Name: 使用新型无泵流体系统维护和评估眼睛的各种组织和细胞类型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学习使用新型无泵多通道流体系统实时分析眼部组织的氧消耗和代谢副产物。该方法可稳定测量视网膜和RPE细胞的代谢反应，为研究视网膜疾病提供可靠数据。

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本研究由美国国立卫生研究院（R01 GM148741 I.R.S.）、U01 EY034591、R01 EY034364、BrightFocus基金会、防止失明研究基金会（J.R.C.）以及R01 EY006641、R01 EY017863和R21 EY032597（J.B.H.）提供的资助支持。

Pumpless Multi-Channel Flow Culture to Maintain and Assess Tissues and Cells

<ol><li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro%3A+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li>
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<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ATP%2FADP+in+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets.</a> Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).</li>
<li>Chertov, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+glucose+in+photoreceptor+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Roles of glucose in photoreceptor survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+Can+Shuttle+Reducing+Power+from+the+Hypoxic+Retina+to+the+O2-Rich+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium.</a> Cell Reports. 31 (5), 107606(2020).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+pyruvate+transport+by+zaprinast+causes+massive+accumulation+of+aspartate+at+the+expense+of+glutamate+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+metabolism+in+the+retinal+pigment+epithelium+uncouples+respiration+from+ATP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis.</a> Cell Reports. 39 (10), 110917(2022).</li>
<li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, e66716(2021).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStryer%2C+L+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).</li>
<li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245(2021).</li>
<li>Engel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dysfunction+in+Sorsby+patient-derived+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium.</a> Experimental Eye Research. 215, 108899(2022).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Mitochondrial+Respiration+Impairs+Nutrient+Consumption+and+Metabolite+Transport+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+Metabolism+and+Metabolism+in+the+Pigmented+Epithelium%3A+A+Busy+Intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+and+photoreceptor+survival+in+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 205, 108492(2021).</li>
<li>Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+consumption+by+mammalian+rod+photoreceptors+in+darkness+and+in+light%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light.</a> Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , 100846(2020).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+of+engineering+retinal+organoids+and+organoid-on-a-chip+in+modeling+intraocular+drug+delivery%3A+Current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842(2023).</li>
<li>Arjamaa, O., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-dependent+diseases+in+the+retina%3A+role+of+hypoxia-inducible+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors.</a> Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).</li>
<li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Multi-Channel+Fluidics+System+for+the+Maintenance+and+Real-Time+Metabolic+and+Functional+Assessment+of+Tissue+or+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods.+In+Press%22%5BJournal%5D)">A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells.</a> Cell Reports Methods. In Press. , (2023).</li>
<li>Neal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Low-Level+Drug+Effects+Using+Real-Time%2C+in+vitro+Measurement+of+Oxygen+Consumption+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate.</a> Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).</li>
<li>Jung, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cytochrome+C+is+an+essential+regulator+of+sustained+insulin+secretion+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).</li>
<li>Rountree, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+insulin+secretion+by+cytochrome+C+and+calcium+signaling+in+islets+with+impaired+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+mitochondrial+damage+in+retinal+cells+and+tissues+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+mitochondrial+DNA+damage+and+extracellular+flux+assay+for+mitochondrial+respiration+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).</li>
<li>Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+alterations+in+mitochondrial+reserve+capacity%3B+a+means+to+predict+subsequent+photoreceptor+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).</li>
<li>Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+acutely+inhibits+acetylcholine-+but+not+GLP-1-stimulated+insulin+secretion+in+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).</li>
</ol>

I.R.S.、M.G. 和 K.B. 与本研究中所述 BaroFuse 灌流系统的制造商/经销商 EnTox Sciences, Inc.（美国华盛顿州默瑟岛）存在财务关系。其他所有作者声明无利益冲突。

由于生物能量学在细胞功能的各个方面以及眼内多种组分的维持中具有重要作用，因此迫切需要研究其调控机制的方法。特别是神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）依赖于代谢过程，不仅用于能量生成，还参与细胞内和细胞间的信号传导14,15,16,17。由于眼部组织具有较高的氧化能力，在静态条件下难以良好维持其活性18,19，因此对眼部分离组分的研究需要能够同时维持并评估代谢过程的灌流系统。本研究开发的流体系统可用于获取多种组织类型的耗氧率（OCR）和乳酸生成率（LPR）数据，本文提供了经验证可获得最佳结果的详细实验方案。
使用流式系统生成可靠数据的主要决定因素包括在39 °C下对基于CO2的培养基/缓冲液进行预平衡（以确保灌流液不会因溶解气体过饱和而在实验过程中发生脱气）。特别是储存在4 °C的培养基或KRB缓冲液相对于37 °C处于过饱和状态，如果预平衡时间不足，则在实验过程中会发生脱气。此外，装入组织腔室的组织必须避免因撕裂或组织分离不完全等不当分离操作而受损，也应避免将组织暴露于少量碳酸氢盐缓冲液中并长时间接触大气空气。温度控制、流速稳定性以及O2检测的可靠性变异极小，这些因素对失败率的影响不显著。
该仪器具有八个并行运行的流路通道/组织腔室，由两个储液器提供灌注液，每个储液器供应四个组织腔室。为了获得最准确的耗氧率（OCR）时间进程曲线，需使用未装载组织的腔室对动力学曲线进行基线校正。因此，典型的实验方案通常包括两组，每组三个组织腔室。总体而言，实验方案可分为两类：一类是在两侧分别施加不同的测试化合物（例如，在MRM的一侧加入药物/溶剂对照，另一侧仅加入溶剂对照）；第二类是在MRM的两侧施加相同的测试化合物注射方案，但在MRM的两侧分别放置不同的组织或组织模型。本文中，通过比较暴露于寡霉素和FCCP的视网膜组织与未暴露于任何测试化合物的组织的OCR，同时在相同实验方案和条件下对两种组织进行平行评估，以识别组织特异性行为。本研究通过在同一实验中平行展示RPE-脉络膜-巩膜相对于视网膜具有更高的代谢速率动态范围，说明了后一种方案的应用。其他研究已报道了更广泛的实验设计，包括测量不同氧浓度（O2）对OCR和乳酸生成率（LPR）的影响，以及燃料、药物和毒素的浓度依赖性效应20,21。此外，尽管本研究仅将流出液组分的分析局限于乳酸测定及LPR计算，但如果对流出液中的多种化合物及其类别同时进行检测（如激素、神经递质、细胞信号分子以及可从细胞中释放的代谢物），则实验所获得的信息量将显著增加20,22,23。
分离的视网膜或RPE-脉络膜-巩膜复合体的装载操作简便，一旦分离，这些组织即可用镊子直接放入组织室的上部，并使其自然沉降至烧结滤板处。在滤膜插件上培养的RPE细胞，经过体外培养4–8周后，可形成适当的极性结构以及表达RPE成熟的相关标志物。若需维持RPE细胞的成熟状态和极性，则无法在RPE细胞贴附于Transwell膜后将其剥离用于活细胞分析24。灌流室可容纳用手术刀在缓冲液中切割下的Transwell膜条，并迅速插入组织室中。尽管已有将滤膜条置于静态系统中的操作报道24，但目前尚无其他流体动力学方法可用于评估这些重要的细胞类型。RPE细胞的反应速度较快且动态性更强，相较于视网膜或RPE-脉络膜-巩膜复合体，这可能部分归因于RPE细胞在膜插件上形成单层结构后，其顶面和基底面均可立即与灌流液接触。
确保数据具有最高信噪比的另一个因素是选择灌流室中组织加载量与流速之间的最佳比例。相对于流速而言，组织量过少会导致溶解氧的差异2 流入与流出之间的浓度差非常小，难以可靠测量。相比之下，如果流速过慢，则氧气浓度会2 变得过低，导致组织出现缺氧。然而，气体压力驱动的液体流动可在低至5 mL/min的流速下维持，仅需少量组织即可实现准确的OCR和LPR测量。在本实验中，每个通道使用约20 mL/min的流速，适用于单个视网膜、两个RPE-脉络膜-巩膜复合体或360,000个RPE细胞。为最大限度减少系统效应导致的组织暴露延迟和分散问题，提供了多种规格的组织腔室，以便将组织用量（及流速）与相应尺寸的腔室相匹配。
本文所示分析的数据以两种方式呈现：相对于速率的绝对量值，或相对于稳态或基线的相对分数变化。重点在于展示对测试化合物反应的测量方法。然而，该流体系统也非常适用于在离体灌流分析之前评估和比较组织处理（如基因修饰）的影响。若要检验某种处理与对照之间的差异，最可靠的方法是分析该处理对测试化合物标准化反应的影响。如果分析需要使用绝对量值，则在同一次离体灌流实验中同时进行预处理样本及其对照的评估，可使统计分析的效力达到最大化。
除了搅拌器之外，所有与液体接触的部件均由制造商作为耗材提供，并已进行灭菌处理。这些部件不应重复使用，因为实验偶尔会因清洗不彻底或表面污染而失败。系统在初始组装时处于无菌状态。然而，培养基是在非无菌条件下添加到MRM中的，组织也是在非无菌条件下装入腔室的。我们曾对使用无菌部件组装但实验过程本身在非无菌条件下进行的系统测量过耗氧率（OCR）。细菌积累至可检测到OCR水平大约需要14小时（未发表结果）。如果实验所用方案持续时间少于约10小时，则细菌的积累及其可能产生的影响可忽略不计。
许多研究者使用专门设计的仪器，在静态培养条件下测量单层细胞的耗氧率（OCR），这类方法通量相对较高25,26。相比之下，本文测试并描述的流体控制系统通过确保充足的氧气（O2）供应来维持组织活性，这对于组织样本中较大的扩散距离尤为关键。此外，该系统能够收集洗脱组分，从而可并行检测多个与OCR相关的参数，显著增强了研究这些参数之间相互关系的能力。最后，溶解气体浓度（如O2和CO2）可被精确控制，这延长了使用碳酸氢盐培养基和缓冲液的实验持续时间，使研究者能够系统研究O2的影响。需要指出的是，这两种方法的一个共同局限在于无法研究待测化合物的洗脱过程，而其他灌流系统具备这一功能4,27,28。在确定最佳分析方式时还需考虑另一个因素：流体控制系统相比静态系统需要消耗更多的培养基和待测化合物。然而，由于当前流体控制系统可采用极低流速运行，额外开销已降至最低。
总体而言，本文详细描述了使用新型流体/评估仪器进行实验的操作流程。利用视网膜及视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜-巩膜组织所获得的数据，重现了此前使用更为复杂且不易获取的系统所得到的结果。此外，本系统还被证实可用于维持并评估附着于Transwell膜上的RPE细胞，这是一种非常重要的细胞模型，但由于细胞脆弱，此前尚未能在流体系统中进行分析。该实验方案主要包括75分钟的准备时间，随后是90分钟的平衡期，再进行正式实验，因此适用于不具备微流控系统操作专长的实验室常规使用。尽管本研究重点在于测量组织对测试化合物的急性反应，但该系统也非常适合用于比较来自不同来源的组织，例如动物模型或经过基因改造、接受过测试处理/条件干预的细胞模型。此外，可对流出液组分开展的检测范围广泛，包括代谢物、细胞信号分子、分泌的激素/神经递质，以及利用质谱技术对各组分和组织本身进行的多组分分析。

灌流系统在生命科学领域有着悠久的历史。特别是对于胰岛分泌功能的研究，该系统已被用于表征胰岛素在促分泌剂刺激下的分泌动力学1。除了收集流出液用于后续激素和代谢物的测定外，研究中还整合了实时传感器，主要用于检测耗氧量2,3,4。目前，由于缺乏生理相关的方法来评估眼部各分离组分（包括视网膜、视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜-巩膜复合体以及培养的RPE细胞）的代谢调控与失调机制，导致人们对眼部疾病相关机制的深入研究受到限制。虽然原本为培养细胞设计的静态系统已被改造用于组织研究5，但组织需要持续灌流以实现充分的氧供。流动系统已成功实现了对视网膜及RPE-脉络膜-巩膜组织耗氧速率（OCR）的实时、准确且可重复的测量，并且组织可在超过8小时的时间内保持代谢稳定，从而支持包含多种测试化合物的高信息量实验方案4,6,7,8,9。然而，流体系统以往的操作通常依赖于定制设备以及掌握非标准化技术方法的技术人员，因此这类系统尚未在大多数实验室中成为标准方法。BaroFuse是一种新开发的流体系统，无需使用泵，而是利用气体压力驱动液体流经多个通道和组织腔室（图1）。每个通道均可持续监测OCR，流出液则通过基于微孔板的组分收集器进行收集，以便后续分析其成分。重要的是，该仪器的组织灌流腔室设计可兼容不同几何形状和尺寸的组织样本。
仪器的核心是流体系统，流体由一个密封的加压储液罐驱动，经过内径较小（ID）的管路（在流体回路中产生最主要的流动阻力），向上流入容纳组织的玻璃组织腔室。向培养基储液模块（MRM）供压由连接至混合气体气瓶（通常为21% O₂）的低压和高压调节器提供。2，5% CO₂2，平衡 N2），并通过顶部的灌流室模块（PCM）密封，该模块容纳组织室组件（TCA）。流速由阻力管的长度和内径以及低压调节阀的压力设定控制。连接至组织室顶部的流出管将液体导入废液容器（通过持续称重自动测定流速）或由组分收集器控制的96孔板的孔中。O2 检测系统测量O的寿命2-敏感染料涂布于组织下游每个玻璃组织腔的内侧。该信息随后用于持续计算耗氧率（OCR）。整个流体系统位于温度控制的封闭环境中，气体罐、组分收集器和计算机是该仪器的主要组成部分。图2A）。最后，运行仪器的软件用于控制其操作（包括注入测试的准备和时序）&#160;化合物、流速测量系统和组分收集器定时，以及OCR数据和其他补充测量数据的处理与绘图。
本文介绍了利用流体系统对眼组织的各个分离组分进行灌流并测定其耗氧率（OCR）和乳酸生成率（LPR）的实验方案。LPR 是反映糖酵解速率的参数，与 OCR 高度互补，二者共同代表了细胞内碳水化合物能量生成的两条主要途径10。由于组织制备及将其装入组织腔室的操作通过观看视频学习效果更佳，因此视频内容将有助于展示在系统设置和操作过程中一些难以仅通过文字描述清楚的关键步骤。
该实验方案的描述分为8个部分，分别对应实验的不同阶段（图2B）：1. 实验前准备；2. 灌流液的准备/平衡；3. 仪器安装；4. 组织平衡；5. 实验方案；6. 仪器拆卸；7. 数据处理；8. 流出液组分的检测。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;生物样本&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Envigo Harlan (印第安纳波利斯, IN)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920L9795</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270G</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>乳酸&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351L9795</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养与组织收获&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beuthanasia-D</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol, 390 mg/ml 戊巴比妥钠</td><td>Virbac</td><td>RXEUTHASOL</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>GIBCO</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液 (KRB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J67795L9795</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>#CB-40230</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ROCKi&amp;nbsp;</td><td>Selleck Chemicals</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>气体钢瓶：21% O₂ / 5% CO₂ / 氮气平衡</td><td>Praxair Distribution, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 滤膜&amp;nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;商用检测试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red 葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>A22189</td><td></td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Aerococcus viridans&lt;/em&gt; 的葡萄糖氧化酶</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>A22189L9795</td><td></td></tr><tr><td>乳酸氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9795</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaroFuse&amp;nbsp; 多通道灌流系统</td><td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td><td>型号 001-08</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 4 荧光计</td><td>BioTek (Winooski, VT)</td><td>S4MLFPTA</td><td></td></tr></tbody></table>

使用一种新型无泵流体系统维持和评估眼部多种组织和细胞类型

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

许多用于研究组织功能和细胞生物学的体外模型需要培养基流动，以提供充分的氧供和维持细胞功能与存活所需的最适条件。为此，我们开发了一种多通道灌流培养系统，可用于在培养过程中维持组织和细胞，并通过在线传感器和/或收集流出液组分，持续评估其功能与存活状态。该系统结合了八通道连续光学氧消耗率检测与内置的组分收集器，可同时测定代谢物生成速率和激素分泌水平。尽管该系统适用于维持和评估多种组织与细胞模型（包括胰岛、肌肉和下丘脑），但本文重点介绍其工作原理以及我们用于研究分离的小鼠视网膜、小鼠视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜-巩膜复合体和培养的人RPE细胞生物能量调控的实验准备与操作方案。系统设计上的创新，例如无泵驱动的液体流动，显著简化了多通道灌流系统的操作。视频和图像展示了如何组装仪器、为实验做准备，以及将不同类型的组织/细胞模型装入灌流腔室的过程。此外，文中还阐明并讨论了针对不同实验方案和组织类型的实验条件选择指南，包括设定合适的流速与组织比例，以获得稳定一致的培养条件，并准确测定物质消耗与生成速率。通过优化组织维持条件并实时监测多个参数，该系统可产生信息量丰富的数据集，对眼生理学研究以及治疗视力障碍的药物研发具有重要应用价值。

为了说明从眼组织分离组分所获得数据的分辨率，按照常用的实验方案（线粒体应激测试10），测量了三种组织（视网膜、RPE-脉络膜-巩膜以及RPE细胞）的耗氧率（OCR）和线粒体质子泄漏率（LPR）（图10、图11 和 图12）。每种组织的使用量见表1。数据通过为该流体系统开发的软件包进行处理和绘图。视网膜和RPE-脉络膜-巩膜组织的制备相对简单，每种组织类型的处理时间少于20分钟。在测试化合物注射期间，OCR保持稳定，表明组织状态健康且功能稳定，支持该方法的有效性（图10）。一旦针对每种组织类型完成方法验证，我们发现无需在每次实验中都设置不注射测试化合物的对照组。结果与采用更传统的灌流方法获得的数据一致6,8,13：寡霉素导致OCR降低，而FCCP引起OCR升高。LPR的变化趋势与OCR相反：寡霉素使LPR升高，随后FCCP处理导致LPR下降（但降幅较小）（图11）。为了比较每种依次加入的测试化合物效应的统计学显著性，进行了t检验（由仪器配套软件自动计算）。由于本文的目的是描述该方法的操作流程，实验重复次数并不总是足够多以达到统计学显著性。然而，通常情况下，当重复次数为3次或以上时，FCCP和寡霉素对OCR和LPR的影响均具有显著性。
RPE 细胞此前未通过流动系统进行过分析，但其反应与 RPE-脉络膜-巩膜组织相似（这与大部分氧消耗率（OCR）源于 RPE 细胞的观点一致；图 11）。这些示例性结果突显了该系统维持组织活力的能力，表现为对照通道中 OCR 的稳定性，以及寡霉素和 FCCP 所诱导的 OCR 变化具有超过 100:1 的高信噪比。此外，对外流组分的检测可用于关联组织对外部液体中多种化合物的摄取或生成速率，这些数据可与 OCR（本例中为 LPR）相互补充。仪器的这些特性使得能够准确量化不同类型组织在平行实验中反应特征的差异。RPE-脉络膜-巩膜组织和 RPE 细胞对寡霉素的敏感性始终高于视网膜（图 11 和 图 12），尽管对于 RPE-脉络膜-巩膜组织，FCCP 作用时间尚不足以达到稳态。使用 DMSO 作为溶剂时需考虑一点：在较高浓度下（0.2%），DMSO 对视网膜的 OCR 具有短暂影响（可能反映了 DMSO 对膜通透性的影响所导致的渗透压变化效应）。
基于KCN通过直接作用于细胞色素c氧化酶而完全抑制呼吸作用的假设，KCN处理结束时的耗氧率（OCR）被设定为0，所有OCR值均根据相对于KCN处理值的变化进行计算。耗氧过程可能独立于呼吸链和细胞色素c氧化酶而发生。然而，这种非呼吸链途径对总耗氧率的贡献通常不超过百分之几（数据未显示），并且组织暴露于KCN的时间足够长，可确保非电子传递链氧化酶的底物已被耗尽。
统计学分析 
单次实验结果如图中所示，包含多个取平均值的通道。数据以平均值 ± 标准误差（SE；计算公式为 SD/√n）的形式绘制成图。
<img alt="带氧传感器的灌流室示意图；组织检测的流速控制；温度设定为37°C。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1．流体/检测系统的示意图。 主要组件包括外壳、温度控制元件、流体系统和组织室系统、灌流液上方顶空区的气体压力调节、馏分收集器/流速监测以及O2检测器。缩写：MRM = 培养基储存模块，PCM = 灌流室模块，TCA = 组织室组件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="含氧气检测、组分收集器的流体系统示意图；分析实验步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2．（A）仪器主要组件的示意图。主要组件包括气瓶（压力调节器）、外壳、组分收集器和计算机。（B）实验流程图，显示主要步骤类别及完成各步骤所需时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于DNA分离与分析的凝胶电泳槽装置示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3。MRM的视图。图中显示了MRM，其中包含置于MRM插入件底部的MRM插入件（左侧）和搅拌子（右侧）（放置于MRM分隔器的每一侧）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="BaroFuse 外壳示意图；气体流动和化合物注入设置；光谱装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4．MRM 中的管路组件和吹扫管路组件。（A）测试化合物注入管路组件和吹扫管路组件连接至 MRM 上的端口。（B–C）测试化合物注入组件和吹扫管路组件（B）放置于外壳前端的凹槽内（C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="温度控制装置；数字显示屏显示 PV 32.2°C，SV 35.0°C；实验室设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5．启动 MRM 温度控制器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于DNA分离和分析结果的电泳装置，包含凝胶室和电极。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6．组织培养室与气体罐。 将O2检测器放置在检测器支架上（该支架同时也支撑MRM和PCM），并将固定带放置在PCM的散热片周围，以帮助将组织培养室固定到位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于压力控制的气体调压器装置；实验示意图中显示了双阀配置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7。 （A）气体钢瓶上的高压和低压调压器。（B-C）吹扫管。吹扫管可使MRM顶部空间中的空气排出，并充满供气钢瓶中的气体。图中显示了打开状态的吹扫管（B）和关闭状态的吹扫管（C）。在吹扫过程中，测试化合物注射组件始终保持关闭状态。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡示意图；带管路的色谱系统装置；表面积分布图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图8．组织腔室及流出装置。（A）Transwell膜被切割成三等宽条带后的尺寸。（B）多管流出支撑架。（C）流出多管支撑架放置于密闭腔体边缘，管路接头靠近组织腔室的位置。（D）连接至组织腔室的流出管路组件实物图。（E）移除盖子后的密闭腔体俯视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="注射器过滤过程示意图；蛋白质纯化实验室装置；色谱柱使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图9"> 
图9。在MRM中注入化合物。 使用5 mL注射器通过进样口将测试化合物注入MRM。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="LPR 和 OCR 随时间的变化；代谢通量分析；折线图；KRB、FCCP、KCN 处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 10"> 
图 10。测试化合物作用下的 OCR 和 LPR 曲线。 小鼠视网膜（每通道一个视网膜）在存在或不存在（对照）指定测试化合物条件下的 OCR 和 LPR 变化。每条曲线来自单次实验的 6 个重复样本的平均值（误差线表示标准误；p 值通过配对 t 检验比较每种测试试剂与前一种试剂稳态值计算得出）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="OCR 随时间变化；代谢检测图；浓度：KRB、Oligo、FCCP、KCN。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 11"> 
图 11．OCR 曲线。 小鼠分离的视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体（RPE-choroid-sclera）和视网膜（每通道 1 个视网膜或 2 个 RPE-choroid-sclera）在测试化合物作用下的平行测定 OCR 结果，测试化合物如图所示。数据来自单次实验的重复样本平均值（RPE-choroid-sclera 和视网膜的 n 值分别为 2 和 4；p 值通过配对 t 检验比较每种测试试剂与其前一试剂的稳态值计算得出）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="线粒体呼吸图；LPR、OCR 与时间关系；FCCP、KCN 作用；折线图，实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 12"> 
图 12. RPE 细胞的 OCR 和 LPR 曲线。 将附着于 transwell 膜上的 RPE 细胞剪成条状后装入灌流室中测得的 OCR 和 LPR 数据。数据来自单次实验的重复样本平均值（n = 3，每通道 1.5 个膜（每通道 360,000 个细胞）；p 值通过配对 t 检验比较每种测试试剂与其前一种试剂的稳态值计算得出）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组织/细胞</td>
			<td>数量/通道</td>
			<td>流速：mL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>视网膜（小鼠）</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE-脉络膜-巩膜（小鼠）</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell膜上的RPE细胞</td>
			<td>360,000个细胞（4 × 1/3滤膜条）</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 不同组织的推荐操作参数。
补充图1. 实验设计的图示。 接触待测化合物的时间和组成，以及组分收集的时间。浓度增量（Conc Inc）是指将要实施的浓度变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2. 启动时的用户界面。 用于监测插入PCM中组织腔室O2浓度的O2检测软件在启动时的用户界面窗口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3. 实验设置的用户界面。 用于输入实验信息（左侧）和选择流出组分收集时间（右侧）的用户界面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：注射页面的用户界面。 该注射页面可根据测试化合物的目标浓度以及多反应监测（MRM）中剩余的体积，自动计算注射体积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1：组织样本制备方法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

对活体组织进行实时分析可获得重要的功能性和机制性数据。本文介绍了利用一种新型无泵多通道流体系统维持并评估多种组织和细胞模型的实验方案及关键变量，以确保所获取数据的准确性和可重复性。

许多用于研究组织功能和细胞生物学的体外模型需要培养基流动，以提供充足的氧气供应和最佳的细胞……

用于测量氧气消耗的最常见设备不支持同时收集流出液组分。同时检测流出液以关联代谢与组织功能至关重要。能够同时测量这两项指标的技术可更全面地评估介导组织功能及疾病的细胞机制。测量活体组织耗氧量的关键挑战在于提供充足的氧气以维持组织的活性和功能。使用灌流系统是实现这一目标的最佳方法。采用气体压力而非标准的蠕动泵可大大简化操作流程，同时避免气泡的形成。代谢测量的有效性取决于其量化结果和结果可重复性的能力。本方案利用精确控制的流速，结合对流入和流出液中溶解氧的稳定寿命检测，可重复性地分辨出即使仅有百分之几的氧气消耗变化。介导视网膜功能的生化过程是眼内各种组织之间代谢相互作用的结果。我们的流动系统能够评估具有不同几何结构的多种组织类型，有助于研究每种细胞类型的独特内在特性及其协调功能。许多眼部疾病均由代谢通路和信号传导障碍引起。我们的研究重点是测量眼组织的氧气消耗以及代谢副产物的释放，以表征、理解并治疗视网膜疾病及退行性病变。在组装完培养基储液模块（MRM）后，建立新型无泵多通道流动培养系统时，需将管路组件插入MRM中，并将MRM放入加热器内。固定好加热器后，继续使用组织培养室组件（TCA）插入工具，将八个TCA依次插入灌流室模块（PCM）的孔中。使用工具用力按压适配器，直至每个腔室周围的管套顶端接触表面，环绕PCM中的孔洞。将部分组装好的PCM连同PCM支架和六颗螺丝一起放置一旁。在封闭装置组装完成30分钟后，且MRM达到所需温度时，使用50毫升移液管，将预平衡的灌注液沿着预热的MRM插入件内壁轻轻分散加入，以完成转移。将PCM放置到MRM上时，把从PCM底部引出的TCA电阻管插入MRM插孔中，MRM分隔板每侧插入四个。调整模块方向，使组织腔在定位后紧贴氧检测器。使用六颗螺丝和电动螺丝刀将PCM固定至支撑支架上。然后使用提供的弹性带将TCA固定在PCM支撑翅片上，将弹性带在橡胶垫圈水平位置绕过翅片并拉伸。将氧检测器放置在检测器支架上，确保其检测面紧贴PCM翅片。通过松开检测器支架侧面的螺丝并根据需要调整检测器的侧向导轨，使LED光电探测器对准组织腔室中的氧敏感染料。最后，将盖子盖在腔室上方。当培养基液面距离顶部约0.5英寸时，即可将组织装入腔室。使用尖头镊子，将收获的视网膜或视网膜色素上皮-脉络膜-巩膜复合体轻轻放入每个腔室中，注意避免折叠视网膜。同时，使用拭子擦拭，防止组织室液体滴落到氧传感器上。让组织下沉并沉降到FRET上。在使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化传代制备好的细胞后，将RPE细胞接种到孔径为0.4毫米的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）径迹蚀刻滤膜上。在实验当天，用镊子将膜切成三条等宽的条带，并装入组织室中。在注射测试化合物期间，视网膜的耗氧率（OCR）保持恒定，表明组织的健康状态和功能稳定，验证了该方法的有效性。结果与采用传统灌流方法获得的视网膜及视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜-巩膜数据一致：寡霉素处理导致OCR降低，而FCCP处理则使OCR升高。观察到的乳酸生成速率或LPR的变化与OCR的变化相反。使用该方法，此前未通过流式系统分析过的RPE细胞，其反应与RPE脉络膜巩膜相似。

maintaining-assessing-various-tissue-cell-types-eye-using-novel

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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体外 生理与病理血流模型及其在血管细胞重塑研究中的应用

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