建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA
2023年6月23日
利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。
该技术侧重于在免疫功能健全的小鼠模型中模拟胶质母细胞瘤患者的基因突变谱型，并研究这些不同突变如何影响肿瘤微环境及对治疗的反应。基因组学和单细胞测序结果表明，胶质母细胞瘤的关键驱动突变与癌症的侵袭性以及肿瘤微环境的组分（如免疫细胞群体）密切相关。在临床前试验中，胶质母细胞瘤小鼠模型在免疫治疗中表现出显著疗效，可实现治愈性效果，治疗后未见肿瘤生长迹象。
然而，这些效应在患者的治疗结果或生存率方面并未得到体现。本方案在免疫功能健全的小鼠模型中重现了胶质母细胞瘤患者的肿瘤突变谱，能够实现肿瘤的逐步自发性生长，从而更准确地预测治疗效果，尤其是免疫治疗的效果。该建模系统通过电穿孔技术将DNA质粒整合到免疫功能健全小鼠的基因组中。
该方法避免了使用病毒和移植数千个肿瘤细胞，这两者都可能产生自身的免疫效应，从而干扰下游实验结果。利用能够模拟患者突变谱的免疫健全小鼠模型，可更准确地评估治疗效果，避免将假阳性结果推进临床试验所带来的繁琐工作。开始时，将麻醉后的小鼠幼崽腹侧朝下放置于操作台上。
轻轻向后拉幼鼠头部以透过皮肤观察颅骨缝。在颅骨上找到人字缝（lambda）。脑室或注射位点将位于人字缝与眼睛之间的中点处。
以垂直角度用玻璃移液管尖刺入皮肤。此时会遇到初始阻力，并出现轻微的凹陷。刺入后，保持移液管尖位置不动，踩下显微注射仪脚踏开关一次，注入一微升质粒混合物。
开始基于电穿孔的质粒DNA递送操作：将一块方形石蜡膜平放在桌面上，并将电极胶挤在膜上。然后在每个电极片上充分涂抹电极胶，确保完全覆盖电极片表面。接着，用非优势手握住已显微注射质粒DNA混合物的幼鼠，手指置于头部后方。
为进行电穿孔，轻轻用手指从幼鼠头部后方的背侧滑动，将正极电极置于头部外侧目标脑室的位置。将电极放置在幼鼠眼睛上方，并轻轻挤压幼鼠头部前部的电极板。踩下电极脚踏开关以启动电穿孔。
每次脉冲后，将电极板轻轻向逆时针方向旋转，使正极电极板朝向头部顶端移动。最后一次脉冲结束后，取下电极板并置于一旁。电穿孔术后五个月，小鼠已处于濒死状态，通过报告蛋白和组织学分析可检测到肿瘤完全生长。
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概述
本方案描述了一种构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型能够准确模拟胶质母细胞瘤患者中常见的基因突变。通过使用具有完整免疫系统的同源性肿瘤模型，研究人员可以更准确地预测治疗效果，尤其是免疫治疗的疗效。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 免疫治疗
背景
- 胶质母细胞瘤具有侵袭性癌症行为的特征。
- 遗传驱动突变影响肿瘤微环境及治疗反应。
- 现有的临床前模型常难以预测患者的治疗结果。
- 免疫活性模型能更准确地模拟人类疾病。
研究目的
- 构建模拟患者胶质母细胞瘤突变的小鼠模型。
- 研究这些突变对肿瘤生长和治疗反应的影响。
- 提高免疫治疗临床前试验的预测能力。
使用的方法
- 基于电穿孔的质粒DNA递送。
- DNA质粒在免疫功能正常小鼠基因组中的整合。
- 逐步自体肿瘤生长建模。
- 基因组和单细胞测序用于突变谱分析。
主要结果
- 成功构建了胶质母细胞瘤患者的突变谱模型。
- 鉴定了与肿瘤行为相关的免疫细胞群体。
- 在临床前试验中证实了免疫疗法的有效性。
- 揭示了小鼠模型与患者临床结果之间的差异。
结论
- 该模型为测试免疫治疗策略提供了一个可靠的平台。
- 它有助于更深入地理解肿瘤微环境中的相互作用。
- 未来的研究可利用此模型来优化患者的治疗策略。
常见问题
行业重要性概述
基于电穿孔技术将患者特异性的突变特征导入免疫健全小鼠的神经前体细胞，可建立高度可预测的、自发性脑肿瘤模型，用于临床前免疫治疗评估。该方法通过重现肿瘤微环境及免疫结构，弥补了传统细胞系异种移植模型与临床结果之间的转化鸿沟。该模型能够提供更具临床相关性的疗效和机制数据，从而支持免疫肿瘤学研发项目的个体化风险评估与推进。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在体内研究胶质母细胞瘤驱动突变及其对肿瘤生物学的影响。
- 可在具有完整免疫功能且与疾病相关的系统中，对遗传靶点进行功能验证。
- 通过模拟患者突变谱型及免疫相互作用，有助于揭示作用机制并降低研发风险。
筛选与检测方法开发
- 提供了一个可模拟患者肿瘤-免疫动态环境的平台，用于评估免疫治疗药物。
- 可重复地定量检测肿瘤生长和免疫细胞群体变化，用于化合物评价。
- 通过避免病毒载体或细胞移植带来的干扰效应，支持检测方法的标准化。
转化与临床前研究
- 将临床前疗效测试与患者相关的突变特征和免疫微环境相匹配。
- 实现免疫肿瘤学项目从发现到临床前验证的连续性。
- 通过模拟逐步、内源性的肿瘤发展过程，提高临床转化的预测可信度。
流程与工作流整合
该模型融入了从发现到临床前研究的连续过程，架起了早期机制研究与转化性免疫治疗评估之间的桥梁。
- 发现生物学：支持对突变驱动的肿瘤发生及免疫调节进行假设验证。
- 筛选：提供定量且可重复的肿瘤和免疫细胞指标，用于候选对象的优先排序。
- 分析：支持基因组和单细胞测序数据输出，以比较突变效应和治疗反应。
- 转化研究：促进与患者生物标志物谱型和免疫特征的对接。
- 企业级复用：提供可重复使用、模块化的平台，适用于多种突变与治疗组合。
运营与企业影响
- 科学价值：提高肿瘤免疫学研究的预测可信度，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：在无病毒或移植干扰因素的情况下实现肿瘤建模标准化，增强实验可重复性。
- 战略价值：在临床试验前过滤假阳性结果，从而支持更优的立项/终止决策并提升资金使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的免疫治疗候选药物优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备新生小鼠操作、显微注射和电穿孔技术方面的专业知识。
- 需要具备电穿孔设备以及基因组分析基础设施的使用权限。
- 要求跨团队标准化操作，以确保肿瘤诱导和数据采集的可重复性。
- 针对不同的突变特征或肿瘤亚型，可能需要进行方法调整。
- 实际限制包括技术操作技能要求以及模型构建所需的时间周期。
