Name: 采用 11 倍扩增显微镜的通用分子保留 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学习Magnify扩展显微镜技术，实现生物样本11倍放大并保持多种生物分子完整，适用于神经科学与临床病理学研究。该方法无需专用设备即可获得15纳米分辨率，助力药物发现与疾病研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由卡内基梅隆大学和 D.S.F. 慈善基金会（Y.Z. 和 X.R.）、美国国立卫生研究院（N.I.H.）院长新创新者奖 DP2 OD025926-01 以及考夫曼基金会资助。

所有涉及动物的实验操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行，并经卡内基梅隆大学机构动物护理与使用委员会批准。人体组织样本为商业获取。
1. 储备试剂和溶液的配制
注意：所用试剂的列表请参见材料表。
<ol>
	<li>配制凝胶用储备液。这些储备液将在凝胶步骤前立即混合使用。
	<ol>
		<li>使用 表1 中列出的组分配制单体储备液（每100 mL含 N,N-二甲基丙烯酰胺酸 [DMAA] 4 g、丙烯酸钠 [SA] 50 g、丙烯酰胺 [AA] 66.7 g、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 [Bis] 0.10 g、氯化钠 [NaCl] 33 g，并含有1×磷酸盐缓冲液 [PBS]）。将所有储备液组分溶于水或用水稀释。单体储备液可在4 °C下保存至少3个月。</li>
		<li>分别用水配制以下储备液：0.5% (w/w) 4-羟基-TEMPO (4HT)，用于抑制单体扩散进入组织过程中的凝胶化反应；以及10% (w/w) 四甲基乙二胺 (TEMED)，用于加速过硫酸铵 (APS) 引发的自由基生成，该溶液按10% (w/w) 配制。 
		&#8203;注意：上述储备液可分装为1–2 mL等份，在4 °C下保存不超过3个月；但APS溶液需在配制凝胶溶液前新鲜制备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过混合以下组分配制匀浆缓冲液（含1% w/v 十二烷基硫酸钠 [S.D.S.]、8 M 尿素、25 mM EDTA、2× PBS，pH 8，室温 [R.T.]）：1 g SDS、48.048 g 尿素、5 mL EDTA（0.5 M，pH 8）、20 mL 10× PBS、25 mL Tris（2 M）和0.75 g 甘氨酸，加水至总体积为100 mL。该缓冲液可根据需要按比例放大或缩小，可在室温下保存。</li>
</ol>
2. 归档和新鲜制备的临床组织切片的组织准备
注意：组织预处理步骤根据样本的制备方式而有所不同。
<ol>
	<li>对于甲醛固定石蜡包埋（FFPE）的临床样本，请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>将样本依次放入一系列溶液中（可使用玻璃切片染色缸或50 mL锥形管）：二甲苯、95%乙醇、70%乙醇和50%乙醇，最后放入双蒸水。每种溶液各使用两次，每次至少3分钟。用镊子将切片放入容器中，并加入15 mL相应溶液（足以覆盖样本）。将盖紧的锥形管水平置于摇床上，室温孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于已染色并封片于永久性载玻片上的样本，请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>将载玻片短暂浸入二甲苯中，然后使用适当工具（如刀片）小心移除盖玻片。如果盖玻片仍粘附牢固，请将切片继续置于二甲苯中，恢复至室温直至盖玻片松动。</li>
		<li>随后，按FFPE样本的处理方法进行处理（步骤2.1.1）。 
		注意：对于苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色的切片，苏木精和伊红染料在扩增过程中会丢失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于置于最佳切割温度（OCT）包埋剂中的未固定冷冻组织切片，先在−20 °C的丙酮中固定10分钟，然后在室温下用1×PBS溶液洗涤三次，每次10分钟。</li>
	<li>对于先前已固定的冷冻临床组织切片，将切片在室温孵育2分钟以融化OCT包埋剂，然后在室温下用1×PBS溶液洗涤三次，每次5分钟。</li>
</ol>
3. 多聚甲醛固定的 小鼠 脑组织 制备
<ol>
	<li>本方案适用于厚度为 30–50 µm 的小鼠脑切片。 
	注意：使用更大的切片也可能获得成功，但单体溶液的扩散和均一化可能需要更长时间。</li>
	<li>如果切片当前未保存在 1× PBS 溶液中（例如，保存在含 30% [v/v] 甘油和 30% [v/v] 乙二醇的 1× PBS 溶液中），则在 6 至 24 孔板中用 1× PBS 在室温下洗涤三次，每次至少 10 分钟。</li>
	<li>取一片未包被的玻璃显微镜载玻片。若载玻片一侧有包被，可用湿润的画笔检测未包被的一侧（通常包被侧的标签由磨砂玻璃制成，湿润后会变得较透明）。</li>
	<li>用画笔润湿未包被的载玻片。用画笔将小鼠脑组织从孔板中取出，并小心地将其转移至载玻片上，采用滚动动作确保组织平整。在所有切片完成贴附前，允许过量 PBS 保留在组织上。 
	注意：虽然单个载玻片可贴附多个组织切片，但当同时处理更多切片时（即使使用不同载玻片），必须格外注意防止切片完全干燥。</li>
	<li>使用实验室纸巾去除载玻片上大部分多余的 PBS。在每个组织切片周围保留少量液环，但其余区域应保持基本干燥。残留的液体将在凝胶单体溶液配制过程中覆盖组织。</li>
</ol>
4. 胶凝
注意：本方案适用于采用该技术处理的所有组织类型。
<ol>
	<li>在组织切片两侧放置间隔物（图2A），以防止组织受压。具体操作为：使用金刚石笔将盖玻片切成薄片作为间隔物，然后用少量水或1×PBS将其固定在载玻片上，或使用少量超级胶水进行固定。随后，轻轻地将间隔物放置在组织切片的两侧。</li>
	<li>配制最终凝胶溶液。通常每张组织切片约需200 µL，但每张载玻片上的体积不应超过800 µL，否则会导致溶液溢出。 
	注意：甲基丙烯醛（methacrolein）用于将生物分子锚定在凝胶中。然而，无需单独进行锚定步骤，可直接将甲基丙烯醛加入最终凝胶溶液中。
	<ol>
		<li>每份样品按以下顺序混合：200 µL单体溶液、0.5 µL的0.5% 4HT储备液（1:400稀释）、0.2–0.5 µL甲基丙烯醛（根据组织类型稀释至1:400–1:1,000；通常PFA固定的样本使用1:1,000稀释，FFPE临床样本使用1:400稀释）、2 µL的10% TEMED储备液（1:100稀释）以及5 µL的10%过硫酸铵（A.P.S.）储备液（1:40稀释）。 
		注意：应在使用前立即配制最终凝胶溶液。为防止提前凝胶化，请最后加入APS溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除组织切片上的多余液体，并将载玻片放入培养皿中。将新鲜配制的冷凝胶溶液全部加入样品上，在4 °C条件下孵育30分钟，使溶液充分扩散进入组织。</li>
	<li>小心地将另一张未包被的玻璃盖片覆盖在组织和凝胶溶液上方，避免产生气泡（图2B）。 
	注意：若组织上方出现气泡，可小心抬起盖片后重新放置。此外，聚合后溢出的单体溶液可修剪去除，不会对组织造成影响。</li>
	<li>确保聚合反应完成。该聚合过程可通过两种方式进行，结果相似。第一种方法：将样品置于湿润环境（如内含湿滤纸的密闭培养皿）中，在37 °C下孵育过夜。另一种方法可实现更快聚合：先在37 °C湿润环境中孵育2小时，随后在60 °C继续孵育1小时。</li>
</ol>
5. 样品消化与组织扩张
注意：本方案适用于所有类型的组织。
<ol>
	<li>佩戴护目镜，将剃刀刀片插入凝胶室的两片玻璃片之间，将其分开。 
	注意：玻璃片应很容易分开。如果凝胶的不同部分粘附在两片玻璃上，可使用画笔将凝胶引导至其中一片。如果凝胶在聚合过程中变得特别干燥，可将1× PBS涂抹在凝胶室外侧，但切勿将凝胶完全浸入液体中，否则会导致凝胶在组织均质化前膨胀，从而引起开裂。</li>
	<li>修剪组织周围的空白凝胶以最小化体积。对凝胶进行不对称切割，可在均质化后追踪凝胶的方向，因为样品将完全透明。</li>
	<li>用剃刀刀片轻轻将含有组织的凝胶从载玻片上抬起，并用画笔小心转移至2 mL离心管中。</li>
	<li>用预热至80 °C的均质化缓冲液（表2）将离心管加满至顶部。</li>
	<li>在80 °C下振荡孵育样品8小时（用于PFA固定的鼠脑）或60小时（大多数FFPE临床样本；见表3）。 
	注意：均质化时间取决于组织类型和固定方法。许多条件已得到验证，但对于其他情况，可能需要优化。</li>
	<li>将离心管中的内容物倒入6孔塑料细胞培养板的一个孔中。</li>
	<li>用移液器吸除变性缓冲液。</li>
	<li>为彻底去除水凝胶中残留的SDS，按以下步骤用1%非离子型表面活性剂（C12E10）溶液洗涤样品：室温下每次10分钟，至少洗涤三次；60 °C下洗涤60分钟；然后再次于室温下每次10分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将样品保存在含0.02%叠氮化钠的1× PBS中，4 °C保存，直至需要进行扩增后染色和成像。 
	&#8203;注意：此时，样品在每个维度上应已扩大约3–4.5倍，具体取决于组织类型。</li>
</ol>
6. 扩增后生物分子分析
<ol>
	<li>抗体染色 
	注意：本步骤遵循典型的免疫荧光（IF）/免疫组织化学（I.H.C.）染色方案。一抗和二抗的使用量取决于制造商建议的浓度或针对特定实验优化后的浓度。用户可根据需要自行替换不同的缓冲液。
	<ol>
		<li>将样品置于6孔细胞培养板的单个孔中，于室温下用1×PBS洗涤扩增的样品，每次10分钟，共洗涤三次，使用移液器转移液体。</li>
		<li>可选地进行封闭步骤（例如，含3%牛血清白蛋白和0.1% Triton-X100的1x PBS溶液），室温孵育至少1小时，或4 °C过夜。</li>
		<li>在染色缓冲液（例如，0.1% Triton-X100 1x PBS 或 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L 肝素）中加入一抗，37 °C 条件下避光孵育过夜。根据样品大小，使用 0.5–2 mL 染色液可充分覆盖凝胶。</li>
		<li>用1×PBS在室温下清洗样品，每次至少10分钟，共清洗三次。</li>
		<li>在选择的染色缓冲液中，37 °C 下孵育相应的二抗，孵育时间为 3 小时。</li>
		<li>用1×PBS在室温下清洗样品，每次至少10分钟，共清洗三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NHS-酯类全蛋白染色
	<ol>
		<li>将样品置于6孔板中，加入1-2 mL聚乙二醇（PEG 200）覆盖样品（用量以完全覆盖样品为宜）。 
		注意：组织应收缩并恢复至其原始未膨胀状态的大小（或接近该大小）。</li>
		<li>使用荧光染料偶联的NHS酯，按13.3–80 µg/mL浓度溶于1–2 mL染色缓冲液（例如1× PBS、2× S.S.C.或100 mM碳酸氢钠溶液）中，室温避光孵育3小时。</li>
		<li>用1×PBS在室温下清洗样品，每次至少10分钟，共清洗三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂质染色 
	注意：由于固定过程中脂质会丢失，因此福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本不适用于扩增后脂质染色。
	<ol>
		<li>用1×PBS在室温下清洗样本，每次至少10分钟，共清洗三次。</li>
		<li>将常规脂溶性染料（DiO、DiI 或 DiD）用 2 mL 0.1% TritonX-100/1x PBS 稀释 200 倍，在室温下孵育 72–96 小时。</li>
		<li>用1x PBS至少洗涤三次</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）
	<ol>
		<li>将均质化的凝胶样品置于预热至60 °C的杂交缓冲液中孵育30分钟。</li>
		<li>制备FISH杂交缓冲液：将2x S.S.C.（300 mM NaCl，30 mM 柠檬酸钠，pH 7.0）、10%（v/v）硫酸葡聚糖、20%（v/v）碳酸乙烯酯和0.1%（v/v）Tween20混合。</li>
		<li>将凝胶样品与杂交缓冲液在45 °C下过夜孵育，杂交缓冲液中含针对目标基因的FISH探针（每条寡核苷酸10 pM，每10 kb至少20条探针）。</li>
		<li>用严格洗涤缓冲液（2× S.S.C. 和 0.1% Tween20）在 45 °C 下每次洗涤 15 分钟，共洗涤两次。</li>
		<li>用严谨性洗涤缓冲液在37 °C下再洗涤两次，每次10分钟。</li>
		<li>最后，在室温下用1×PBS洗涤至少三次，每次10分钟。</li>
		<li>样本可直接用于成像，或在 4 °C 条件下保存于 1x PBS + 0.02% 叠氮化钠中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完整的组织扩张与荧光成像 
	注意：Magnify 可实现的扩增倍数因组织类型和扩增方法而异（完整总结见于 表3）。然而，作为一般性估算，Magnify 样本在 1x PBS 中将扩张 3-4.5 倍，在 ddH₂O 中稀释至 1:50 的 PBS 中将扩张 5-7 倍2O，以及在ddH中增加8-11倍2O. 成像所需的最优膨胀倍数取决于每个实验的具体需求。膨胀倍数具有高度可调性，因此单个样品可多次进行膨胀与收缩，以实现不同尺度下的成像。
	<ol>
		<li>使用画笔将用 PBS 扩展了 4 倍的样品转移至玻璃底 6 孔成像板中。对于进一步扩展的样品，可通过将其切割成较小片段，或轻轻放入配有薄层柔性塑料片的大型玻璃底成像板中进行转移。</li>
		<li>使用常规的宽场显微镜、共聚焦显微镜或其他选定的成像系统进行荧光成像。用实验室纸巾轻轻吸除凝胶周围多余的液体，可防止成像过程中凝胶移动。此外，可在成像前于玻璃表面涂覆0.1%的聚-L-赖氨酸，以固定凝胶。 
		注意：聚-L-赖氨酸的应用会使凝胶在接触时完全固定。因此，必须小心操作，确保凝胶在贴附到玻璃表面时无折叠或拉伸。此外，应避免凝胶在涂有聚-L-赖氨酸的玻璃上完全干燥，否则可能导致后续难以剥离；同时，在凝胶仍通过聚-L-赖氨酸附着于玻璃时，不得在PBS中使其收缩，以免造成凝胶或组织损伤。</li>
		<li>成像后，用1x PBS对样品进行至少三次洗涤，每次10分钟，以缩小样品体积。不建议将样品长期保存在ddH₂O中。2由于荧光信号的降解，特别是用脂溶性染料染色的完全扩增样品，应在扩增后尽快成像，以防止染料在水中解离。</li>
		<li>将样品保存在含有0.02%叠氮化钠的1×PBS中，4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Expansion Microscopy for Robust 11-Fold Expansion

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+A+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+R.N.A.+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+R.N.A.+detection+approach+with+super-resolution+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), 165(2016).</li>
<li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+R.N.A.s+with+MERFISH+and+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4847(2018).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-ExM+enables+expansion+microscopy+for+all+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules.</a> Nature Methods. 18, 107-113 (2021).</li>
<li>White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Lipid expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).</li>
<li>Chang, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-preserving+magnified+analysis+of+proteome+%28eMAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP).</a> Science Advances. 7 (46), (2021).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. , (2023).</li>
<li>Gao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+stimulated+emission+depletion+microscopy+%28ExSTED%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED).</a> ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).</li>
<li>Zwettler, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+resolution+imaging+by+post-labeling+expansion+single-molecule+localization+microscopy+%28Ex-SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM).</a> Nature Communications. 11, 3388(2020).</li>
</ol>

作者声明存在以下竞争性财务利益：Y.Z.、A.K.、Z.C. 和 B.R.G. 发明了多项与 Magnify 和 ExM 相关的技术。

本文介绍了Magnify技术方案17，这是一种扩展显微技术（ExM）的变体，能够通过单一化学锚定剂保留多种生物分子，并利用热变性处理将难以处理的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本扩展至原来的11倍。本方案与其他ExM方案的关键区别在于采用了重新配制的凝胶，该凝胶即使在完全膨胀后仍保持良好的机械强度，同时使用甲基丙烯醛（methacrolein）作为生物分子的锚定剂。本方案中最关键的步骤如下：1）终末凝胶溶液的组成；2）凝胶化步骤的时间控制；3）凝胶化反应室的设置；4）样本均质化的参数设定；5）在扩增后染色前，必须充分洗去样本中的十二烷基硫酸钠（SDS）。
该方案最关键的参数是终末凝胶溶液的组成，尤其是生物分子锚定剂甲基丙烯醛的浓度。不同类型的组织需要不同的甲基丙烯醛浓度（表3），因此必须谨慎选择与待扩增样本相匹配的浓度。甲基丙烯醛锚定过度会导致扩增倍数降低，并减少扩增后染色可用的表位；而锚定不足，尤其是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的临床样本中，可能导致组织开裂或形变。因此，对于尚未验证的组...

生物系统&#160;在结构上具有异质性，从肢体和器官到纳米尺度的蛋白质均是如此。因此，要全面理解这些系统的运行机制，需要在这些不同尺度上进行可视化观察。然而，光的衍射极限使得在常规荧光显微镜下观察小于约200-300 nm的结构面临挑战。此外，尽管诸如受激辐射损耗（STED）、光激活定位显微镜（PALM）、随机光学重建显微镜（STORM）和结构照明显微镜（SIM）等光学超分辨率方法1,2,3功能强大，但它们自身也存在挑战，例如需要昂贵的硬件和试剂，且通常成像速度较慢，在三维空间中对大体积样本成像的能力较差。
扩展显微技术4 （扩展显微技术，ExM）通过将生物分子共价锚定于可吸水膨胀的聚合物凝胶中，并通过物理方式将其分离，从而在常规光学显微镜下实现对原本受光衍射极限限制的结构的分辨，为突破光学衍射极限提供了另一种途径。自该技术首次发表以来，已发展出多种ExM实验方案变体。&#160;ExM 出现还不到十年，这些方案允许蛋白质的直接整合5,6,7，RNA8,9,10，或脂质11,12,13 通过改变化学锚点或进一步扩增样品（从而提高有效分辨率），以单步方式进入凝胶网络14 或多个迭代步骤15,16直到最近，还没有一种扩张显微镜（ExM）方案能够在使用单一市售化学锚定剂的同时，保留这三类生物分子，并形成机械强度足够、可在单次扩张过程中膨胀约10倍的凝胶。
本文介绍了 Magnify17，这是扩展显微技术（ExM）工具库中的最新成员，采用甲基丙烯醛作为生物分子锚定剂。甲基丙烯醛与组织形成的共价键类似于多聚甲醛的作用，可确保多种类别的生物分子保留在凝胶网络中，而无需使用多种特异性或定制的锚定试剂。此外，该技术可实现广泛组织样本最高达11倍的膨胀，包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本等 notoriously 难处理的样品。以往扩展此类机械刚性样本的方法需要强烈的蛋白酶消化，导致样本膨胀后无法对目标蛋白进行抗体标记。相比之下，本技术采用高温变性溶液实现 FFPE 临床样本的膨胀，从而在凝胶中完整保留蛋白质的表位，可在膨胀后用于靶向成像（图1）。

<table><tbody><tr><td>4-羟基-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>176141</td><td>抑制剂</td></tr><tr><td>6孔玻璃底培养板 (#1.5 盖玻片)</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td>凝胶单体组分</td></tr><tr><td>过硫酸铵 (APS)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>引发剂</td></tr><tr><td>DAPI (1 mg/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>十乙二醇单十二醚 (C12E10)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9769</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>金刚石刀片 No. 88 CM</td><td>General Tools</td><td>31116</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&lt;br/&gt;酸 (EDTA) 0.5 M</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td>匀浆缓冲液组分</td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td>匀浆缓冲液组分</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133035</td><td>锚定剂</td></tr><tr><td>显微盖玻片 #1 (24×60 mm)</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>显微盖玻片 #1.5 (24×60 mm)</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-&lt;br/&gt; 四甲基乙二胺 (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>加速剂</td></tr><tr><td>N,N&amp;prime;-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7279</td><td>凝胶单体组分</td></tr><tr><td>N,N-二甲基丙烯酰胺 (DMAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>274135</td><td>凝胶单体组分</td></tr><tr><td>Nunclon 4孔×5 mL 多孔细胞培养皿</td><td>Thermo Fisher</td><td>167063</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon 6孔细胞培养皿</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; 15 mL&amp;nbsp;离心管</td><td>Thermo Fisher</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; 50 mL&amp;nbsp;离心管</td><td>Thermo Fisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS), 10x 溶液</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇&amp;nbsp;200</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3015</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K (分子生物学级)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fischer Scientifc</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>SafeLock 微量离心管 1.5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3457</td><td></td></tr><tr><td>SafeLock 微量离心管 2.0 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3459</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸钠 (SA)</td><td>AK Scientific</td><td>R624</td><td>凝胶单体组分</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠二水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532-1KG</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>匀浆缓冲液组分</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP152-1</td><td>匀浆缓冲液组分</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>匀浆缓冲液组分</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

通用分子保留的11倍扩展显微技术

Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy

生物样本的纳米级成像有助于加深对疾病发病机制的理解。近年来，扩张显微镜技术（ExM）已被证明是一种有效且低成本的光学超分辨率显微镜替代方案。然而，该技术受限于需要特定且通常是定制的锚定试剂，以在凝胶中保留不同类别的生物分子，同时也难以处理标准的临床样本形式，例如福尔马林固定石蜡包埋组织，尤其是在需要较大扩张倍数或保留蛋白质表位的情况下。本文介绍了一种名为 Magnify 的新型 ExM 方法，可在多种组织类型中实现高达 11 倍的稳定扩张。通过使用甲基丙烯醛作为组织与凝胶之间的化学锚定剂，Magnify 能够在凝胶中保留多种生物分子（如蛋白质、脂质和核酸），从而可在常规光学显微镜上对组织进行广泛的纳米级成像。本实验方案描述了确保组织稳定且无裂纹扩张的最佳操作实践，以及处理和成像高度扩张凝胶的实用技巧。

如果实验方案成功完成（图1），样品在热变性后应呈现清澈且平整的状态；任何折叠或起皱现象均表明匀质化不完全。成功扩增的样品在1x PBS中体积将扩大3-4.5倍，在ddH2O中完全扩增后体积将扩大8-11倍。图3展示了采用本方案处理的5 µm厚福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人肾组织样品在扩增前后的示例图像，该样品成功实现了超过8倍的扩增。组织首先使用针对ACTN4的抗体以及DAPI染色，以显示细胞核DNA。随后使用转盘共聚焦显微镜进行成像（图3A）。接着按照上述方案对组织进行处理，包括扩增后对相同靶标重新染色，并在水中完全扩增（图3B）后再次成像。在热变性完成后，除蛋白质外的其他生物分子也可进行染色和成像，如图4所示。脂溶性染料可用于揭示小鼠脑组织中的细胞膜和线粒体膜结构（图4A...

本文介绍了一种扩展显微镜技术（ExM）的新版本——Magnify，该技术经过改进后可实现高达11倍的扩展，能够保留多种生物分子类别，并适用于多种组织类型。该方法使得利用常规的衍射受限显微镜即可对生物分子的纳米级构型进行研究。

生物样本的纳米级成像可增进对疾病发病机制的理解。近年来，扩展显微技术（ExM）已……

我们正致力于为研究人员寻找简便且低成本的方法，以突破衍射极限的分辨率对生物样本进行成像，特别是在神经科学和临床病理学领域。近年来，许多扩展显微技术的发展涉及改进凝胶化学以实现样本更大幅度的膨胀、更换锚定分子以可视化不同靶标，以及利用加热变性来保存蛋白质表位。通过创新的 Magnify 方法，这一稳健的扩展显微技术可实现对各类生物或临床样本的纳米级成像。它通过消除对专用设备的需求，简化了超分辨率显微成像，同时以高达15纳米的分辨率保留复杂的生物结构特征，从而提高了全球实验室的可及性和实用性。以往，用户必须根据所要成像的组织和生物分子类型，尝试不同的膨胀显微成像技术。Magnify技术能够在多种生物分子和组织类型中实现高分辨率成像，无需特定的锚定步骤或专用设备，因此填补了纳米尺度成像领域的一项重要空白。扩增技术可将较难处理的临床样本体积扩大四倍以上，同时保留蛋白质表位，从而实现对人类疾病更精确的研究。其化学锚定方法还能保存多种生物分子，因此在模拟模型的基础研究中具有应用价值。扩增技术代表了一种无需复杂光学系统或专用设备即可实现生物分子和完整样本纳米级成像的方法。它可适用于多种成像方式和扩展显微技术策略，能够实现便捷且经济高效的纳米级成像，有望加速药物治疗和疾病研究，同时可能变革组织图谱的构建。Magnify 为科研提供了无限可能。当前的研究重点包括拓展组织位点、在纳米尺度上探究病理性的真人样本，以及研究学习和疾病过程中大脑发生的最微小尺度变化。首先取准备好的存档新鲜组织或经多聚甲醛固定的 小鼠脑组织切片。使用金刚石笔切割载玻片制成垫片，然后用少量水、PBS 或超级胶水将其固定在切片上。将间隔片轻轻放置在组织两侧。在使用前立即混合试剂，制备终末凝胶溶液。从组织切片上除去多余溶液后，将载玻片放入培养皿中。将新配制的冷凝胶溶液加入样品中，并在4°C下孵育30分钟，使溶液扩散进入组织。小心地将另一张未包被的玻片覆盖在组织和凝胶溶液上，避免产生气泡。将样品置于湿润环境中，于37°C孵育过夜，使其充分聚合。首先，取一张带有聚合后的存档新鲜组织或经多聚甲醛固定的 小鼠脑组织的载玻片。佩戴护目镜后，使用剃须刀片将凝胶室的两片玻璃载玻片分开。修剪组织周围的空白凝胶以最小化体积，并确保进行不对称切割，以便在均质化后追踪凝胶的方向。用刀片轻轻将含有凝胶的组织从载玻片上提起，转移到一个2毫升离心管中。加入预热至80摄氏度的匀浆缓冲液至管口满溢。然后在80摄氏度下振荡孵育样品8至60小时。将离心管中的内容物倒入六孔塑料细胞培养板的一个孔中，并用移液管除去变性缓冲液。为彻底去除水凝胶中残留的SDS，用1%非离子型表面活性剂溶液洗涤样品。最后，将样本保存在 PBS 和 0.02% 叠氮化钠中，置于 4 摄氏度环境下。首先，取消化后膨胀的存档或新鲜临床组织样本，将其放入六孔细胞培养板的一个孔中，开始进行抗体染色。在室温下用 PBS 每次洗涤样本 10 分钟，共洗涤三次。根据样品大小，向染色缓冲液中加入0.5至2毫升的一抗，以充分覆盖凝胶。在37摄氏度下孵育过夜。然后在室温下用PBS洗涤样品三次，每次10分钟。加入相应的二抗，在37摄氏度的染色缓冲液中孵育三小时。按照之前的方法重新洗涤样本，然后在六孔板中向样本加入一到两毫升聚乙二醇。在室温下用荧光染料标记的NHS酯对样本染色三小时。孵育结束后，用 PBS 洗涤样本三次。接下来，进行脂质染色时，取已用 PBS 洗涤三次的扩增组织样本。将常规的亲脂性染料用 2 毫升 0.1% Triton X-100 或 PBS 稀释 200 倍，室温下孵育 72 至 96 小时，然后用 PBS 至少洗涤三次。进行FISH时，通过混合2x SSC、10%硫酸葡聚糖、20%乙烯碳酸酯和0.1% Tween 20来配制杂交缓冲液。将匀质化的凝胶样品置于60摄氏度预热的杂交缓冲液中孵育30分钟。随后，在含有10皮摩尔针对目标基因的FISH探针的杂交缓冲液中，于45摄氏度过夜孵育凝胶样品。在45摄氏度下用严谨性洗涤缓冲液洗涤样品两次，每次15分钟；随后在37摄氏度下洗涤两次，每次10分钟。用PBS洗涤样品三次，每次10分钟，然后进行成像，或将样品保存在含0.02%叠氮化钠的PBS中，置于4摄氏度环境下。为充分扩增并成像组织，将已在PBS中扩增四倍的样品转移至玻璃底六孔成像板中。如果样品进一步膨胀，则将其切成更小的片段。在玻璃表面涂布0.1%的多聚-L-赖氨酸。将样品放置在载玻片上，并用实验室纸巾吸除凝胶周围多余的液体，以防止成像过程中凝胶移动。随后，使用传统的宽场显微镜、共聚焦显微镜或其它选定的成像系统进行荧光成像。成像后，用 PBS 缓冲液对样品进行至少三次、每次 10 分钟的洗涤，因为长期保存于去离子水中会导致荧光信号降解。最后，将样品保存在含有 0.02% 叠氮化钠的 PBS 缓冲液中，置于 4 摄氏度环境下。小鼠脑组织完全扩大的共聚焦图像实现了对蛋白质以及细胞和线粒体膜结构的可视化观察。同时，也鉴定了经福尔马林固定和石蜡包埋的人类淋巴结组织中的核酸。在肾组织切片扩大3.5倍后，观察到了无裂纹的扩大的肾小球。然而，由于锚定或均质化不足，另一份肾脏切片出现了裂纹、变形以及标记靶标的丢失。

universal-molecular-retention-with-11-fold-expansion-microscopy

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

采用 11 倍扩增显微镜的通用分子保留

对临床组织样本进行纳米级成像有助于加深对疾病发病机制的理解。扩展病理学（ExPath）是扩展显微技术（ExM）的一种改进版本，经过优化可兼容常规临床组织样本，从而利用传统的衍射受限显微镜研究生物分子的纳米级空间排布。...

通过物理性各向同性膨胀实现人体组织切片的纳米级成像

本方法通过扩增显微技术实现荧光标记细胞蛋白的可视化，可在常规显微镜下达到70...

使用扩展显微镜技术对足细胞蛋白nephrin、actin和podocin进行成像

本文演示了一种标签保留型扩增显微镜技术（LR-ExM）的实验方案。LR-ExM采用了一种新型的三功能锚定分子，与此前报道的扩增显微镜技术相比，具有更高的标记效率。...

标签保留型扩展显微技术（LR-ExM）实现超分辨率成像与高效标记

本文介绍了一种在早期Drosophila胚胎中实施膨胀显微技术的实验方案，旨在利用常规激光扫描共聚焦显微镜实现超分辨率成像。...

使用扩展显微镜技术对整体安装的 Drosophila 胚胎进行物理放大以实现超分辨率成像

本研究展示了一种详细的三相超结构扩展显微镜操作方案 体外 生活史阶段 克氏锥虫，恰加斯病的病原体。我们包含了细胞骨架蛋白和全蛋白质组标记的优化技术。...

体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

本文提出了一种简单的方法，结合代谢寡糖工程、点击化学和扩增显微技术，利用常规显微镜设备即可实现对细胞内唾液酸化N-糖蛋白的高分辨率生物成像。...

利用点击化学与扩展显微技术可视化细胞内唾液酸化修饰

本文介绍了一种结合冷冻固定与膨胀显微技术的详细实验方案（Cryo-ExM），该方法可实现高分辨率成像，并在适用于多种生物样本的同时保持其结构完整性。生物样本经冷冻、包埋于可膨胀聚合物中、变性、膨胀及免疫标记后，可在标准光学显微镜下实现超分辨率成像。...

扩展显微技术：利用常规显微镜实现高分辨率荧光成像

在本视频中，我们演示如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜对金鱼视网膜双极细胞中单个突触小泡的胞吐及转运过程进行标记与可视化观察。...

使用全内反射荧光显微镜成像视网膜双极细胞中的胞吐作用

本文展示了在活体细菌细胞上进行单分子荧光显微镜观察的实验方案，以实现对功能性分子复合物的检测、追踪和定量分析。...

可视化单个分子复合物 在体 内 使用先进的荧光显微镜技术

本方案展示了一种简单的单分子荧光显微镜技术，用于实时观察单个复制体进行的DNA复制过程。...

利用荧光显微镜观察单分子DNA复制

学习Magnify扩展显微镜技术，实现生物样本11倍放大并保持多种生物分子完整，适用于神经科学与临床病理学研究。该方法无需专用设备即可获得15纳米分辨率，助力药物发现与疾病研究。

通用分子保留的11倍扩展显微技术

探索更多视频