Name: 使用基于电穿孔的质粒DNA递送对 体内 脑肿瘤进行建模，以代表患者突变特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: 了解基于电穿孔的质粒DNA递送技术，用于构建免疫健全小鼠脑肿瘤模型，准确模拟胶质母细胞瘤患者突变特征。该方法通过基因组整合实现自体肿瘤生长，为免疫治疗临床前试验提供更可靠的疗效预测平台。

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感谢 Gi Bum Kim 提供免疫荧光染色和图像。我们还感谢 Emily Hatanaka、Naomi Kobritz 和 Paul Linesch 对本实验方案提供的有益建议。

本研究中的所有操作步骤&#160;方案已获Cedars Sinai医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。纯合子 mTmG 小鼠与C57BL/6J小鼠杂交，以获得雌雄混合的杂合子后代 mTmG 用于以下实验方案的小鼠。动物购自商业来源（参见 材料清单). 在出生后第0至3天（P0-P3）对小鼠幼崽进行电穿孔。
1. 手术准备
<ol>
	<li>用化学消毒剂（如 Vimoba）喷洒手术台，擦拭干净后，再用 70% 乙醇喷洒，并再次擦拭。</li>
	<li>将以下器械/材料放置在手术台上：拉制的玻璃毛细移液管（参见参考文献10了解如何拉制移液管）、小剪刀、小型生物危害锐器废弃物容器、微量移液器及移液器吸头、两块剪裁成方形的石蜡膜、电极凝胶、电极、微注射仪固定架，以及 DNA 质粒混合液（参见材料表和补充文件 1）。</li>
	<li>根据指示，将以下附件安装到手术台上的设备或放置于地面：微注射仪控制面板、固定架及其连接至主机的插头、用于将微注射仪固定架侧向固定的支架（助焊工具）、微注射仪脚踏开关（置于地面）、连接至主机的电极，以及电极脚踏开关（置于地面）（参见材料表）。 
	注意：电极脚踏开关置于微注射仪脚踏开关的右侧，以提示操作使用的顺序。</li>
	<li>打开微注射仪和电极控制面板。
	<ol>
		<li>检查微注射仪的实验参数设置是否正确：压力应根据质粒混合液的吸取情况设定在 220–450 hPa 之间。</li>
		<li>检查电极控制面板的实验参数设置是否正确。 
		&#8203;注意：在本实验（以及我们大多数脑肿瘤模型）中，采用 5 次脉冲，每次 120 V（50 ms，间隔 950 ms）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 术前准备
<ol>
	<li>在显微注射仪中准备质粒混合液。
	<ol>
		<li>取一支拉制好的玻璃毛细移液管，插入显微注射仪的持针器中。确保其尖端已旋紧固定。</li>
		<li>一手握住显微注射仪持针器，另一手持小剪刀；将移液管尖端置于小型锐器生物危害容器上方。闭合剪刀后，轻轻向下按压延长的玻璃毛细移液管，在可见弯曲处剪断，位置距离开口约2 mm。若切割成功，小心将其放置一旁备用。</li>
		<li>将市售的质粒混合液管平放在手术台上并打开。在管底部后方放置移液管尖端盒或其他物品以保持管体稳定，便于吸取质粒混合液。将连接至显微注射仪管路的玻璃移液管平放于台面，轻柔插入质粒混合液管中，确保尖端深入液面并靠近管底。 
		注意：由于自然重力产生的吸力，质粒混合液在主动吸取前即会开始进入玻璃移液管。</li>
		<li>当玻璃移液管尖端位于质粒混合液中时，使用显微注射仪面板调节吸入量。从0开始，向负方向旋转右侧旋钮至-60，使质粒混合液进入玻璃移液管。仅需吸入约1英寸长度的混合液。将旋钮转回0，然后将移液管尖端从混合液中取出。 
		注意：切勿在负压状态下将移液管尖端从混合液中取出，否则混合液可能喷入显微注射仪甚至管路中。</li>
		<li>通过将混合液注射到一段石蜡膜上来测试单次注射量。使用脚踏开关按压一次，将混合液注入石蜡膜表面。使用设定为1 µL的移液器吸取石蜡膜上的液滴，观察其是否恰好为1 µL。 
		注意：若体积略小于1 µL，可适当增加显微注射仪的压力。若压力接近450 hPa但仍不足1 µL，则表明玻璃移液管开口过小，需进一步修剪。建议在修剪前先将质粒混合液重新排回原管。尽管如此，剪刀上仍可能残留混合液，因此必须在操作后使用DNase彻底清洗剪刀以去除所有残留物。若单次注射量超过1 µL，则需更换新的拉制玻璃移液管并进行修剪。当测试体积恰好为1 µL时，表明玻璃移液管尖端尺寸已合适。</li>
		<li>重复步骤2.1.4，为后续操作吸取额外的质粒混合液，总量约为2–3英寸长的液柱进入拉制玻璃移液管中。确保混合液未进入显微注射仪过深，以致无法观察到液柱末端。 
		注意：吸取质粒混合液时，必须避免产生气泡。若出现气泡，需将混合液从玻璃移液管中排出，并重新开始此步骤。气泡的存在会对后续向幼鼠脑室注射的操作产生不利影响&#160;。</li>
		<li>当质粒混合液已准备就绪并装入拉制玻璃移液管后，将其放置于焊台辅助支架上并移至一旁，避免意外触碰或碰撞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备实验动物。
	<ol>
		<li>准备一个冰桶用于麻醉幼鼠。向冰桶中加入水，使其融化并有助于冷却麻醉装置（例如移液管盒盖）。</li>
		<li>将盒盖放置于融化的冰上进行降温。</li>
		<li>小心地将幼鼠从笼中取出，并放入仍置于冰上的已冷却盒盖内。再将另一个盖子松松地覆盖在底部上方，以促进冷却过程。</li>
		<li>2–3分钟后检查幼鼠状态。在保持俯卧位的同时将幼鼠彼此分开。 
		注意：幼鼠会扭动，但随着低温麻醉起效，活动将逐渐减缓。为便于观察，可不加盖子。</li>
		<li>为确认麻醉效果，轻捏幼鼠尾部并观察是否有反应。若有反应，则重复步骤2.2.4。若无尖叫或仅有轻微动作，则表明幼鼠已准备好进行操作。 
		&#8203;注意：小鼠不应长时间置于冰上，以免影响术后恢复能力。每次仅将可在麻醉状态下完成注射和电穿孔操作的幼鼠数量置于冰上；随着经验积累，可逐步增加操作数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将DNA质粒混合物显微注射至脑室
<ol>
	<li>将幼鼠腹侧朝上置于桌面上&#160;位置。</li>
	<li>轻轻向后牵拉头部后方，透过皮肤观察颅骨缝。在颅骨上找到人字缝点（lambda）。脑室/注射位点位于人字缝点与眼睛连线的中点处。 
	注意：Lambda 是矢状缝与人字缝相交的位置。参见参考文献11 用于小鼠头骨上 lambda 点的鉴定。</li>
	<li>以垂直角度（移液管笔直朝向天花板）用玻璃移液管尖端刺穿皮肤。按压颅骨时可观察到轻微的凹陷及初始阻力。一旦刺穿，玻璃移液管尖端穿过该凹陷处，即达到适当的注射深度。</li>
	<li>固定玻璃移液管尖端，踩下显微注射仪脚踏开关一次，注入1 µL质粒混合物。 
	注意：有两种方法可以明确判断注射是否成功。首先，可由另一位实验室成员观察质粒混合物在玻璃移液管中的下降情况以确认注射。此外，如果在质粒混合物中加入了快绿或其他染料，注射后染料会在皮肤下的脑室内明显扩散，将其置于手术灯下可清晰观察到。</li>
</ol>
4. 电穿孔
<ol>
	<li>将一块石蜡膜（一格）放在桌面上，在膜上挤出适量电极胶。用刷子将足量的电极胶均匀涂抹在每个电极板上。若有胶体滴落，可用纸巾轻轻擦去。 
	注意：首次电穿孔后，切勿让两个电极板上的胶体相互接触，否则会导致电荷转移，当施加到幼鼠头部时可能听到嘶嘶声。若幼鼠头部一个电极的胶体与另一个电极的胶体接触，也会发生此现象。 
	警告：电穿孔过程中必须小心，确保手指远离电极板。</li>
	<li>用一只手（通常为非惯用手）握住幼鼠身体，手指应位于头部后方较远处。 
	注意：若为右利手，用左手持幼鼠、右手持电极较为方便；若为左利手，则相反。</li>
	<li>将电极靠近幼鼠头部，确保其位置正确，正极电极应置于头部外侧，对准目标脑室（例如，若目标为左侧脑室，则将正极置于幼鼠左侧，负极置于右侧）。在放置电极时，可轻轻用手指（通常为拇指）从头部后方的背部或颈部背侧推动，帮助抬起头部至合适位置。</li>
	<li>通过轻捏尾部检查麻醉深度，仅当幼鼠处于适当麻醉平面时方可进行电穿孔。轻轻将电极板压在小鼠头部前端，覆盖双眼位置。踩下一次电极脚踏开关以启动电穿孔。本方案采用5次脉冲，每次120 V（50 ms，间隔950 ms）；每次脉冲均可听见。
	<ol>
		<li>每次脉冲时，将电极板轻微逆时针旋转，使正极电极逐渐移向头部顶端。 
		注意：在正确电穿孔过程中，可感觉到或观察到幼鼠身体随每次脉冲发生抽动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次脉冲结束后，移开电极板并置于一旁。将幼鼠转移至干净的纸巾上，由另一位实验室成员清理其头部的电极胶，并将其放置于纸巾上的&#34;boat&#34;中，并置于加热灯下。 
	注意：确保加热灯与幼鼠距离不过近。建议由另一位实验室成员协助此步骤，并持续观察幼鼠状态。通常用手握住幼鼠置于加热灯下有助于提高保暖效果。轻柔按摩幼鼠腹部也有助于其恢复。</li>
	<li>当幼鼠身体恢复健康粉红色，且对轻捏尾部有吱叫反应时，将其放回原笼。 
	&#8203;注意：放回笼前，取少量原笼垫料，轻轻擦拭幼鼠体表以沾染笼内气味。将幼鼠放回垫料下方，送回饲养室。</li>
</ol>
5. 术后步骤
<ol>
	<li>将微量注射器玻璃移液管中未使用的质粒混合物倒回离心管中。如果剩余足够量，可用于后续实验。置于 -20 °C 保存。</li>
	<li>用纸巾将电极板上的凝胶擦拭干净。</li>
	<li>将所有设备部件归还原位。 
	注意：如果在吸取质粒混合物之后使用剪刀剪切了玻璃移液管的尖端，请将剪刀留在外面，以便用 DNase 溶液彻底清洗。</li>
	<li>先用化学消毒剂喷洒工作台面，然后擦拭干净，再喷洒 70% 乙醇，再次擦拭。</li>
</ol>

In Vivo Brain Tumor Modeling via Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA

<ol><li>Brabetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biobank+of+patient-derived+pediatric+brain+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).</li>
<li>Hadad, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+glioblastoma+for+the+evaluation+of+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies.</a> Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+recapitulate+heterogeneity+of+molecular+signatures+and+drug+response+in+pediatric+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma.</a> Nature Communications. 12 (1), 4089(2021).</li>
<li>Szatmári, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+the+mouse+glioma+261+tumor+model+for+experimental+glioblastoma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy.</a> Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).</li>
<li>Genoud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+anti-PD-1+and+anti-CTLA-4+immune+checkpoint+blockade+in+SB28+and+GL261+mouse+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models.</a> Oncoimmunology. 7 (12), 1501137(2018).</li>
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<li>Wainwright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+therapeutic+efficacy+utilizing+combinatorial+blockade+against+IDO%2C+CTLA-4%2C+and+PD-L1+in+mice+with+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors.</a> Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).</li>
<li>Kim, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+somatic+mouse+mosaics+with+locus-specific%2C+stably+integrated+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements.</a> Cell. 179 (1), 251-267 (2019).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+assembly%2C+and+transduction+of+transgenic+elements+using+mosaic+analysis+with+dual+recombinase+%28MADR%29%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR).</a> STAR protocols. 1 (3), 100199(2020).</li>
<li>White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intertwined+evolution+and+development+of+sutures+and+cranial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579(2021).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ets+factors+regulate+neural+stem+cell+depletion+and+gliogenesis+in+Ras+pathway+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma.</a> Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice%3A+new+tools+to+tackle+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+loss+of+function+analysis+in+cerebellar+granule+cells+using+in+utero+electroporation-based+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57311(2018).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knock-in+by+CRISPR%2FCas9+and+cell+sorting+in+macrophage+and+T+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e62328(2021).</li>
<li>Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells+in+utero+electroporation+or+viral+stereotaxic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e4093(2012).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2103(2010).</li>
<li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+for+glioblastoma%3A+is+it+working%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于电穿孔的质粒DNA递送技术使得分子生物学方法能够应用于体内研究，其效果类似于基因工程小鼠模型，但具有病毒转导的速度、定位性和高效性8,13,14。然而，病毒转导也伴随着安全性问题以及免疫反应风险。我们在利用电穿孔递送质粒DNA的建模系统中已证实，免疫反应极小，主要的免疫刺激来源于玻璃毛细移液管初次插入脑室时造成的机械损伤8。因此，为了改进现有的用于免疫治疗研究的肿瘤建模系统，上述方案为脑肿瘤提供了一种更加快速且可靠的临床前建模体系。
使用该方法成功构建脑肿瘤模型的第一步关键在于质粒设计。尽管本方案未对此进行描述，但Kim等人8以及Rincon Fernandez Pacheco等人10已针对儿童脑肿瘤模型对此进行了广泛讨论，其他文献也...

小鼠脑肿瘤模型对于理解脑肿瘤的发生机制和治疗方法至关重要。目前的模型通常包括在免疫缺陷小鼠中快速建立的皮下或原位移植模型，这些模型基于少数驱动突变或患者来源的异种移植模型，使用常用的肿瘤细胞系，但免疫缺陷小鼠限制了免疫治疗研究的准确性1,2,3,4。此外，这些临床前模型可能导致假阳性结果，即这些模型在治疗后可能表现出显著甚至治愈性的效果，但该疗效无法在临床实践中重现2,5,6,7。因此，迫切需要能够快速构建出更真实反映患者突变特征的基因工程化临床前小鼠模型，以提高临床前研究结果的可靠性。
基于电穿孔（EP）技术递送DNA质粒以诱导功能缺失（LOF）和功能获得（GOF）突变，可实现此类模型的构建。我们开发了一种更为精确地模拟GOF驱动突变的方法，称为双重组酶介导的盒式交换嵌合分析（mosaic analysis with dual-recombinase-mediated cassette exchange, MADR8）。该方法可在体细胞中以受控且位点特异的方式表达目的基因（或多个基因）8。结合其他分子工具（如成簇规律间隔短回文重复序列，CRISPR），可组合不同的患者特异性突变，从而建立小鼠脑肿瘤模型。该方法已应用于多种儿童脑肿瘤的研究，包括胶质瘤和室管膜瘤8，同时也用于成年型脑肿瘤模型（如胶质母细胞瘤，GBM）的构建。
尽管电穿孔法（EP）在肿瘤建模中的应用不如移植法常见，但以下内容展示了该建模系统迄今为止所具有的简便性和高度可重复性。mTmG小鼠用于插入MADR质粒DNA8,9。该系统可在Rosa26位点处实现loxP&#160;和Flp重组酶靶点（FRT）的重组，从而便于后续插入供体质粒DNA（即感兴趣的获得功能基因）8,9。以下方案表明，经过充分练习后，该方法操作简便，能够以原位且稳定的方式建立小鼠脑肿瘤模型。

<table><tbody><tr><td>0.1-2.5 &amp;micro;L 单通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>2 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-442</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>2-20 &amp;micro;L 单通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>DNAZap PCR DNA 降解溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 方波电穿孔仪</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td></td></tr><tr><td>电极凝胶</td><td>Parker Labs</td><td>PLI152CSZ</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Helping Hands 焊接辅助支架</td><td>Pro'sKit</td><td>900-015</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪刀，4.5&quot; 直刃尖头</td><td>Roboz</td><td>RS-5916</td><td></td></tr><tr><td>小鼠品系：C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX: 000664</td><td></td></tr><tr><td>小鼠品系：Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>&amp;nbsp;JAX: 007676</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Grainger</td><td>16Y894</td><td></td></tr><tr><td>质粒：pCag-FlpO-2A-Cre EV&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>129419</td><td></td></tr><tr><td>铂金镊状电极，直径 7 mm</td><td>BTX</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>锐器盒，1 夸脱容量</td><td>Uline</td><td>S-15307</td><td></td></tr><tr><td>标准玻璃毛细管，4 英寸，外径 1 mm，内径 0.58 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>毛细移液管需拉制——详见参考文献 10。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>垂直显微毛细管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td>加热设置：第一阶段加热值为 880，第二阶段为 680；拉制值为 800。有关拉制的更多细节，请参见参考文献 10。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vimoba 片剂溶液</td><td>Quip Laboratories</td><td>VIMTAB</td><td></td></tr><tr><td>XenoWorks 数字显微注射仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>BRE</td><td></td></tr><tr><td>XenoWorks 显微毛细管固定夹</td><td>Sutter Instruments</td><td>BR-MH</td><td></td></tr></tbody></table>

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒dna

Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures

肿瘤模型对于在探索新的、更有效治疗方法方面进行脑肿瘤的临床前测试至关重要。鉴于人们对免疫治疗的高度关注，拥有一个稳定且具有临床相关性的免疫功能健全小鼠模型，以研究脑内肿瘤细胞和免疫细胞群体及其对治疗的反应，显得尤为重要。尽管大多数临床前模型采用既定肿瘤细胞系的原位移植，但本文介绍的建模系统能够通过将DNA构建体注入体内分裂中的神经前体细胞（NPCs），实现从DNA构建体到逐步但有效发育的“个性化”患者特异性肿瘤突变表征。in vivo使用的DNA构建体采用了双重组酶介导的盒式交换（MADR）方法的嵌合体分析技术，可实现单拷贝体细胞驱动突变的诱变。利用出生后至3日龄内的新生小鼠幼崽，通过靶向位于侧脑室壁的分裂中NPCs进行操作。将DNA质粒（例如MADR衍生质粒、转座子、CRISPR导向的sgRNA）微量注射入脑室后，使用环绕头部前部区域的电极板进行电穿孔。在电刺激作用下，DNA被分裂中的细胞摄取，并有可能整合到基因组中。该方法已成功应用于构建儿童及成人脑肿瘤模型，包括最常见的恶性脑肿瘤——胶质母细胞瘤。本文详细讨论并演示了利用该技术构建脑肿瘤模型的各个步骤，包括对幼年小鼠幼崽的麻醉、质粒混合物的微量注射以及后续的电穿孔操作。借助这种同源性、免疫功能健全的小鼠模型，研究人员将能够拓展临床前建模方法，从而推动更有效癌症治疗方案的改进与评估。

上述方案已成功用于建立儿童及成人脑肿瘤小鼠模型，其中前者已在Kim等人的研究中得到详尽发表8。只要操作技术得当，并对质粒设计进行周密规划，电穿孔（EP）诱导肿瘤的成功率通常可达100%。当使用报告蛋白时，组织学分析是检测DNA质粒成功插入的最快且最简便的方法。本方案详细描述了如何构建具有100%外显率的胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤模型，该结果已通过组织学分析确认。一个MADR供体质粒同时表达一种报告蛋白（smTagBFP2-V5）和SpCas9（补充文件1）。该质粒还包含两个针对Nf1和Trp53的强效驱动型功能缺失（LOF）肿瘤抑制基因单导向RNA（sgRNA）（sgRNA克隆策略见参考文献12；本方案所用寡核苷酸序列见补充文件1）。此外，在质粒混合物中还加入了Cre和Flp重组酶质粒，以实现Rosa26位点的重组（图1A；详见补充文件1）。小鼠在电穿孔术后5个月...

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

肿瘤模型对于探索更有效的新疗法而言，在脑肿瘤的临床前测试中至关重要。随着人们对……的广泛关注，

该技术侧重于在免疫功能健全的小鼠模型中模拟胶质母细胞瘤患者的基因突变谱型，并研究这些不同突变如何影响肿瘤微环境及对治疗的反应。基因组学和单细胞测序结果表明，胶质母细胞瘤的关键驱动突变与癌症的侵袭性以及肿瘤微环境的组分（如免疫细胞群体）密切相关。在临床前试验中，胶质母细胞瘤小鼠模型在免疫治疗中表现出显著疗效，可实现治愈性效果，治疗后未见肿瘤生长迹象。然而，这些效应在患者的治疗结果或生存率方面并未得到体现。本方案在免疫功能健全的小鼠模型中重现了胶质母细胞瘤患者的肿瘤突变谱，能够实现肿瘤的逐步自发性生长，从而更准确地预测治疗效果，尤其是免疫治疗的效果。该建模系统通过电穿孔技术将DNA质粒整合到免疫功能健全小鼠的基因组中。该方法避免了使用病毒和移植数千个肿瘤细胞，这两者都可能产生自身的免疫效应，从而干扰下游实验结果。利用能够模拟患者突变谱的免疫健全小鼠模型，可更准确地评估治疗效果，避免将假阳性结果推进临床试验所带来的繁琐工作。开始时，将麻醉后的小鼠幼崽腹侧朝下放置于操作台上。轻轻向后拉幼鼠头部以透过皮肤观察颅骨缝。在颅骨上找到人字缝（lambda）。脑室或注射位点将位于人字缝与眼睛之间的中点处。以垂直角度用玻璃移液管尖刺入皮肤。此时会遇到初始阻力，并出现轻微的凹陷。刺入后，保持移液管尖位置不动，踩下显微注射仪脚踏开关一次，注入一微升质粒混合物。开始基于电穿孔的质粒DNA递送操作：将一块方形石蜡膜平放在桌面上，并将电极胶挤在膜上。然后在每个电极片上充分涂抹电极胶，确保完全覆盖电极片表面。接着，用非优势手握住已显微注射质粒DNA混合物的幼鼠，手指置于头部后方。为进行电穿孔，轻轻用手指从幼鼠头部后方的背侧滑动，将正极电极置于头部外侧目标脑室的位置。将电极放置在幼鼠眼睛上方，并轻轻挤压幼鼠头部前部的电极板。踩下电极脚踏开关以启动电穿孔。每次脉冲后，将电极板轻轻向逆时针方向旋转，使正极电极板朝向头部顶端移动。最后一次脉冲结束后，取下电极板并置于一旁。电穿孔术后五个月，小鼠已处于濒死状态，通过报告蛋白和组织学分析可检测到肿瘤完全生长。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

使用基于电穿孔的质粒DNA递送对 体内 脑肿瘤进行建模，以代表患者突变特征

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

大脑是一个具有独特特性的部位，其特性无法通过 体外 或异位分析。通过使用立体定位固定仪和低压注射泵进行颅内注射，可可靠地建立具有可重复位置和生长特征的原位小鼠模型。...

创建解剖学上精确且可重复的人脑肿瘤颅内异种移植模型

本文介绍了一种高效且用途广泛的方案，通过将转座子DNA注射到新生小鼠的脑室内，诱导、监测和分析新型胶质母细胞瘤（GBM）。位于脑室下区的细胞摄取质粒后发生转化、增殖，并形成具有人类GBM组织病理学特征的肿瘤。...

转座子介导的质粒DNA整合至新生小鼠侧脑室下区以构建新型胶质母细胞瘤模型

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

颅内脑转移瘤建模因缺乏精确且及时监测肿瘤大小及治疗反应的方法而变得复杂。本研究所展示的方法将颅内肿瘤注射与磁共振成像分析相结合，从而实现精确且一致的注射操作、增强的动物监测以及准确的肿瘤体积测量。...

通过颅内注射与磁共振成像建立脑转移模型

脑转移是癌症患者严重发病和死亡的原因。目前大多数脑转移小鼠模型因伴随全身性转移，干扰了对死亡率和治疗干预效果的分析。本文介绍了一种颈内动脉注射癌细胞的方案，可稳定产生颅内肿瘤，同时全身性肿瘤极少。...

通过颈内动脉注射癌细胞建立脑转移模型

在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学...

多形性胶质母细胞瘤的转化性原位模型

建立原位儿童脑瘤模型需要极为精细的操作，需使用立体定位仪精确植入癌细胞。本文所述方法概述了脑瘤细胞制备、颅内注射操作以及术后监测系统实施的各个步骤，以评估脑瘤的移植情况。...

使用立体定位仪建立脑肿瘤患者来源异种移植原位模型

本实验方案的目的是为研究人员提供一种高度可重复的颅内植入技术。...

小鼠脑内立体定向接种胶质母细胞瘤患者来源异种移植细胞系

采用可溶性硝酰基和三苯甲基探针，利用低场（L波段，1.2...

体内 EPR 评估肿瘤微环境中的 pH、pO2、氧化还原状态以及磷酸盐和谷胱甘肽浓度

了解基于电穿孔的质粒DNA递送技术，用于构建免疫健全小鼠脑肿瘤模型，准确模拟胶质母细胞瘤患者突变特征。该方法通过基因组整合实现自体肿瘤生长，为免疫治疗临床前试验提供更可靠的疗效预测平台。

建立脑肿瘤模型体内利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

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建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

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