsim）构建血脑屏障模型

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

微尺度硅膜（µSiM）是一种基于膜的培养平台，用于构建血脑屏障（BBB）模型。与传统的基于膜的平台不同，&#160;µSiM 为实验人员提供了新的功能，包括活细胞成像、在“血液”和“脑”腔室之间无阻碍的旁分泌信号传递，以及无需提取或重新装片即可直接进行免疫荧光成像的能力。本文展示了该平台的基本使用方法，利用超薄纳米孔氮化硅膜建立血脑屏障的单细胞培养（内皮细胞）和共培养（内皮细胞与周细胞）模型。我们验证了该平台与原代细胞培养和人诱导多能干细胞（hiPSC）培养的兼容性。我们提供了通过免疫荧光染色对血脑屏障模型进行定性分析的方法，并展示了利用 µSiM 平台在小分子通透性实验中定量评估屏障功能的应用。所提供的方法可帮助用户在该平台上成功构建其屏障模型，推动组织芯片技术在人类组织研究中的应用。

图1展示了沟槽向下装置的组装过程。图1中，固定装置用于引导各组件和膜芯片的组装。组件1主要由丙烯酸材料制成，具有用于与芯片键合的压敏胶（PSA）表面，以及通向底部腔室的开口和用于移液管进入底部腔室的端口。组件2为通道层，其右上角设有非粘性、无压敏胶的“三角”区域，便于抓握。沟槽向下装置在顶部腔室提供平坦的细胞培养生长区域，而沟槽向上装置则在底部腔室提供细胞培养的平坦表面。
我们进行了内皮细胞单培养以及hCMEC/D3与HBVPs的共培养，以及hiPSC IMR90-4来源的EECM-BMEC样细胞与BPLCs的共培养，并使用尼康Eclipse Ts2相差显微镜配合10倍物镜获取相差图像（图2）。图中展示了原代细胞培养的最佳接种密度（接种后1天拍摄的图像），以及HBVPs接种密度过低的情况（图2A）。最终的共培养与单培养相差图像（内皮细胞培养6天后）可能难以区分（图2C），因此确认原代细胞共培养是否成功可能需要通过免疫荧光染色来验证（参见方案第3节）。图中还展示了hiPSC来源BPLCs的低、高及最佳接种密度（图2B）。与原代共培养相比，hiPSC来源的共培养在相差显微成像中更易于区分（图2D）。BPLCs接种密度过低会导致周细胞覆盖不全和细胞聚团，而接种过多则会导致周细胞层从膜上剥离。此外，下室培养基更换过快可能导致周细胞丢失，因为这些细胞对剪切力极为敏感。构建血脑屏障模型时，周细胞的覆盖率达到约90%为最佳，且内皮细胞层应无间隙。
代表性免疫染色 hiPSC 来源共培养图像如图所示 图3 （6天内皮细胞培养）。对IMR90-4来源的BPLC进行周细胞标志物PDGFRβ染色，对IMR90-4来源的EECM-BMEC样细胞进行黏附连接标志物VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）染色。使用Hoechst染色细胞核。图像采用配备40倍长工作距离物镜的转盘共聚焦显微镜获取。 0.2 µm 切片并用 Imaris 进行处理。尽管超薄纳米膜未被显示，但两个细胞层均可被可视化。
我们在瑞士伯尔尼大学和美国纽约罗切斯特大学两个地理位置相距较远的实验室中，采用相同的实验条件进行了基于取样的小分子通透性检测，以验证结果的实验室间可重复性（图4）34。将来源于hiPSC IMR90-4的EECM-BMEC样细胞在µSiM装置中培养2、4或6天，或在transwell小室中培养6天。两个实验室均使用150 µg/mL的鲁米诺黄（Lucifer Yellow，457 Da）进行通透性实验。装置中培养2天的内皮细胞通透性表现出高度变异性，表明培养2天不足以实现屏障的成熟。从培养4天起，在屏障成熟后，各实验室之间的通透性无显著差异。我们还证明，在µSiM装置和transwell小室中培养6天的内皮细胞通透性与先前已发表的结果一致40。
<img alt="微流控装置组装示意图：丙烯酸层、压力敏感胶、移液口、沟槽结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：µSiM 装置的组装步骤。（A）通过将芯片放置在夹具 A1 上来准备芯片。若要制备最终沟槽向下的装置，则将芯片沟槽面向上放置；若要制备最终沟槽向上的装置，则将芯片沟槽面向下放置。（B）通过从组件 1 上移除保护膜，并将其正面朝下放入夹具 FA1 中，将组件 1 键合到芯片上。使用夹具 A2 施加压力完成键合。（C）通过将组件 2 从其基板上取下并剥离顶部保护层，将组件 2 与组件 1 键合。将组件 2 的通道面向上放入夹具 B1 中，并将组件 1 正面朝上放置在组件 2 的上方。使用夹具 B2 施加压力完成键合。缩写：FAn = 夹具 An；FBn = 夹具 Bn。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="脑细胞培养示意图；接种密度图像；内皮细胞、周细胞、共培养分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：微流控装置中细胞共培养的示意图及代表性相差显微图像。（A）周细胞与内皮细胞接种位置示意图。（B）膜芯片沟槽横截面中细胞位置的侧视示意图。（C）人脑血管周细胞（HBVP）和人脑微血管内皮细胞系 hCMEC/D3 在低接种密度与最佳接种密度下的代表性图像。图像分别在 HBVP 接种后 1 天和 hCMEC/D3 接种后 2 小时采集。（D）由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的类脑周细胞（BPLC）在低、高及最佳接种密度下的代表性图像。图像在接种后 1 天采集。（E）HBVP 与 hCMEC/D3 共培养以及 hCMEC/D3 单独培养的最终状态代表性图像。图像分别在 HBVP 接种后第 8 天和 hCMEC/D3 接种后第 7 天采集。（F）BPLC 与 EECM-BMEC 样细胞共培养失败与成功案例，以及 EECM-BMEC 样细胞单培养的代表性图像。图像分别在 BPLC 接种后第 7 天和 EECM-BMEC 样细胞接种后第 6 天采集。接种密度过低的 BPLC 培养物无法形成充分覆盖，而接种过多的 BPLC 培养物则会过度融合，出现聚团或退缩现象。比例尺 = 100 µm（C-F）。缩写：HBVPs = 人脑血管周细胞；hiPSC = 人诱导多能干细胞；BPLCs = hiPSC 来源的类脑周细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示VE-cadherin、PDGFRβ和Hoechst染色细胞的纳米膜荧光显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：设备中hiPSC来源的细胞共培养免疫染色代表性图像。 细胞经内皮细胞标志物VE-cadherin（绿色）、周细胞标志物PDGFRβ（红色）以及细胞核染色（蓝色）处理。可见两层细胞紧密相邻，仅由一层薄的氮化硅纳米膜隔开（左图中白色箭头指示膜的位置）。比例尺 = 50 µm。缩写：hiPSC = 人诱导性多能干细胞；PDGFRβ = 血小板源性生长因子受体β。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通透性检测示意图；细胞单层、荧光法、通透性曲线、科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：基于取样的小分子通透性检测。（A）实验流程示意图。（B）瑞士伯尔尼大学（UniBe）与中国美国纽约罗切斯特大学（UR）两个地理位置相距较远的实验室之间实验结果的可重复性验证：将hiPSC来源的内皮细胞在µSiM装置中培养2、4或6天，或在transwell滤膜上培养6天，随后使用150 µg/mL的荧光黄（457 Da）进行通透性检测。红色条形表示先前发表的、相同hiPSC来源内皮细胞在transwell滤膜中培养6天后对荧光素钠（376 Da）的通透性数据40。每组N = 4–16。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）与Tukey事后检验，仅显示具有显著差异的比较结果（p &lt; 0.05）。（C）使用在µSiM中培养2天的hiPSC来源EECM-BMEC样细胞检测细胞因子反应；在通透性检测前20小时，向顶部腔室加入0.1 ng/mL TNFα + 2 IU/mL IFNγ或培养基对照（未刺激，NS），随后使用150 µg/mL荧光黄进行检测。每组N = 3。采用Student’s t-检验，p &lt; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>上室接种表面积</td>
			<td>上孔体积</td>
			<td>下室接种表面积</td>
			<td>下通道体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>~37 mm2</td>
			<td>100 µL（可容纳 ≥115 µL）</td>
			<td>~42 mm2</td>
			<td>10 µL（移液 20 µL 以避免气泡）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：关键的µSiM表面积与体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶标</td>
			<td>固定剂</td>
			<td>封闭液</td>
			<td>稀释比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-cadherin</td>
			<td>4% PFA 或 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0.4% Tx-100 或 10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>4% PFA 或 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0.3-0.4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0.3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRβ</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0.4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0.4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：在µSiM装置中共培养免疫细胞化学验证的抗体及染色方法。 缩写：PFA = 甲醛；MeOH = 甲醇；GS = 羊血清。
补充文件 1：通透性值计算模板。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本报告提供了在 µSiM 平台上组装、细胞培养及进行检测的方案，用于构建血脑屏障模型。

使用微尺度屏障组织平台（MicroSiM, µSiM）构建血脑屏障模型

微流控细胞培养系统（microSiM，µSiM）是一种基于膜的培养平台，用于构建血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）模型。与传统的基于膜的培养平台不同，……

我们正在开发一种血脑屏障的组织芯片模型，以研究脓毒症对大脑的影响以及血液中可溶性因子所起的作用。利用人诱导性多能干细胞，我们计划评估遗传因素对特定患者人群易感性的贡献。目前组织芯片领域面临的主要实验挑战是结果的可重复性以及外部实验室对相关技术的采纳。独特的器官芯片设计、芯片内微小的体积以及缺乏标准化的功能检测方法，均加剧了这些挑战，往往使用户只能依赖基于荧光的检测作为主要读出手段。microSIM 装置提供了模块化设计，适用于多种体外建模需求，其类玻璃表面非常适合高分辨率成像，同时配备厚度仅为 100 纳米的超薄、高通透性纳米膜，确保可溶性因子的无缝串扰以及精确的通透性检测。通过使用 microSIM，我们发现特定类型的细胞倾向于产生更多基质蛋白，这些蛋白可在脑血管周围形成支撑性支架。现在我们可以探究炎症是否会导致这些细胞增强或破坏其基质，从而改变屏障的完整性。未来，我们将在模型中增加另一个含有星形胶质细胞和小胶质细胞等绿色细胞的区室，以研究在脓毒症等全身性炎症情况下，这些细胞如何与血脑屏障相互作用。我们还计划进一步研究其他导致全身性炎症的原因，例如在痴呆基础上叠加的术后谵妄。首先，将微SIM装置组装所需的所有材料放入生物安全柜中。使用芯片镊子将膜芯片放置在A1夹具的中心位置，芯片的平面朝下，沟槽区域朝上。倾斜带有芯片的夹具以显示沟槽处的反光。使用直头镊子剥离组件一两侧的蓝色保护层，并将其放入夹具A1中，使上腔朝下。然后轻轻按压组件一，直至压敏胶（PSA）接触芯片。将夹具A2放置在夹具A1上，并在不同角落施加牢固压力，以确保芯片与组件一紧密贴合。将组件二与芯片一起粘接到组件一上时，使用直头镊子夹住组件二的一个角，从片材上将其剥离。然后夹住组件二的非压敏胶区域或三角形区域，取下组件二的蓝色层，露出压敏胶表面。将组件二放置在夹具B1中，压敏胶面朝上。然后将组件一与膜芯片一同放入夹具B1中，膜芯片的上腔室朝上。将夹具B2放置在组件一上，并在不同角落施加稳固压力。从夹具中取出组装好的装置，使用直头镊子密封通道边缘。在用于细胞培养之前，使用紫外光对装置进行20分钟的灭菌处理。首先，将组装好的microSIM装置放入无菌的软管夹中，并置于大型无菌培养皿中进行培养。为增加湿度，可放置一个装有无菌水的50毫升锥形管盖。为准备用于细胞培养的装置，用100微升水冲洗上层腔室。接着，通过混合胶原蛋白IV型、牛纤维连接蛋白和无菌水来配制包被溶液。移除上层腔室中的水，并加入 100 微升包被溶液。将腔室在 37 摄氏度孵育 2 至 4 小时。孵育结束后，将上层腔室中的包被溶液替换为 100 微升室温 hECSR。在底部腔室中加入 20 微升 hECSR 溶液。传代 EECM-BMEC 样细胞时，向细胞中加入细胞解离酶混合物，在 37 摄氏度孵育 5 至 8 分钟。接着，用移液器吹打细胞悬液，并将其加入到离心管中，再加入四倍体积的内皮细胞培养基。在200 × g条件下离心5分钟，并将细胞重悬于1毫升hECSR中。将细胞以每平方厘米40,000个细胞的密度接种至顶室，在37°C孵育2至4小时以促进细胞贴壁。孵育结束后，更换上下两室的培养基为新鲜hECSR。通过将 20 微升在 -20 摄氏度下预冷的 100% 甲醇加入到底部腔室，以及将 50 微升加入到顶部腔室来固定细胞。在室温下孵育装置 2 至 10 分钟。接着，通过向底部腔室加入 20 微升 PBS，向顶部腔室加入 100 微升 PBS 来洗涤细胞。每次洗涤后，确认下室中无气泡。通过向下室加入 20 微升封闭液、向上室加入 50 微升封闭液，室温封闭 30 分钟。封闭结束后，将上室中的液体更换为 50 微升一抗溶液，室温孵育 1 小时。用 PBS 洗涤后，向顶部小室中加入 50 微升二抗溶液，避光孵育一小时。PBS 洗涤后，向顶部小室中加入 50 微升 Hoechst 溶液，孵育三分钟。然后向底部小室中加入 20 微升 PBS，向顶部小室中加入 100 微升 PBS。立即在共聚焦显微镜下对装置进行成像。使用湿式长工作距离40倍物镜定位膜窗，然后切换至荧光通道以检测Hoechst和连接蛋白染色情况。本实验展示了hiPSC细胞培养和接种密度不足的BPLC的最佳接种密度。与原代共培养相比，源自hiPSC的共培养在相差成像中更容易区分。BPLC接种量过低会导致周细胞覆盖不全和成团，而接种过多则会导致周细胞层从膜上剥离。在免疫染色的hiPSC来源细胞共培养中，可见两层细胞紧密相邻，仅由一层薄的氮化硅纳米膜隔开。在通透性检测中，培养两天的内皮细胞通透性表现出高度变异性，表明培养两天不足以实现屏障的成熟。此外，从第四天起屏障成熟后，各实验室之间的通透性无显著差异。

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