Name: 大鼠肠道类器官的产生和操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 了解大鼠肠道类器官的培养与基因操作方法。本研究建立了可长期培养的大鼠肠道类器官模型，支持慢病毒感染和瞬时转染等遗传操作技术，为肠道生物学研究提供了更接近人体生理的实验工具。

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感谢Sumigray实验室和Ameen实验室成员的深入讨论。本工作获得了Charles H. Hood基金会儿童健康基金以及囊性纤维化基金会（资助号：004741P222）对KS的资助，以及美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所对NA的资助（资助号：2R01DK077065-12）。

Rat Intestinal Crypts Isolation and Intestinal Organoids Generation

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<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+development+in+the+retina+and+inner+ear%3A+control+by+Norrin+and+Frizzled-4%2C+a+high-affinity+ligand-receptor+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair.</a> Cell. 116 (6), 883-895 (2004).</li>
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</ol>

大鼠肠道类器官模型的建立保留了器官中重要的功能特性 体内 是临床前测试、药物筛选和功能分析的有力工具。 体外 模型可并行使用 体内 由于大鼠肠道尺寸较大、与人类具有相似的生理特征，且在某些情况下更适合作为疾病模型，因此常被选为临床前胃肠病学研究的首选模型38本文概述了一种可靠的分步操作方案，用于大鼠肠隐窝的分离、大鼠肠类器官的建立与长期培养，以及后续应用，包括功能性的佛司可林肿胀实验、整体免疫荧光染色、二维单层培养和慢病毒介导的遗传操作。在许多疾病研究背景下，当小鼠模型的病理生理学特征不适用时，大鼠肠类器官可能更具相关性，并且相较于小鼠肠类器官，可能更接近人类肠道生理，提供更优的模型系统。
为了建立可传代和扩增的长期类器官培养体系，关键在于确定维持肠道上皮细胞增殖所需的核心生长因子。小鼠类器官通常在含有EGF、R-spondin和Noggin的简单混合培养基中培养，尽管已有报道指出Noggin在肠道类器官培养中并非必需39。条件培养基可替代重组生长因子，其中最常用的细胞系包括L-WRN（可分泌Wnt3a、Rspondin-3和Noggin）39、L-Wnt3a以及HA-Rspondin1-Fc 293T细胞40。L-WRN条件培养基不仅足以支持小鼠肠道39类器官的生长，还可支持多种家畜和伴侣动物肠道类器官的生长，这些动物包括狗、猫、鸡、马、牛、羊和猪12。然而，人类肠道类器官在生长因子需求方面存在显著差异，其扩增生长阶段（即从小球体向大球体发育）与分化阶段（即分化细胞类型的生成与成熟）需要不同的培养基配方10。大鼠肠道类器官的培养基需求与人类肠道类器官的扩增生长培养基非常相似，但值得注意的是，大鼠类器官在此培养条件下既能生长又能分化，从而显著简化了其培养要求。尽管我们最初的尝试集中于在L-WRN条件培养基中建立和培养大鼠肠道类器官，但长期培养效果不稳定，大鼠肠道类器官系表现出生长不够稳健的问题（数据未显示）。这可能是因为L-WRN细胞系被设计为分泌R-spondin 3，而本文推荐使用的293T-Rspo1细胞系则被设计为分泌R-spondin 1。大鼠和人类类器官可能更偏好R-spondin 1，这或许可以解释大鼠类器官系在L-WRN条件培养基中培养失败的原因。
为了最接近地模拟 体内 环境，建立能够支持干细胞存活、维持和增殖，并能保持细胞更新及同时向不同类型细胞分化的类器官培养条件至关重要。因此，必须严格滴定并控制重组蛋白和/或条件培养基中蛋白质的浓度，以实现这一理想平衡。特别是，Wnt 信号通路的最适水平对于避免肠类器官培养失败至关重要。条件培养基中 Wnt 水平过低将无法支持生长，导致干细胞丢失并最终引起类器官死亡；而 Wnt 过度激活则会导致类器官呈囊状且无法分化10。尽管此处未详细说明，强烈建议使用 Wnt 报告基因荧光素酶检测方法（如 Topflash 细胞系）41 对每一批 L-Wnt3a 和 293T-Rspo1 条件培养基进行测试。既往研究指出，理想的 L-Wnt3a 培养基批次在浓度为 12.5% 时应产生约 15 倍的信号增强，在 50% 浓度下应产生约 300 倍的信号增强，相对于 1% L-Wnt3a 而言10。由于大鼠类器官对培养条件（尤其是 Wnt 激活水平）的敏感性高于小鼠类器官，这些额外的质量控制步骤可显著提高大鼠类器官培养的稳健性和可靠性。由于目前尚无可用于检测 Bmp 活性及 Noggin 条件培养基中 Noggin 相对浓度的类似报告细胞系，建议在可能的情况下使用重组 Noggin，以精确控制 Noggin 水平。虽然小鼠肠类器官可在无 Noggin 的条件下生长和维持39，但该方法尚未在大鼠肠类器官培养中尝试。
除了细胞培养的基本要求外，成功建立大鼠类器官系的关键在于隐窝分离过程中高效去除已分化的绒毛结构。绒毛成分污染程度较高会导致隐窝死亡，可能是由于濒死细胞释放的信号分子或对关键因子的消耗所致。为了精确且稳定地从上皮组织制备物中去除这些已分化的绒毛，建议在体视显微镜辅助下进行上皮细胞的分离操作。通过显微镜观察上皮组织的释放情况，可明确判断何时弃去PBS并更换新的溶液（图1）。在绒毛未充分去除前，不应收集隐窝。绒毛细胞属于终末分化细胞，无法在培养中形成类器官。此外，在后续对大鼠肠道类器官进行传代培养及其用于任何下游应用时，均需格外小心。若在解离试剂中孵育时间过长（10分钟），将导致显著的细胞死亡，并造成类器官系的丢失。
在此描述了一种从大鼠类器官生成肠道单层细胞的简单且快速的实验方案。EME和I型胶原基质对上皮细胞具有不同的影响，可根据研究目的加以利用。EME可促进单个细胞的快速高效黏附以及细胞突起的形成；相比之下，I型胶原包被表面则会延缓这些过程。当单层细胞达到约80%融合度时，生长在EME上的细胞会重新开始形成三维类器官结构，但因缺乏足够的物理和化学支持而无法持续生长。通过将EME上的单层细胞维持在50%–80%融合度，可防止其逆转为类器官状态。在单层细胞的顶侧表面添加稀释的EME，可促进细胞的快速恢复及紧密连接的形成 从头合成 类器官，更快速且更易形成汇聚区域。在I型胶原表面，细胞可形成均匀的单层并产生小的细胞簇。然而，在单层细胞上添加I型胶原不足以诱导类器官形成。将胚胎提取物（EME）添加至单层表面时必须进行稀释，因为新生类器官需要克服更强的机械阻力。然而，这种稀释的EME无法支持大型类器官的 robust 形成。任何 从头合成 自然从表面脱落的大鼠类器官必须立即移除并转移至未稀释的EME中，以恢复其结构支持和生长。由于此阶段类器官体积较小，不建议进行传代，直至类器官生长状态趋于稳定。目前尚不清楚EME能够支持类器官重新形成，而I型胶原是否具备此能力的潜在生物学机制。然而，已有报道称在三维胶原中培养的细胞无法形成出芽状类器官。42,43 或支持长期维持。市售的EME产品是细胞外蛋白的异质性混合物，主要成分为层粘连蛋白和IV型胶原蛋白44因此，蛋白质组成的差异以及上皮细胞利用不同细胞复合物与细胞外基质相互作用的能力，可能使得在EME中发生重塑，但在胶原蛋白I中则不能。尚未验证源自胶原蛋白I的单层细胞是否可用于EME中以支持类器官的形成与生长。
本文介绍了大鼠肠道类器官模型的遗传操作方法，并概述了3D类器官的慢病毒转导以及2D单层培养物的瞬时转染方案。为克服慢病毒转导类器官效率较低的问题，研究人员开发了一种针对2D单层培养物的瞬时转染方案。单层细胞具有扁平的形态和暴露的顶膜区域，使病毒和含DNA的复合物更易于进入。本研究采用pLJM1-EGFP载体表达EGFP报告基因，以验证该技术的有效性。转染后24小时即可观察到GFP报告基因的表达，并可在单层细胞中维持5至6天。未来针对单层细胞进行慢病毒转导的研究有望获得高于3D类器官转导的效率。利用上述方案，可将被感染的2D单层细胞重新诱导形成3D类器官，从而有助于建立稳定表达的细胞系。只要操作得当，大鼠肠道类器官可在体外长期稳定培养超过一年，经历多次传代仍保持稳定，可进行冻存、成功复苏，并通过慢病毒转导实现遗传修饰，从而满足了对一种易于操作且具有生理相关性的in vitro肠道类器官模型的需求，该模型在生理特性上与人类具有较高的相关性。

人类小肠上皮结构和细胞组成复杂，反映了其生理功能。小肠的主要功能是吸收通过肠腔的食物中的营养物质。1为最大化这一功能，肠黏膜表面形成指状突起结构，称为绒毛，可增加吸收表面积；同时还形成杯状隐窝结构，称为隐窝，用于容纳和保护干细胞。在上皮层内，生成多种特化的吸收细胞和分泌细胞，以执行不同的功能1由于这种复杂性，利用高代次转化的永生化细胞系来模拟肠道等组织一直存在困难。然而，干细胞尤其是成体干细胞及其分化机制的研究，推动了三维肠道类器官培养技术的发展。类器官模型的应用已彻底改变了该研究领域，部分原因在于其能够重现完整肠道中某些结构特征和细胞类型的异质性。肠道类器官可实现长期培养 体外 由于活性干细胞群体的维持2.
肠道类器官已迅速成为研究干细胞生物学、细胞生理学、遗传性疾病和营养学的可调模型3,4，同时也被用作开发新型药物递送方法的工具5。此外，来源于患者的类器官正被用于疾病建模、药物发现以及个体化治疗筛选等多个领域6,7,8,9。然而，人类肠道类器官仍面临诸多挑战。组织来源的可获得性、机构审查委员会（IRB）审批要求以及伦理问题限制了人类样本的广泛应用。此外，由肠隐窝来源的人类肠道类器官需要两种不同的培养条件，分别用于维持未分化的干细胞或诱导成熟细胞类型的分化10。这与体内（in vivo）情况形成对比，在体内环境中，干细胞与成熟的分化细胞类型同时存在，并持续生成和维持1。相比之下，小鼠肠道类器官在成分较简单的生长因子混合物中培养，无需更换培养基成分，即可在同一培养环境下同时维持干细胞和分化细胞2,11。然而，小鼠肠道与人类肠道之间存在关键差异，使得小鼠类器官在许多情况下并非理想的模型。总体而言，目前已成功在体外培养出多种大型哺乳动物的肠道类器官，包括马、猪、绵羊、牛、狗和猫，其培养条件更接近小鼠肠道类器官，而非人类肠道类器官的培养条件12。小鼠与人类类器官在生长因子需求上的差异，可能反映了两者在干细胞微环境组成以及干细胞存活、增殖和维持所需条件方面的不同。因此，亟需一种易于获取的类器官模型系统，该系统应具备以下特点：1）细胞组成高度类似于人类肠道；2）其干细胞对生长因子的需求与人类肠道类器官相似；3）能够持续维持未分化和已分化细胞区室。理想情况下，该系统应来源于常用的临床前动物模型，以便体外（in vitro）实验结果可与体内（in vivo）实验相互印证并联合使用。
大鼠是肠道生理学和药理学研究中常用的临床前模型，因为其肠道生理和生化特性与人类非常相似13，尤其是在肠道通透性方面14。与小鼠相比，大鼠体型相对较大，更便于进行外科手术操作。尽管有时也会使用包括猪在内的大型动物模型，但大鼠模型成本更低，饲养所需空间较小，且有多种标准化品系可从商业渠道 readily 获得15。使用大鼠模型的一个缺点是，与小鼠相比，适用于体内（in vivo）研究的遗传工具包尚未充分发展，构建新的大鼠品系（包括基因敲除、基因敲入和转基因品系）通常成本过高而难以实现。建立并优化稳健的大鼠肠道类器官模型，将能够在保持重要生理相关性的可及性模型中，实现基因操作、药理处理以及高通量研究。然而，不同啮齿类动物类器官模型之间的优势高度依赖于所研究的具体过程或基因；某些在人类中存在的基因在小鼠中可能是假基因，但在大鼠中则不是16,17。此外，单细胞RNA测序（single-cell RNAseq）正不断揭示出物种特异性的细胞亚型18,19,20。最后，大鼠和小鼠的肠道疾病模型在表型上常常表现出显著差异21,22，因此必须选择更能准确模拟人类症状和疾病进程的模型用于后续研究。建立大鼠肠道类器官模型为研究人员提供了更大的灵活性和选择空间，以根据其具体研究条件选用最合适的模型系统。本文在现有方案23,24的基础上，进一步拓展了大鼠肠道类器官的构建方法，并详细阐述了从十二指肠或空肠建立和维持大鼠肠道类器官的实验流程。此外，还描述了若干下游应用技术，包括慢病毒转导、整体染色（whole mount staining）以及佛司可林诱导肿胀实验（forskolin swelling assays）。

<table><tbody><tr><td>3-D 培养基质大鼠 I 型胶原蛋白</td><td>Cultrex/R&amp;D Systems</td><td>3447-020-01</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning/Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM/F12 培养基</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2942-20ML</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（50X），无血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor 冻存液</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-1061</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T 细胞</td><td>R &amp;D Systems</td><td>3710-001-01</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>16-000-044</td><td></td></tr><tr><td>胃泌素 I（人源）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>温和细胞解离试剂</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型 Matrigel，无酚红</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021</td><td></td></tr><tr><td>羊毛脂</td><td>Beantown Chemical</td><td>144255-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>L-Wnt3a 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂（100X）</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td>透明薄膜</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pLJM1-EGFP</td><td>Addgene</td><td>19319</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺盐酸盐（PEI）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>764965</td><td></td></tr><tr><td>对苯二胺&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics/Thermo Fisher</td><td>417481000</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>VWR</td><td>J593-25mg</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF2 蛋白</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-250ug</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IGF-1 蛋白</td><td>Biolegend</td><td>B356441</td><td></td></tr><tr><td>重组人 Noggin 蛋白</td><td>R &amp;D Systems</td><td>6057-NG-100</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 EGF 蛋白</td><td>Thermo Fisher</td><td>PMG8041</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley 大鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td>品系 001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 二盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠肠道类器官的生成与操作

Generation and Manipulation of Rat Intestinal Organoids

在利用类器官评估生理功能和细胞命运决定时，重要的是要使用能够紧密模拟 体内 在多种研究背景下，患者来源的类器官被广泛用于疾病建模、药物发现以及个体化治疗方案的筛选。小鼠肠道类器官常被用于研究肠道功能/生理特性以及干细胞动态/命运决定的相关机制。然而，在许多疾病研究中，由于大鼠在疾病病理生理方面与人类具有更高的生理相似性，通常比小鼠更适合作为模型动物。大鼠模型的应用受限于目前可用的遗传学工具较少 体内，且大鼠肠道类器官已被证明较为脆弱，难以进行长期培养。本文在已有发表方案的基础上，建立了从十二指肠和空肠 robust 地生成大鼠肠道类器官的方法。我们概述了大鼠肠道类器官的多种下游应用，包括功能性的肿胀实验、整体染色（whole mount staining）、二维肠类器官单层的构建以及慢病毒转导。大鼠类器官模型为该领域提供了一种切实可行的解决方案，以满足对一种 体外 一种在生理上与人类具有相关性、可快速进行遗传操作、且易于获取而无需克服获取人肠道类器官所涉及障碍的模型。

采用第2节所述方案制备大鼠十二指肠和空肠类器官。在隐窝分离步骤中，必须高效地从PBS中去除绒毛组织。若将过多绒毛与隐窝一同接种至EME中，可能导致整个培养物死亡，无法成功建立类器官系。因此，建议在解剖显微镜下进行隐窝分离，以便直观确认绒毛的去除情况。图1展示了典型的绒毛片段与隐窝（图1A）。请注意隐窝尺寸明显小于绒毛（图1B）。接种后，隐窝将在接下来的数日内逐渐扩展为球形结构，并在第4至7天开始出芽并发生分化（图2）。当类器官发育至大量出芽阶段时，应进行传代。传代过程中，需充分解离类器官以使隐窝芽体彼此分离，从而实现类器官数量的扩增（图3B）。
类器官在冻存后的成功复苏在很大程度上取决于其冻存时的状态。处于高度增殖且未分化状态的类器官复苏效率最高。因此，我们建议诱导类器官保持球形和囊状结构，而非出芽状或分化状态。为实现这一目标，可通过增加培养基中Wnt配体R-spondin的含量，并在培养基中添加烟酰胺（nicotinamide）以过度激活Wnt信号通路，后者已被证明可在多种培养系统中促进类器官形成并支持细胞存活30,31。图3A展示了复苏后仅2天的健康类器官培养状态。在复苏过程中于培养基中添加BSA也有助于大鼠肠类器官培养物的存活，因为大鼠肠类器官已被证实比小鼠肠类器官更为脆弱。
尽管3D类器官培养常被优先选用，因其能够模拟部分正常肠道结构，但该方法使其他技术操作（包括活体成像、转染和慢病毒转导）在技术上更具挑战性。利用由3D类器官衍生的2D单层细胞培养32 (图4）可实现更高效率的质粒导入。尽管三维肠道类器官传统上对瞬时转染具有抗性，但使用基于脂质的转染方法可成功导入编码EGFP的质粒。步骤6.1中概述了使用PEI的最具成本效益的方法。图5），但电穿孔和市售转染试剂也获得了可比的结果（数据未显示）。未来的研究将聚焦于这些方法是否可用于将CRISPR载体导入单层细胞。
在转染后能够从二维单层细胞重新形成三维类器官非常重要，这样可使类器官作为具有隐窝三维结构特征的可传代细胞系进行维持。有趣的是，当将EME重新加至铺在EME上的二维单层细胞顶部时，这些细胞可迅速重新形成小的球状体；而I型胶原基质则不足以支持三维结构的重建（图6）。
尽管瞬时转染在许多研究中具有应用价值，但构建稳定细胞系往往更为有用，这需要将慢病毒导入细胞中。本研究通过改进已发表的方案，对大鼠肠道类器官进行慢病毒感染（图7）。该方案中的关键步骤是将类器官消化为小的细胞团或细胞簇。如果类器官未被有效解离而保持完整结构，慢病毒颗粒将无法进入细胞。感染后，类器官需要恢复并重新生长。本方案所述方法可在筛选前实现10%–48%（平均：19.4% ± 6.5%）的细胞摄取病毒颗粒。
类器官的整体染色可能因EME残留物去除不完全或抗体渗透不充分而变得困难。本文所述方案可实现类器官的可靠染色。若类器官距离盖玻片过远，在共聚焦显微镜下观察也可能存在困难。通过使用VALAP，可形成具有一定高度的凹室，使类器官不会被盖玻片压碎，同时仍能沉降到靠近盖玻片的位置，便于成像。图8展示了针对顶端阴离子通道——囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）以及标记F-肌动蛋白的鬼笔环肽的代表性染色结果。
最后，类器官在功能检测中具有应用价值。来自囊性纤维化患者的类器官已被用于筛选CFTR功能，因为使用cAMP激动剂佛司可林处理可诱导强烈的CFTR介导的液体分泌，导致类器官肿胀。29,33-37本研究的一个目标是鉴定并建立一种可平行使用的类器官模型 体内 临床前研究。因此，我们旨在确定大鼠肠道类器官是否会发生佛司可林诱导的肿胀。事实上，在佛司可林处理后30分钟内，大鼠类器官即出现肿胀，至120分钟时达到最大效应（图9).
<img alt="细胞显微图像（A）显示相互作用，（B）显示分离的生物体，并带有箭头。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：上皮细胞分离过程中的绒毛片段与隐窝。（A）在EDTA溶液中进行隐窝分离过程中绒毛片段的代表性图像。黄色箭头标记绒毛片段。红色箭头指示附着在绒毛片段上的隐窝。注意相对大小的差异。（B）单个隐窝（红色箭头）的高倍放大图像，以便观察其形态。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="类器官7天生长过程；显微镜图像、细胞分化、三维培养、生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：大鼠小肠类器官发育过程。 大鼠空肠隐窝在分离后立即接种于EME培养基中（A,B）。2天内，隐窝形成球状体（C,D）。至第5天，开始出现隐窝芽（E,F），到第7天进一步发育并生长（G）。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞培养显微镜图像显示类器官生长情况，比较解冻后2天与传代后的形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3解冻和传代后的类器官 (A大鼠空肠类器官在冻存后按照所述方案解冻。解冻后仅2天即可观察到球状体和出芽状类器官。B) 图中所示为同一种类的类器官细胞系 A 传代后立即按照上述方案进行操作。注意观察各结构之间的相对大小差异 A 和 B 以及隐窝样单结构域的存在 B比例尺： 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="EME和胶原蛋白I中的细胞生长过程；培养24小时、48小时和5天时的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：从3D类器官形成2D单层细胞。 （A-C）在EME上2D单层细胞的形成过程。（D-F）在胶原蛋白I上2D单层细胞的形成过程。至第5天，各条件下均达到约80%融合度。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞培养物中pLJM1-EGFP表达的荧光显微镜图像，发射分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：二维单层细胞的瞬时转染。 在EME上生长的二维单层细胞使用PEI瞬时转染pLJM1-EGFP质粒的代表性图像。(A) 明场，(B) 荧光（GFP），(C) 叠加图。红色虚线标记单层细胞边界。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="EME和胶原蛋白I中细胞结构的显微图像，突出显示组织形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：在EME上由二维单层细胞重构成三维类器官。（A）在EME上生长的二维单层细胞形成三维类器官。在将EME添加至单层细胞顶面后5天内，类器官高效形成。注意小的三维球状体周围存在大量死亡细胞。（B）在将胶原蛋白I添加至在胶原蛋白I上生长的二维单层细胞顶面后5天，单层结构仍持续存在。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞核GFP表达、共聚焦显微镜图像、细胞定位研究、绿色荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：3D类器官的慢病毒感染。 大鼠空肠类器官使用所述方案感染携带细胞核定位GFP的慢病毒颗粒。经过5天的恢复和生长后，类器官被固定并用DAPI复染。(A) DAPI：灰色；nuclearGFP：绿色。(B) nuclearGFP：绿色。红色虚线标记类器官边界。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示CFTR和鬼笔环肽对细胞结构染色的荧光显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：大鼠肠道类器官的全 mount 免疫荧光染色。 （A）CFTR，（B）鬼笔环肽，以及（C）大鼠空肠类器官的合并全 mount 免疫荧光图像。注意类器官中CFTR染色在顶膜的富集（A中为灰色，C中为品红色）。鬼笔环肽标记F-肌动蛋白，显著标记顶膜刷状缘（B中为灰色，C中为青色）。比例尺：25 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长的延时显微图像，持续120分钟；增殖动态分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65343/65343fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 9"> 
图9：大鼠肠道类器官在佛司可林刺激下发生膨胀。 添加cAMP激动剂佛司可林后，大鼠肠道类器官膨胀的代表性时间过程。0分钟时间点表示添加10 µM佛司可林之前的时刻。图像显示同一类器官在30分钟间隔下的变化。在添加佛司可林后120分钟观察到最大膨胀。红色虚线标出类器官边界。类器官腔中央的深色物质由死亡细胞组成。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/65343fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：AdDMEM+ 配方。用于配制标准 AdDMEM+ 培养基的成分，该培养基是本实验方法中所使用的基础培养基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table1_Re.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：大鼠肠道类器官培养基（rIOM）配方。 标准大鼠肠道类器官培养基的详细配方，包括重组蛋白的溶剂及储存条件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table2_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：溶液。本方案中使用的其他溶液的配方和配制方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table3_resub2_Re.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4. 大鼠肠道类器官用于二维单层培养的培养基（rIOM2D）。 经改良的类器官培养基配方，优化用于单层细胞的二维生长。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65343/Table4_resub2_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内 研究。

在利用类器官评估生理功能和细胞命运决定时，使用能够紧密模拟体内环境的模型至关重要。

本研究建立了一种在长期细胞培养中稳定性良好的大鼠肠道类器官模型。我们还首次成功实现了利用慢病毒感染和瞬时转染进行的遗传操作。该模型为在体内遗传工具有限的大鼠中研究肠道生物学提供了极佳的实验平台。大鼠肠道类器官此前难以进行长期培养。通过建立一种稳定且可进行遗传操作的大鼠类器官模型，我们为研究人员提供了更大的灵活性和选择空间，使其能够根据特定研究条件选用最合适的类器官模型。小鼠肠道类器官常被用于研究干细胞行为、细胞命运决定及生理学特性，但由于小鼠与人类生物学之间存在关键差异，其作为模型可能存在局限性。另一方面，人类肠道类器官的获取较为困难，且细胞培养条件复杂。本文所述的大鼠类器官模型在保持与人类生物学关键生理相关性的同时，相较于人类肠道类器官更易于获取和维护。建立并优化大鼠肠道类器官模型，可在一种易于操作且具有重要生理相关性的模型中，实现对肠道生物学的遗传操作、药物处理以及高通量研究。此外，这些大鼠类器官将有助于研究肠道疾病模型中物种特异性的生理特性、细胞命运决定以及表型变异。首先，将已处死的大鼠仰卧置于解剖台上。用无菌镊子夹起皮肤层，并在表面进行剪切，注意避免损伤内部器官。使用大型锋利的解剖剪，在腹部中央沿纵轴方向做一表层切口，然后从该切口向两侧分别做两个较短的横向切口。用镊子将皮肤剥离，暴露腹腔。切开腹膜，充分暴露腹腔内的内脏器官，以便易于接触肠道。使用剪刀和镊子找到胃，并在其远端约两到三厘米处识别出呈黄白色的十二指肠段。空肠近端位于屈氏韧带（十二指肠与空肠之间的解剖标志）远端约四到五厘米处。将分离的肠段放入一个10厘米的培养皿中。用10毫升冰冻的PBS冲洗目标肠段的肠系膜，直至清除管腔内容物。在纸巾上将肠段切成2厘米长的小段，然后沿纵轴切开每段肠组织，以暴露上皮层。使用玻璃载玻片刮取暴露的管腔表面，以去除绒毛。将肠段放入预冷的 EDTA 溶液中，置于冰上，并在 4°C 下以 10 RPM 的转速于试管旋转仪中旋转孵育 30 分钟。在解剖显微镜下，将管内液体倒入一个 10 厘米的培养皿中。加入额外的 5 毫升冰冻 PBS。用精细镊子夹住一段肠道，剧烈振荡以观察上皮组织释放到 PBS 中。最初，PBS 中主要含有绒毛。持续振荡肠道碎片。定期弃去含有绒毛的 PBS，并向肠道碎片中加入 10 毫升新鲜 PBS。继续振荡碎片，并重复 PBS 洗涤步骤，直至绒毛不再释放到 PBS 中，此时 PBS 主要含有隐窝。弃去剩余的肠组织碎片，将平皿中剩余的 PBS 进行肠道隐窝富集。在组织培养超净台中，收集含有隐窝的 PBS 溶液，并通过 70 微米细胞滤网过滤。将滤液在 250 × g 离心 5 分钟。然后去除上清液，并将沉淀重悬于五毫升 Advanced DMEM Plus 中。再次以 250 × g 离心五分钟，去除上清液，仅保留 50 微升培养基与沉淀在一起。将沉淀在剩余培养基中重悬，并加入到冰上的细胞外基质提取物（EME）分装液中。轻轻吹打使隐窝均匀悬浮于EME中，避免产生气泡。将50微升EME滴加到35毫米组织培养皿中，于37°C、5%二氧化碳条件下孵育20分钟。孵育后，加入2毫升含有10微摩尔Y27632和10微摩尔CHIR99021的大鼠肠道类器官培养基（RIOM）。接下来，传代大鼠肠道类器官时，吸去含有类器官的培养板中的培养基，并加入1毫升解离试剂，以使类器官从EME半球状结构中释放。将含有解离后类器官碎片的解离试剂转移至15毫升锥形管中。用两毫升 Advanced DMEM Plus 洗涤培养板，并将其加入含有破碎类器官的 15 毫升锥形管中。使用玻璃巴斯德吸管，轻柔吹打 15 至 20 次，以破碎类器官。在 350×g 离心 2 分钟，然后将管底 50 微升溶液加入 EME 中。混合溶液后，取50微升EME类器官加入35毫米组织培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20分钟。孵育结束后，加入2毫升RIOM培养基，其中分别含有10微摩尔的Y27632和CHIR99021。图中展示了绒毛片段和隐窝的代表性图像。隐窝的尺寸比绒毛小。接种的类器官在接下来的几天内逐渐扩展，并在第4至7天开始出芽并分化。解冻后培养两天，健康的类器官培养物中可见球状体和出芽状类器官。相同类器官系在包被后显示出单个类似隐窝结构的存在。使用EME包被培养板时，将EME用冷的Advanced DMEM Plus以1:20比例稀释。进行胶原包被时，将浓度为每毫升5毫克的胶原在Advanced DMEM Plus中稀释至100微克每毫升。用200微升稀释的EME或胶原蛋白包被培养板，确保完全覆盖孔表面，在37摄氏度孵育1至2小时。为形成单层细胞，从含有类器官的35毫米培养板中吸出培养基。加入1毫升PBS，用P1000枪头在孔中反复吹打约20次，以分散孔中的EME，使所有EME松动。将内容转移至一个15毫升的锥形管中。向培养板中加入1毫升PBS以收集额外的类器官，并将其转移至同一锥形管中。以350×g离心2分钟，弃去上清液，包括任何EME残留物。然后向类器官沉淀中加入1毫升胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下孵育2分钟。使用P1000枪头吹打10次，加入2毫升Advanced DMEM Plus以中和胰蛋白酶。在350 ×g离心5分钟，吸除上清液，再将沉淀重悬于4.8毫升RIOM 2D培养基中。去除 Advanced DMEM Plus 中各孔内多余的 EME 或胶原蛋白。然后向每个预先包被的孔中加入 200 微升 RIOM 2D 中的类器官和 10 微摩尔的 Y27632。4 至 16 小时后，收集培养基并在 1000G 离心 1 分钟。将上清液转移至新的15毫升锥形管中，并弃去沉淀。每次加入200微升离心后的RIOM 2D前，用300微升PBS洗涤每个孔。每两到三天更换一次RIOM 2D，同时暂停使用Y27632。当将EME重新加至细胞上层时，接种在EME上的2D单层细胞 readily 重新形成小球状结构。相比之下，仅使用胶原蛋白一型基质不足以重建三维结构。

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大鼠肠道类器官的产生和操作

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。...

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

我们详细描述了以下操作步骤：1）利用磁性纳米颗粒高效构建用于慢病毒或逆转录病毒转导的肠道类器官；2）对经基因工程改造的类器官制备冷冻切片。该方法为高效调控类器官中的基因表达以研究其下游效应提供了有力工具。...

利用磁性纳米颗粒转导病毒载体对原代小鼠肠道类器官进行遗传工程改造以用于冰冻切片

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。...

生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本文详细描述了人多能干细胞来源的小肠和结肠类器官的生成、维持及表征方法。这些方法旨在提高实验可重复性，扩大可扩展性，并减少类器官接种和传代所需的工作时间。...

人多能干细胞来源的肠道和结肠类器官的生成、维持与表征

本方案描述了一种利用极性反转的小肠类器官构建的“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎（NEC）”模型，该模型为顶膜外翻型，可直接接触顶膜表面。我们提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测与坏死性小肠结肠炎相关的上皮结构破坏，并介绍了一种评估在“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎”模型处理后顶膜外翻类器官存活率的方法。...

体外 顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

本文介绍了一种从标准基质包埋的类器官培养物中生成顶膜朝外的肠道类器官的实验方案。同时概述了将EdU掺入活跃增殖细胞中的步骤，以及对EdU阳性细胞进行半自动定量分析的方法。...

生成顶面朝外的肠道类器官及利用EdU标记评估类器官增殖速率

我们描述了一种简单的方法，用于从非洲爪蟾（Xenopus...

利用非洲爪蟾胚胎细胞生成黏液纤毛上皮类器官：培养、传代与高分辨率活体成像

了解大鼠肠道类器官的培养与基因操作方法。本研究建立了可长期培养的大鼠肠道类器官模型，支持慢病毒感染和瞬时转染等遗传操作技术，为肠道生物学研究提供了更接近人体生理的实验工具。

大鼠肠道类器官的生成与操作

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