成像ATG9A，一种多跨膜蛋白

在我们的实验室中，我们致力于研究参与ATG9A囊泡运输的脂质和蛋白质机制。ATG9A在自噬途径中对吞噬泡的形成和成熟至关重要。然而，我们最近开始研究ATG9A在细胞器稳态中的作用。

最大的挑战在于揭示蛋白质及蛋白质复合物功能的分子细节。目前，基于AlphaFold的蛋白质工程以及原位高分辨率冷冻电镜技术正在推动该领域取得最显著的进展。我实验室的工作已为阐明自噬体的形成机制提供了基础性的认识。

这些见解已得到先进分子细胞生物学技术的支持，例如本文所述的技术。我们描述了使用某些蛋白标签的局限性，以及ATG9A的行为如何因其标签位置（即N端或C端）的不同而发生变化。我们还提出了检测这些局限性的方法以及如何避免这些问题。

此外，我们还提供了一种可重复地定量分析ATG9A分散情况的工作流程。本文介绍了一套从免疫荧光和活细胞成像到图像采集与分析的完整流程，用于研究ATG9A在不同细胞区室间的分布情况。我们认为，图像分析流程的标准化对于细胞生物学家提高实验结果的可靠性和可重复性至关重要。

首先，将 HEK293A 细胞接种于置于 24 孔板中的玻璃盖玻片上，孔板内含高糖 DMEM 培养基，培养至细胞融合度达到 80%。次日，用 Earle's 平衡盐溶液对细胞饥饿处理 2 小时。处理后，吸去培养基，加入 500 微升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，室温孵育 20 分钟以固定细胞。

固定后，用 500 微升 PBS 替换甲醛溶液。接着，在室温下加入 500 微升含 50 毫摩尔氯化铵的 PBS 溶液，孵育 10 分钟，以淬灭游离醛基。随后，用 500 微升含 50 微克/毫升皂苷的 PBS 溶液替换氯化铵溶液，孵育 5 分钟，以透化细胞。

透化后，用500 µL PBS替换皂苷溶液，并重复PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，在室温下用500 µL封闭液孵育细胞30分钟。孵育结束后，用500 µL PBS替换封闭液。

接下来，使用镊子从孔中取出盖玻片，并用薄纸巾轻轻吸去多余的 PBS。在湿化盒中，将盖玻片细胞面朝下，轻轻放置于 50 微升一抗溶液液滴上。在室温下于湿化盒中孵育细胞 1 小时。

孵育后，收集盖玻片并吸去多余的初级抗体溶液。将盖玻片细胞面朝上放回24孔板中，用PBS洗涤3次。最后一次洗涤后，收集盖玻片并吸去多余的PBS。

将每个盖玻片细胞面向下放置于50微升二抗溶液液滴之前，先在湿化室中孵育一小时。孵育结束后，吸去多余的二抗溶液，并在24孔板中用500微升PBS洗涤盖玻片三次。吸去多余的PBS后，将每个盖玻片细胞面向下放置于湿化室中PBS稀释1:4,000的50微升Hooke's溶液液滴上。

在湿盒中孵育5分钟。接着，去除多余的Hooke's溶液，将盖玻片在24孔板中用PBS洗涤三次，再用去离子水洗涤一次。除去多余的去离子水后，将每张盖玻片置于载玻片上10至20微升封片液的液滴中，注意避免产生气泡。

进行ATG9A构建体的活细胞成像时，将HEK293A细胞接种于含2毫升高糖DMEM的60毫米组织培养皿中，培养至细胞融合度达到65%至70%。次日，制备脂质体转染DNA混合物，并将其加入含有4毫升生长培养基的细胞培养皿中，轻轻前后摇动培养皿以使混合物均匀分布。将细胞在37°C、10%二氧化碳条件下孵育。

转染4小时后，更换新鲜培养基，并在37摄氏度、10%二氧化碳条件下孵育细胞过夜。次日，通过加入胰蛋白酶EDTA消化细胞，计数悬浮细胞，然后将其重新接种至适合活细胞显微镜观察的培养皿中，孵育过夜。

第二天，使用共聚焦显微镜对细胞进行成像。在基础条件下，ATG9A 主要定位于高尔基网络，这由内源性蛋白的免疫荧光信号显示，并与 cis-高尔基标志物 GM130 共定位。C 末端带有 eGFP 标签的 ATG9A 和 C 末端带有 mRFP 标签的 ATG9A 在高尔基体上的定位较少，主要存在于囊泡中。

相比之下，C端带有eGFP标签的ATG9A更容易在细胞内形成聚集体。在N端荧光蛋白与ATG9A之间插入一段3xFLAG序列，有助于使过表达的蛋白行为更接近内源性蛋白。在营养充足条件下，过表达的mCherry3xFLAG-ATG9A与高尔基体标志物GM130共定位。

这种定位以及ATG9A囊泡区室在时间进程中得以保持，从而实现了对ATG9A转运过程的空间和时间动态研究。