体外利用双-3-氯哌啶对G-四链体DNA结构进行化学图谱分析

G-四链体是通常在富含鸟嘌呤的DNA序列中形成的核酸二级结构。B-CePs对G4的化学图谱分析旨在体外表征G4，并可鉴定出形成G-四联体的特定鸟嘌呤。在潜在的G-四链体形成序列中识别并实验验证G4的存在是一个具有重要生物学意义的问题，目前主要通过计算工具来解决。

为了支持这些预测并检测未预料到的G4结构，利用B-CePs进行化学图谱分析是一种可用于鉴定DNA序列中G4的便捷方法。B-CePs化学图谱分析是广泛使用的二甲基硫酸酯足迹法（dimethyl sulfate footprinting）在G-四链体表征方面的一种简便替代方案。B-CePs的主要优势在于减少了实验步骤，并降低了对DNA底物的初始用量需求。

本文以TBA序列为概念验证，描述了通过B-CePs进行化学图谱分析的方法。该方案可拓展至适用于其他潜在形成G-四链体序列的新实验，涵盖DNA和RNA结构。首先，将G4-TBA单链TBA和双链TBA溶液分别移取至三个不同的离心管中进行折叠。

将样品在 95 °C 下加热五分钟。让其缓慢冷却至室温。待离心管冷却至室温后，离心样品。

接下来，准备三组，每组七个无菌的 0.5 mL 离心管。向每个离心管中加入 3 µL 超纯水。将 5 µL 折叠后的核酸结构加入每组离心管中。

接下来，加入 2 L 的 25 或 250 M B-CeP 1，分别使探针终浓度达到 5 和 50 M。向三个对照管中加入超纯水代替化合物，并将所有样品在 37 °C 下孵育。将试管置于 20 °C 下以终止反应。然后在真空离心浓缩仪中干燥样品。首先制备聚合的 PAGE 凝胶三明治。

取下夹子和纸胶带层，缓慢取出梳子。用蒸馏水彻底冲洗加样孔。将凝胶夹心结构正确放入垂直电泳装置中。

用TBE缓冲液填充上下储液槽。以50瓦功率对凝胶电泳进行至少30分钟的预运行，以预热玻璃板。同时，将干燥的样品重悬于5 µL变性凝胶上样缓冲液中。

接下来，使用装有TBE缓冲液的小型注射器冲洗凝胶孔中的尿素。将样品加入洁净的孔中，注意上样时的气味。以50瓦功率电泳运行两小时，或直至溴酚蓝染料迁移至凝胶三分之二处。

电泳结束后，关闭电源，小心取出玻璃夹心装置，并清洗玻璃板。将凝胶置于凝胶成像仪中，检测FAM标记的寡核苷酸条带的荧光信号。在孵育1小时、4小时和15小时后，分别使用5或50 M的B-CeP 1与2 M的G4-TBA、单链TBA和双链TBA样品进行反应。

每组样本均设置了对照。TBA底物仅显示一个烷基化加合物，这是由于只有G8位点可发生烷基化并导致后续链断裂。在单链和双链TBA中观察到多个加合物及多条切割产物条带，因为所有鸟嘌呤均对B-CeP反应敏感。

探针反应和Tris缓冲液因存在不希望的亲核试剂，导致化学图谱效率低下，探针反应性降低。G4-TBA样品仅显示出加合物的形成，而无链断裂。对于单链和双链TBA，只有24小时的孵育才能产生与不含Tris条件下15小时相当的DNA片段化程度。